阿莫西林顆粒中有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜分析方法的建立

鄭如程，田勝，程正，江躍，張德兵

阿莫西林（Amoxicillin）稱羥氨芐青霉素，其為白色或類白色的結(jié)晶性粉末，稍有特異的氣味和苦味，是第二代青霉素的主要品種，系廣譜半合成抗生素，具有廣譜抗菌作用，世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦本品作為首選的β-內(nèi)酰胺類口服抗生素，在口服抗生素中占有重要的位置［1］。本品臨床上應(yīng)用于革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等所致的感染性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病及泌尿系統(tǒng)疾?。?-5］。由于其高效、低毒，因此在臨床上應(yīng)用十分廣泛，但其不良反應(yīng)發(fā)生率居各類藥物之首。為了減少不良反應(yīng)的發(fā)生［6-7］，必須對其雜質(zhì)進(jìn)行控制。阿莫西林原料［8-9］、阿莫西林注射劑［10-11］、阿莫西林膠囊［12-14］中的雜質(zhì)研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，但對阿莫西林顆粒［15-16］中雜質(zhì)的研究相對較少。

經(jīng)檢索各國藥典，現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》（ChP）2015 年版和2020 年版中“阿莫西林顆?！睒?biāo)準(zhǔn)中未收錄“有關(guān)物質(zhì)”檢查項(xiàng)［17-18］，國外藥典中也未收載有阿莫西林顆粒劑，其相似劑型為“阿莫西林口服混懸劑”，但均未控制有關(guān)物質(zhì)，其中美國藥典USP41“阿莫西林口服混懸劑”征求意見稿［19］中控制了“有關(guān)物質(zhì)”檢查項(xiàng)，但正式稿及美國藥典USP42［20］中均未控制。

本研究于2021 年6 月至2022 年2 月，結(jié)合原料藥生產(chǎn)工藝，檢索各國藥典，阿莫西林目前已知的雜質(zhì)共有17 個(gè)（見表1）。其中雜質(zhì)H 與雜質(zhì)P 這兩種雜質(zhì)在原料合成工藝中不產(chǎn)生，阿莫西林顆粒制劑中將不再研究；雜質(zhì)N為工藝雜質(zhì)和副產(chǎn)物，是6-APA與雜質(zhì)D的縮合物，雜質(zhì)O為降解產(chǎn)物，是雜質(zhì)D 與阿莫西林的三聚合物，兩者在聚合物測定中可予以控制，故按照其他單個(gè)雜質(zhì)控制；對可以獲得對照品的雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、I、J、K、L、M、DHPM這13種雜質(zhì)在阿莫西林顆粒中進(jìn)行了研究，對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使阿莫西林顆粒中主成分與各雜質(zhì)可實(shí)現(xiàn)良好分離；并進(jìn)行相關(guān)的方法學(xué)驗(yàn)證。

表1 阿莫西林各雜質(zhì)匯總一覽表

1 儀器與試藥

SQP QUINTIX 224-1CN 電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)），S210 型pH 計(jì)（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)），LC-20A 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，日本島津公司）。

阿莫西林顆粒（A公司：批號S200301，S200302，S 200303；L 公司：批號1903A0，9420），阿莫西林對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號130409-201512，含量86.9%），阿莫西林工作對照品（A 制藥公司，批號190121034，含量87.1%），阿莫西林系統(tǒng)適用性對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號130608-201804），雜質(zhì)A（中國食品藥品檢定研究院，批號130595-201001，含量100%），雜質(zhì)B（USP對照品，批號R081J0，含量100%），雜質(zhì)C（USP 對照品，批號R072H0，含量100%），雜質(zhì)D（USP 對照品，批號R051S0，含量100%），雜質(zhì)E（美國CATO 公司，批號C4X-11486-1708，含量95.6%），雜質(zhì)F（USP 對照品，批號R074A0，含量100%），雜質(zhì)G（USP 對照品，批號R019S0，含量100%），雜質(zhì)I（中國食品藥品檢定研究院，批號130435-201903，含量99.9%），雜質(zhì)J（美國CATO 公司，批號161-12-6，含量90.1%），雜質(zhì)K（美國CATO 公司，批號C4X-114816-1812，含量97.7%），雜質(zhì)L（加拿大TRC 公司，批號2-JPD-178-1，含量95%），雜質(zhì)M（加拿大TRC 公司，批號4-JPD-26-1，含量90.0%），D-HPM（美國CATO 公司，批號166-12-23，含量98.7%）。

乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水由Milli-Q系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C8 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；鬼峰捕集小柱：Welch Ghost-Buster Column（4.6 mm×50 mm，5 μm）；流動相A 為6.8 g/L 磷酸二氫鉀溶液（用20% 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至5.5±0.1）；流動相B 為6.8 g/L 磷酸二氫鉀溶液（用20 %氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至4.5±0.05）-乙腈（84∶16）；按表2 進(jìn)行梯度洗脫程序；檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；流速2.0 mL/min；低溫進(jìn)樣器溫度4 ℃；進(jìn)樣量20 μL；溶劑為流動相A。

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制供試品溶液：取A 公司阿莫西林顆粒適量，精密稱定，冷水中用流動相A溶解并定量稀釋制成每1 毫升中約含阿莫西林1.5 mg 的溶液，濾過，取續(xù)濾液即得。

對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置100mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

空白輔料溶液：按處方比例取空白輔料，同供試品溶液配制方法制備，即得。

阿莫西林對照品貯備溶液：精密稱取阿莫西林工作對照品，加溶劑溶解并定量稀釋制成濃度約為0.5 g/L的貯備溶液。

雜質(zhì)貯備溶液：精密稱取各有關(guān)雜質(zhì)對照品，加溶劑溶解并定量稀釋制成各雜質(zhì)對照品濃度約為0.3 g/L的雜質(zhì)貯備溶液。

雜質(zhì)單標(biāo)溶液：各精密量取上述各雜質(zhì)貯備溶液（雜質(zhì)D、E、J 貯備溶液為1.0 mL，其余均為0.5 mL），分別用溶劑定容至20 mL，作為雜質(zhì)單標(biāo)溶液。

阿莫西林+雜質(zhì)混合對照溶液：取阿莫西林顆粒約240 mg，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加溶劑適量，冷水超聲15 min，精密加入各雜質(zhì)貯備溶液（加入雜質(zhì)D、E、J 貯備溶液為1.0 mL，其余均為0.5 mL），用溶劑定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)取阿莫西林系統(tǒng)適用性對照品適量，加流動相A溶解并稀釋制成每l毫升中約含1.5 mg 的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 阿莫西林系統(tǒng)適用性溶液1色譜圖

取阿莫西林對照品與雜質(zhì)E 對照品適量，加流動相A 溶解并稀釋制成每1 毫升中約含阿莫西林1.5 mg、雜質(zhì)E約0.03 mg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液2，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。由試驗(yàn)結(jié)果可知，阿莫西林主峰與各有關(guān)物質(zhì)峰分離度良好，且雜質(zhì)峰不干擾主峰與各有關(guān)物質(zhì)峰定位。

圖2 阿莫西林系統(tǒng)適用性溶液2色譜圖

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1輔料干擾試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和空白輔料溶液分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖3，4。

圖3 阿莫西林供試品溶液圖譜

圖4 阿莫西林顆?？瞻纵o料溶液圖譜

由試驗(yàn)結(jié)果可知：主峰與相鄰雜質(zhì)及各雜質(zhì)間均達(dá)到基線分離，各雜質(zhì)分離度符合要求；空白輔料出峰，但不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測定。

2.4.2雜質(zhì)定位 取“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)單標(biāo)溶液和阿莫西林+雜質(zhì)混合對照溶液，分別注入液相色譜儀，色譜圖結(jié)果顯示，各雜質(zhì)間分離良好且峰行較好。結(jié)果詳見表3，圖5。

圖5 阿莫西林+雜質(zhì)混合對照溶液色譜圖

表3 雜質(zhì)定位專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3強(qiáng)制降解試驗(yàn) 取供試品及供試品溶液，分別進(jìn)行酸、堿、氧化、高溫、光照、紫外破壞（強(qiáng)制降解條件見表4），取上述各破壞溶液及未破壞的樣品溶液，除梯度洗脫時(shí)間延長為保證雜質(zhì)峰出峰完全外，其余均按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖6~10。由試驗(yàn)結(jié)果及色譜圖可知：酸破壞的主要降解雜質(zhì)為雜質(zhì)D2；堿破壞的主要降解雜質(zhì)為雜質(zhì)D2與雜質(zhì)C；氧化破壞的主要降解雜質(zhì)為雜質(zhì)D2與雜質(zhì)B；高溫液體破壞的主要降解雜質(zhì)為雜質(zhì)C；紫外液體破壞的主要降解雜質(zhì)為雜質(zhì)D1與雜質(zhì)C；其余降解試驗(yàn)樣品狀態(tài)比較穩(wěn)定，未降解出較大雜質(zhì)；各個(gè)強(qiáng)制降解條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰均能有效分離；各強(qiáng)制降解試驗(yàn)中所得色譜圖中主峰純度均為1.00，符合驗(yàn)證要求。

