血管活性腸肽調(diào)控CD4+CD25+Treg/Th17平衡對實驗性自身免疫性腦脊髓炎防治作用的影響

楊 元，袁正洲，呂志宇，張淑江，李曉紅，李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 四川 瀘州 646000)

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研究報告

血管活性腸肽調(diào)控CD4+CD25+Treg/Th17平衡對實驗性自身免疫性腦脊髓炎防治作用的影響

楊 元，袁正洲，呂志宇，張淑江，李曉紅，李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 四川 瀘州 646000)

目的探討血管活性腸肽(vocative intestinal peptide，VIP)調(diào)控CD4+CD25+Treg/Th17平衡對防治實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的影響。方法60只健康雌性wistar大鼠隨機分成正常對照組、EAE對照組、VIP低劑量防治組和VIP高劑量防治組。利用髓鞘堿性蛋白(MBP)+完全福氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)建立EAE模型。自造模當日起，每隔一日分別對VIP低、高劑量防治組大鼠腹腔注射VIP 4 nmol/kg(0.2 mL)、16 nmol/kg(0.8 mL)，正常對照組及EAE對照組注射0.8 mL生理鹽水，連續(xù)10 d。觀察大鼠發(fā)病情況；HE染色觀察腦組織基本病理改變；流式細胞儀檢測脾組織CD4+CD25+Treg、Th17細胞比例；ELISA法檢測腦組織中TGF-β1、IL-17A因子含量變化。結(jié)果與EAE對照組比較，VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病潛伏期延長、進展期縮短、發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分(NDS)降低；HE染色顯示正常對照組大鼠腦組織中未見炎細胞浸潤，VIP各劑量防治組大鼠腦組織中炎細胞浸潤程度較EAE組明顯下降；與EAE對照組比較，VIP各劑量組大鼠脾組織中CD4+CD25+Treg細胞亞群比例升高，Th17細胞亞群比例降低，且各組間存一定的量效關(guān)系；VIP各劑量組大鼠腦組織中TGF-β1含量較EAE組明顯升高，IL-17A含量較EAE組明顯降低，且各組間存在一定劑量依賴關(guān)系。結(jié)論VIP通過上調(diào)CD4+CD25+Treg細胞比例，促進TGF-β1因子分泌，同時下調(diào)Th17細胞比例，抑制IL-17A因子表達，從而減輕腦組織炎癥細胞的浸潤程度，發(fā)揮對EAE的防治作用。

血管活性腸肽；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；CD4+CD25+Treg/Th17；TGF-β1; IL-17A

多發(fā)性硬化(multiple Sclerosis, MS)作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的自身免疫性疾病，其病因尚不明確，各種致病因素通過破壞Th1/Th2細胞免疫平衡，最終導(dǎo)致CNS炎細胞浸潤、白質(zhì)脫髓鞘、軸突變性等病理改變[1]。隨著對其動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)研究深入，越來越多的證據(jù)表明Treg/Th17細胞免疫失調(diào)及其分泌的TGF-β1、IL-17A因子紊亂在該疾病發(fā)病過程中發(fā)揮著更為重要的作用[2-4]。血管活性腸肽(VIP)是一種非膽堿能非腎上腺能神經(jīng)遞質(zhì)，由28個氨基酸殘基組成，屬于胰高血糖素-胰泌素家族。VIP通過與其受體(PACAP-1,PACAP-2等)結(jié)合，誘導(dǎo)免疫細胞增殖、分化，調(diào)節(jié)Treg細胞介導(dǎo)的免疫耐受、抑制炎癥因子(IL-17A、NO等)的合成及分泌，發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用[5]。國內(nèi)外有將VIP運用在自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的治療報道[6-7]，但尚未闡明VIP在MS發(fā)病中對Treg/Th17細胞平衡的調(diào)控機制及對其分泌則細胞因子的具體作用，因此本實驗通過探討VIP對EAE大鼠腦組織TGF-β1、IL-17A含量影響、脾組織中Treg/Th17細胞比例變化、腦組織炎細胞浸潤程度的變化，為臨床應(yīng)用VIP治療MS提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗動物、藥物及器材