圖6 阿莫西林供試品溶液酸破壞試驗(yàn)圖譜

圖7 阿莫西林供試品溶液堿破壞試驗(yàn)圖譜

圖8 阿莫西林供試品溶液氧化破壞試驗(yàn)圖譜

圖9 阿莫西林供試品溶液高溫液體破壞試驗(yàn)圖譜

圖10 阿莫西林供試品溶液紫外液體破壞試驗(yàn)圖譜

表4 阿莫西林供試品溶液強(qiáng)制降解試驗(yàn)條件

2.5 檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、線性關(guān)系和校正因子測定取“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備溶液及阿莫西林對照品貯備溶液，逐步稀釋，配制成各雜質(zhì)單標(biāo)溶液濃度20%、60%、100%、140%、200%的線性溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積（A）對濃度（C：μg/mL）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算LOD、LOQ和校正因子，結(jié)果見表5。

表5 阿莫西林及各雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、LOD、LOQ與校正因子

2.6 精密度測定取“2.5”項(xiàng)下100%濃度的線性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 針，計(jì)算主峰面積和保留時(shí)間的RSD 值。阿莫西林和各雜質(zhì)的峰面積RSD 值均小于2.0 %，保留時(shí)間的RSD 值均小于1.0%，表明方法的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)貯備標(biāo)溶液及阿莫西林對照品貯備溶液，配制成對照品穩(wěn)定性試驗(yàn)溶液，于低溫（4 ℃）放置12 h，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 和12 h 時(shí)，取樣檢測，考察峰面積的RSD 值。結(jié)果顯示，在12 h 內(nèi)，阿莫西林主峰峰面積RSD 為0.5%，雜質(zhì)A 和雜質(zhì)C 峰面積RSD 最小，均為0.4%，雜質(zhì)B 峰面積RSD 最大，為2.0%。各雜質(zhì)低溫4 ℃放置12 h 下，峰面積的RSD 均未超過2.0%，說明于低溫4 ℃條件下放置12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

取“2.2”項(xiàng)下空白輔料溶液和供試品溶液，于低溫（4 ℃）放置8 h，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h和8 h 時(shí)，取樣檢測。結(jié)果顯示，供試品溶液于低溫4 ℃下放置4 h，雜質(zhì)D 變化量為0.024%，雜質(zhì)J變化量為0.004%，其他最大單個(gè)雜質(zhì)的變化量為0.006%，總雜質(zhì)的變化量為0.022%，說明供試品溶液于低溫4 ℃下放置4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性和中間精密度試驗(yàn)取同一批阿莫西林顆粒樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，取樣檢測，計(jì)算各雜質(zhì)的變化量。結(jié)果顯示，6次測定結(jié)果中，雜質(zhì)D 變化量為0.050%，雜質(zhì)J變化量為0.011%，其余各雜質(zhì)的變化量小于0.05%，總雜質(zhì)變化量為0.056%，小于0.1%。

2.9 回收率試驗(yàn)取同一批阿莫西林顆粒，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別加入各雜質(zhì)單標(biāo)溶液濃度50%、80%、100%、120%的雜質(zhì)貯備溶液，每個(gè)含量平行配制三份，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。各濃度下，雜質(zhì)D平均回收率均在90%～110%，雜質(zhì)J和雜質(zhì)E平均回收率均在92%～105%，其余各雜質(zhì)平均回收率均在90%～108%。試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 阿莫西林供試品回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 耐用性試驗(yàn)在其他條件不變的情況下，分別微調(diào)檢測波長（±5 nm）、鹽溶液pH（流動相A：pH±0.2，流動相B：pH（±0.05）、柱溫（±5 ℃）、流速（±0.2 mL/min）及更換同型號同規(guī)格不同品牌色譜柱，測定本品有關(guān)物質(zhì)，以分離度和各雜質(zhì)的變化量考察方法的耐用性。在各耐用性色譜條件下，雜質(zhì)混合溶液中各雜質(zhì)均能達(dá)到基線分離且主峰與相鄰峰的分離度均符合要求；供試品中單個(gè)雜質(zhì)變化量均小于0.1 %；總雜質(zhì)變化量均小于0.2 %；說明本法耐用性良好。

2.11 樣品測定取3 批次A 公司生產(chǎn)的阿莫西林顆粒，同時(shí)取2 批次L 公司生產(chǎn)的阿莫西林顆粒作為參比制劑，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，分別按自身對照法和外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)含量，試驗(yàn)結(jié)果見表7，8。

表7 阿莫西林樣品測定結(jié)果（主成分自身對照加校正因子法）/%

表8 阿莫西林樣品測定結(jié)果（雜質(zhì)對照品外標(biāo)法）/%

由表7，8 的結(jié)果可知，分別采用主成分自身對照法加校正因子法和雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計(jì)算，樣品中的已知雜質(zhì)、其他最大單個(gè)雜質(zhì)及總雜質(zhì)量均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，校正因子法結(jié)果可靠。

2.12 檢測波長、流速的選擇取同一批阿莫西林顆粒，參照USP41“阿莫西林口服混懸劑”征求意見稿中有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件，分別對210 nm、230 nm、254 nm 三個(gè)波長進(jìn)行了考察，結(jié)果見表9。

表9 阿莫西林顆粒不同檢測波長試驗(yàn)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，在2.0 mL/min 流速下，230 nm 波長雜質(zhì)的檢出個(gè)數(shù)及雜質(zhì)量均比210 nm 和254 nm 波長要多，各雜質(zhì)間分離度良好，符合要求，耐用性試驗(yàn)中也對流速也進(jìn)行了考察，故檢測波長選擇230 nm、流速選擇2.0 mL/min 較為合理，且與USP41“阿莫西林口服混懸劑”征求意見稿檢測波長一致。

3 討論

3.1 校正因子的確定由“2.5”項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可知，雜質(zhì)A、B、D、G、J、K、L、M 的校正因子大于1.1，計(jì)算時(shí)需加校正因子；雜質(zhì)F、雜質(zhì)I、D-對羥基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽的校正因子小于0.9，計(jì)算時(shí)采用不加校正因子，相當(dāng)于嚴(yán)控；其中雜質(zhì)A、B、G 為原料引入的工藝雜質(zhì)且樣品中未檢出，雜質(zhì)K、L 在強(qiáng)制降解試驗(yàn)中只在液體破壞下產(chǎn)生，未產(chǎn)生雜質(zhì)M，且本品為固體，故在測定時(shí)不再單獨(dú)控制這6個(gè)雜質(zhì)，也不再加校正因子，按照其他單個(gè)雜質(zhì)控制。

因雜質(zhì)D、E、J 為本品的主要降解雜質(zhì)，故在計(jì)算雜質(zhì)含量時(shí)，需乘以相應(yīng)的校正因子。其中，雜質(zhì)D1校正因子為1.4、雜質(zhì)D2校正因子為1.4、雜質(zhì)E1校正因子為1.1、雜質(zhì)E2校正因子為1.1、雜質(zhì)J 校正因子為1.2。其他已知雜質(zhì)均按照其他單個(gè)雜質(zhì)控制，并不再乘以校正因子。

3.2 系統(tǒng)適用性溶液的確定本法中所用阿莫西林系統(tǒng)適用性對照品購自中國食品藥品檢定研究院，未對具體成分及純度作出說明，提供的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中除標(biāo)注了阿莫西林色譜峰外，僅標(biāo)注了阿莫西林雜質(zhì)C、D、J色譜峰。考慮到雜質(zhì)D、E、J為本品的主要降解雜質(zhì)，故在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，使用阿莫西林系統(tǒng)適用性對照品配制系統(tǒng)適用性溶液1，使用阿莫西林對照品和雜質(zhì)E對照品配制系統(tǒng)適用性溶液2，分別進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

3.3 雜質(zhì)控制限度的確定現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》（ChP）2015年版和2020年版中“阿莫西林顆?！睒?biāo)準(zhǔn)中未收錄“有關(guān)物質(zhì)”檢查項(xiàng)，僅在原料藥中對雜質(zhì)的限度進(jìn)行了規(guī)定。根據(jù)現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》（ChP）附錄［21］中有關(guān)的指導(dǎo)原則和國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）Q3B（R2）中對雜質(zhì)限度的規(guī)定，同時(shí)結(jié)合本品的穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，可將本品有關(guān)物質(zhì)限度定為：雜質(zhì)D（D1+D2）≤2.0 %；雜質(zhì)E（E1+ E2）≤2.0 %；雜質(zhì)J≤1.0 %；其他單個(gè)雜質(zhì)≤0.5 %；總雜質(zhì)≤5.0 %；小于0.01 %的單個(gè)雜質(zhì)忽略不計(jì)。

4 結(jié)論

阿莫西林顆粒目前僅被中國藥典收錄，國外藥典中的相似劑型為阿莫西林口服混懸劑，被BP、USP 收錄；A 公司的阿莫西林顆?，F(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國藥典》（ChP）2020年版二部“阿莫西林顆?！?。本研究在各國藥典的基礎(chǔ)上，同時(shí)按照《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程技術(shù)指導(dǎo)原則》《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》以及現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》（ChP）附錄中有關(guān)的指導(dǎo)原則，結(jié)合本品的制劑特性，對現(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了優(yōu)化提高，提出了有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，為阿莫西林顆粒中雜質(zhì)譜分析和藥品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供了重要依據(jù)。