健康雌性wistar大鼠60只(200 ～ 250 g，6～8周齡)、健康豚鼠10只(250 ～ 300g)，均購買于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心動物【SCXK(川)2013-17】；動物使用許可證：SYXK(川)2013-181。血管活性腸肽(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；完全弗氏佐劑CFA(美國sigma公司產(chǎn)品)；PBS磷酸鹽緩沖液( PH:7.2-7.4) (上?？婆d試劑有限公司)；大鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)；FITC標記抗鼠CD25 (CD25-FITC)流式抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；APC標記抗鼠CD4 (CD4-APC)流式抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；APC標記抗鼠IL-17(IL-17-APC)流式抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；TGF-β1 ELISA、IL-17A ELISA免疫試劑盒(廣州雅怡生物科技有限公司 )，流式細胞儀 (美國Beckman Coulter公司)，數(shù)顯電熱恒溫水溫箱HH.W21.600S(上海躍進醫(yī)療器械廠)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫抗原的制備

斷頸處死10只豚鼠后，在無菌條件下迅速分離出脊髓，去脊膜，稱重后移入玻璃勻漿器，與等量的0℃生理鹽水混合后研磨成50%的全脊髓勻漿(WSCH)。將完全弗氏佐劑(CFA)與WSCH等體積混合，玻璃注射器抽打至油包水乳狀，以滴在水面不散即為合格抗原。

1.2.2 實驗動物分組、制模及藥物干預(yù)

將60只雌性Wistar大鼠隨機分為4組(15只/組)：正常對照組、EAE對照組、VIP低劑量防治組、VIP高劑量防治組。將免疫抗原注入EAE對照組、VIP低、高劑量防治組大鼠雙側(cè)后肢足掌皮下(0.2 mL/100g)進行主動免疫，正常對照組給予等量生理鹽水+CFA。自造模當日起，VIP低、高劑量防治組每隔一日分別腹腔注射VIP4 nmol/kg (0.2 mL)、16 nmol/kg(0.8 mL)，正常對照組及EAE對照組給予腹腔注射0.8 mL NS，連續(xù)10 d。

1.2.3 動態(tài)觀察實驗動物

自造模日起，每日早晨10時由同一觀察者采用Kono’s評分標準對大鼠進行神經(jīng)功能障礙評分(NDS)。在發(fā)病高峰期(將連續(xù)3 d評分無加重、四肢癱瘓或死亡作為大鼠發(fā)病高峰期)處死EAE對照組，VIP各劑量組大鼠。正常對照組未發(fā)病大鼠飼養(yǎng)8周后處死。處死各組大鼠后留取其腦組織、脾臟，分別進行HE染色、ELISA檢查、流式細胞檢查。

1.2.4 檢測腦組織中炎細胞浸潤情況

腦組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋后，取10 μm厚度連續(xù)矢狀位行石蠟切片，每間隔100 μm取片1張。經(jīng)烘干、脫蠟后行腦組織HE染色、觀察CNS中炎性細胞浸潤程度。

HE染色后對腦組織炎細胞浸潤進行評分：0分：無炎癥細胞浸潤；1分：炎癥細胞散在分布；2分：血管周圍聚集浸潤炎癥細胞；3分：炎細胞匯集為廣泛血管套，部分遷移至鄰近腦實質(zhì)內(nèi)。

1.2.5 檢測脾組織CD4+CD25+Treg、Th17細胞亞群比例

1.2.5.1 脾組織淋巴細胞懸液制備

(1) 在無菌條件下剖開Wistar大鼠腹腔、暴露脾臟，組織剪將其完整分離；

(2) 分離后的脾臟放入盛有5 mL PBS培養(yǎng)皿內(nèi)，洗滌3次后吸至已消毒的400目蹄網(wǎng)上，眼科剪迅速剪碎，在冰上用玻璃注射器內(nèi)芯輕輕研磨得到脾細胞懸液，經(jīng)蹄網(wǎng)過濾后置于另一無菌培養(yǎng)皿內(nèi)；

(3) 于一離心管內(nèi)滴入脾細胞懸液，將等體積的大鼠淋巴細胞分離液滴入另一離心管內(nèi)，用移液器將脾細胞懸液輕輕移入分離液的離心管，保持界面清楚；

(4) 在24℃條件下離心(3000 r/min，30 min)后，分為三層，中層云霧狀為淋巴細胞層，用移液器吸取出該層細胞；

(5) PBS液洗滌離心(1500 r/min，5 min)后淋巴細胞3次；

(6) 用含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸淋巴細胞，吹打混勻后移入培養(yǎng)瓶，使用臺盼藍染色計數(shù)，保證活淋巴細胞數(shù)超過95%。

1.2.5.2 CD4+CD25+Treg、Th17細胞亞群比例檢測

⑴將脾細胞懸液濃度調(diào)整為2×106/mL；(2)取出3支EP管：標本檢測管、標本檢測管、對照管，各管吸入脾淋巴細胞懸液1.5 mL；(3)從冰箱中將APC標記的抗鼠CD4流式抗體(CD4-APC)、FITC標記抗鼠CD25流式抗體(CD25-FITC)APC標記抗鼠IL-17流式抗體(IL-17-APC)取出恢復(fù)室溫；(4)于標本檢測管中加入1.5 uL CD4-APC、1.5 uL CD25-FITC；于標本檢測管中加入1.5 uL IL-17-APC；空白對照管內(nèi)加入等量細胞懸液，分別震蕩搖勻，閉光條件下置于4℃冰箱內(nèi)孵育20 min；(5)于每個EP管內(nèi)分別加入1 mL PBS溶液，離心(1500 r/min，8 min)后洗滌2次；(6)于每個EP管內(nèi)分別加入300 nL PBS溶液重懸，吹打混勻；(7)設(shè)定各通道間的熒光補償后，通過前向及側(cè)向散射光設(shè)定淋巴細胞群，在流式細胞儀上檢測CD4+CD25+Treg、Th17細胞亞群比例。

1.2.6 檢測腦組織勻漿中TGF-β1、IL-17A含量變化

采用雙抗體夾心(ABC-ELISA)法檢測腦組織勻漿中TGF-β1、IL-17A含量。

1.3 統(tǒng)計方法

計量資料結(jié)果以x±s 表示；多組計量資料均數(shù)比較，當方差齊時用單因素方差分析，方差不齊時采Kruskal-Wallis檢驗；兩兩比較采LSD檢驗。SPSSl7.0軟件包完成統(tǒng)計分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的發(fā)病情況

正常對照組大鼠未發(fā)病，EAE對照組、VIP各劑量組大鼠均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀：發(fā)病大鼠先后表現(xiàn)為食量下降，精神萎靡，后肢無力，尾部拖地。在免疫后第14～17天病情癥狀最為典型：大鼠出現(xiàn)雙側(cè)后肢無力拖地、行走畫圈、爬行困難、自傷后肢、精神極度衰弱、抽搐。但與EAE對照組比較，VIP低、高劑量組大鼠癥狀明顯緩解，表現(xiàn)為發(fā)病潛伏期時間延長、進展期時間縮短、發(fā)病高峰期NDS降低(表1)。

表1 EAE對照組、VIP各劑量組大鼠發(fā)病潛伏期、進展期及高峰期神經(jīng)功能障礙評分(NDS)的比較Tab.1 The contrast on the incubation period, progress and the peak incidence neurological dysfunction scores in EAE control group and VIP each dose treatment groups

表2 EAE對照組和VIP各劑量組HE染色病理評分Tab.2 The HE staining pathological scores in EAE control group and VIP each dose group

①為正常對照組大鼠腦組織；②為對EAE照組大鼠腦組織；③為VIP低劑量組大鼠腦組織；④VIP高劑量組大鼠腦組織。

2. 2 各組大鼠腦組織腦組織病理變化

正常對照組大鼠未發(fā)病，于飼養(yǎng)8周后處死，其腦組織中未見EAE基本病理改變；EAE對照組及VIP各劑量防治組大鼠于發(fā)病高峰期處死，其各組腦組織則出現(xiàn)了不同程度的炎細胞浸潤：炎性細胞浸潤在小血管周圍，部分區(qū)域呈“袖套”狀改變，腦白質(zhì)可見髓鞘脫失等病理改變(表2、圖1)。

2. 3 各組大鼠脾臟CD4+CD25+Treg、Th17細胞亞群比例

通過流式細胞術(shù)檢測各組大鼠脾臟CD4+CD25+Treg、Th17細胞亞群比例變化。由于四組數(shù)據(jù)方差齊，將各組脾臟CD4+CD25+Treg、Th17細胞比例采用單因素方差分析。見表3。

2.4 各組大鼠腦組織勻漿中TGF-β1、IL-17A含量變化

VIP各劑量組大鼠腦組織中TGF-β1含量較EAE組明顯升高，IL-17A含量較EAE組明顯降低，且各組間存在一定劑量依賴關(guān)系(表4)。

表3 各劑量組大鼠脾臟CD4+CD25+Treg、Th17細胞亞群比例Tab.3 The each group rats’ CD4+CD25+Treg、Th17 ratio in spleen(，%)

表4 各組大鼠腦組織勻漿中TGF-β1、IL-17A含量變化Tab.4 The content of TGF-β1、IL-17A in brain tissue of each group rats

3 討論

Treg細胞主要分為兩類[8]：天然形成型(nTregs)與誘導(dǎo)生成型(iTregs)。作為Tregs中最為重要的一群，抗原激活的CD4+CD25+Treg細胞進入機體之后以多種方式參與免疫耐受。①接觸抑制機制[9]：CD4+CD25+Treg細胞通過表達細胞毒性T細胞關(guān)聯(lián)蛋白CTLA-4、神經(jīng)氈蛋白(Nrp-l)、淋巴細胞活化基因3(LAG-3)等表面分子與效應(yīng)細胞結(jié)合，抑制其成熟、減少遞呈抗原、破壞細胞周期導(dǎo)致效應(yīng)細胞調(diào)亡；②分泌抑制性細胞因子[10]:CD4+CD25+Treg細胞分泌高水平TGF-β1、IL-10，可一定程度上抑制Th1細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。進一步研究[11]發(fā)現(xiàn)TGF-β1與受體(TGF-βR)結(jié)合后，通過磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子Smad3，從而誘導(dǎo)Foxp3基因表達。同時TGF-β1通過抑制巨噬細胞、NK細胞、T細胞等效應(yīng)細胞增生活化，抑制粘附分子等表達等，增強吞噬細胞活性和抗原提呈細胞的免疫抑制反應(yīng)，協(xié)同其他抗炎因子如IL-10發(fā)揮免疫抑制作用[12]。

Th17不同于Th1、Th2細胞，主要通過分泌一系列促炎因子IL-17A、IL-21、IL-17F等參與炎癥過程[13]。IL-17A作為一種具強促炎作用的炎癥細胞因子，通過作用于基因靶點產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白、炎癥趨化因子等物質(zhì)，上調(diào)MHC-II抗原、集落共刺激因子、及T細胞刺激因子、促使活化T細胞[14]。Peron,J.P等[15]在EAE小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，由Th17細胞高分泌的IL-17A、IL-22可破壞血腦屏障、激活CNS炎性細胞，導(dǎo)致CNS炎細胞浸潤及髓鞘脫失等改變。同時Th17細胞高表達顆粒酶B、與GX-C等趨化因子結(jié)合可殺死神經(jīng)元，加重CNS的炎癥損害，加速EAE的髓鞘脫失的發(fā)生發(fā)展[16]。

基于此，我們建立EAE模型，觀察VIP否能在該模型體內(nèi)通過調(diào)控CD4+CD25+Treg/Th17細胞平衡及其分泌的細胞因子(TGF-β1、IL-17A)水平，緩解EAE的病理改變及臨床表現(xiàn)。

既往研究發(fā)現(xiàn)[17]，VIP在體內(nèi)外可激活Treg細胞，影響其分化，促進分泌負調(diào)控細胞因子CTLA-4、IL-10和TGF-β1的作用，同時在細胞水平上增強Treg細胞的抑制效率，維持免疫耐受。在過繼轉(zhuǎn)移實驗中[18]，將分泌VIP的CD4+CD25+Treg細胞轉(zhuǎn)移給EAE小鼠，能顯著改善該疾病的發(fā)展進程。Yadav, M.等[19]研究表明在自身免疫炎癥反應(yīng)中，VIP可有效的抑制CD4+T細胞向Th17細胞分化，抑制IL-17A的分泌。Jimeno, R等[20]在進一步機制研究中表明VIP主要通過與受體(VPACP-1)結(jié)合后抑制蛋白激酶A的活性，增加cAMP的途徑，發(fā)揮對Th17細胞的抑制作用。

因此，在本實驗中，通過ELISA法檢測該兩類細胞分泌最具代表性的細胞因子(TGF-β1、IL-17A)，同時探討VIP在EAE疾病干預(yù)過程中對該細胞因子的影響。結(jié)果顯示：與EAE對照組比較，VIP各劑量組大鼠腦組織勻漿中TGF-β1含量均升高，且以高劑量組增高最明顯，表明VIP可通過誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細胞活化及分化，促進抗炎因子TGF-β1分泌，從而改善EAE疾病進程；同時與EAE對照組比較，VIP各劑量組大鼠腦組織勻漿中IL-17A含量明顯降低，且高劑量組效果最明顯，表明VIP在上調(diào)CD4+CD25+Treg細胞作用的同時可下調(diào)Th17細胞的功能，抑制炎癥因子IL-17A的產(chǎn)生，進一步阻斷EAE發(fā)病進程。

本實驗除了檢測VIP對大鼠腦組織內(nèi)免疫抑制因子TGF-β1、炎癥因子IL-17A的影響外，同時通過流式細胞儀技術(shù)檢測了各組大鼠脾臟組織中CD4+CD25+Treg、Th17細胞亞群比例，進一步觀察VIP對CD4+CD25+Treg/Th17平衡調(diào)控的影響。結(jié)果顯示：與EAE對照組比較，VIP各劑量組大鼠脾臟組織中CD4+CD25+Treg細胞比例明顯升高，Th17細胞比例降低，且VIP高劑量組變化最為明顯，差異具有顯著性。進一步表明：在EAE模型中，VIP可通過上調(diào)CD4+CD25+Treg比例、下調(diào)Th17比例，維持CD4+CD25+Treg/Th17細胞平衡，同時升高TGF-β1因子含量，降低IL-17A因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，維持中樞及外周免疫平衡，從而緩解EAE病理改變及臨床表現(xiàn)。

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The effect of vasoactive intestinal peptide (VIP) on the regulation of CD4+CD25+Treg/Th17 balance in the prevention and treatment of experimental autoimmune cerebrospinal meningitis (EAE)

YANG Yuan, YUAN Zheng-zhou, LV Zhi-yu, ZHANG Shu-jiang, LI Xiao-hong, LI Zuo-xiao

(The department of Neurology. Affiliated Hospital of Southwest medical university， Sichuan Luzhou, 646000,China)

Objective : To explore the effect of vasoactive intestinal peptide (VIP) on the regulation of CD4+CD25+Treg/Th17 balance in the prevention and treatment of experimental autoimmune cerebrospinal meningitis (EAE). Methods 60 healthy female Wistar rats were randomly divided into normal control group, EAE control group, VIP low-dose group and VIP high-dose group. Used of myelin basic protein (MBP) + completely adjuvant (CFA) to establish EAE model. Since building on , the low and high-dose VIP groups were with intraperitoneal injection of every other day respectively VIP 4 nmol/kg (0.2 mL), 16 nmol/kg (0.8 mL), normal control group and EAE group with 0.8 mL saline, 10 days in a row. Record the incubation period, progression and the peak of neurological dysfunction score (NDS) changes of rats; the pathological changes in brain at the morbidity peak of rats; the proportion of CD4+CD25+Treg/Th17 cells in spleen tissues with Flow cytometry; the cytokine levels of TGF-β1、IL-17A in brain tissue. Results the incubation period were extended, the progression and the peak nerve dysfunction score were shortened in VIP each dose group; In normal control group, there was no inflammatory cell infiltration in the brain tissue. The degree of infiltration of inflammatory cells in the VIP control groups were significantly lower than that in the EAE group；Compared with the EAE control group, the proportion of CD4+CD25+Treg cells in the spleen tissue of VIP each dose group increased, the proportion of Th17 cells decreased, and being a dose-response relationship；The cytokine levels of TGF-β1 in brain tissue were increased and the levels of IL-17A were reduced in VIP each dose group, being a dose-response relationship; Conclusion through up-regulating of CD4+CD25+Treg cells, promoting the secretion of TGF-β1 factor and cut ting the proportion of Th17 cells, inhibiting the expression of cytokines IL-17A, VIP reduced brain tissue inflammatory cell infiltration, and played a role in prevention and treatment of EAE.

Vasoactive intestinal peptide; Experimental autoimmune encephalomyelitis; CD4+CD25+Treg/Th17; TGF-β1; IL-17A

楊元，女，碩士，Email: lsh880801@163.com。

李作孝，男，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:lzx3235@sina.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0066-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.012

2016-07-28