海馬可溶性因子體外誘導(dǎo)分化大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞為膠質(zhì)樣細(xì)胞

李 鵬 陳凡帆 謝 偉 張 昊 鐘文軍 涂蘭波 曹志愷 全 偉

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州 510180）

·論著·

海馬可溶性因子體外誘導(dǎo)分化大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞為膠質(zhì)樣細(xì)胞

李 鵬 陳凡帆 謝 偉 張 昊 鐘文軍 涂蘭波 曹志愷 全 偉

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州 510180）

目的 探索內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在大鼠海馬可溶性因子中的體外發(fā)育歸宿及分化鑒定。方法 顯微鏡下分離Wistar大鼠海馬組織放置于低溫DMEM/12培養(yǎng)基，低溫振蕩2小時(shí)后高速離心（15000 g），獲取實(shí)驗(yàn)所用海馬組織可溶性因子。取材出生1天的Wistar乳鼠海馬中的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（endogenous neural stem cells，ENSCs），將ENSCs分別于含海馬可溶性因子終濃度為0（對(duì)照組）、50、100、200、400μl/mL的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天并每日觀察，使用免疫細(xì)胞化學(xué)、Western Blot印記技術(shù)比較各組ENSCs中Nestin、CD133的表達(dá)量；同時(shí)計(jì)量并比較各組ENSCs成球個(gè)數(shù)，以探索在模擬顱內(nèi)微環(huán)境情況下，ENSCs發(fā)育、歸宿及分化。進(jìn)一步于最適宜的海馬可溶性因子終濃度中分化神經(jīng)球，對(duì)分化的細(xì)胞行神經(jīng)元特異性蛋白入（如：β-tubullin III、MAP2）及膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白（如：GFAP、S100及p75 NGFR）免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 大鼠ENSCs在培養(yǎng)基中呈單細(xì)胞漂浮生長(zhǎng)，球形；ENSCs于海馬可溶性因子各實(shí)驗(yàn)分組中培養(yǎng)第2天呈細(xì)胞球狀態(tài)，對(duì)照組中無(wú)細(xì)胞球形成（與100μl/mL組比較，P1=0.00），100μl/mL組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.00＜0.05）；至第6天，在100μl/mL組中的細(xì)胞球數(shù)量明顯多于其余各組（P1’=P2’=P3’=P4’=0.00）。在免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)中，100μl/mL組中細(xì)胞球表達(dá)干細(xì)胞高親和蛋白Nestin、CD133陽(yáng)性，Western Blot免疫印跡檢測(cè)其中Nestin、CD133蛋白高于對(duì)照組。進(jìn)一步分化試驗(yàn)中，細(xì)胞球呈貼壁生長(zhǎng)的單細(xì)胞狀態(tài)、有突起伸出、長(zhǎng)梭形，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)分化的細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP、S100、p75NGFR陽(yáng)性，但不表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白β-tubullin III與MAP2。結(jié)論 大鼠ENSCs在終濃度為100μl/mL的HSF作用下，可促進(jìn)ENSCs的增殖分裂；ENSCs在同樣濃度下的HSF中可進(jìn)一步分化為表達(dá)GFAP、S100、p75NGFR陽(yáng)性的膠質(zhì)樣細(xì)胞；100μl/mL的HSFS是ENSCs的一種生理性誘導(dǎo)劑或參與促進(jìn)ENSCs增殖、分化及通過(guò)細(xì)胞替代或因子分泌等機(jī)制修復(fù)神經(jīng)損傷。

海馬 可溶性因子 微環(huán)境 干細(xì)胞 膠質(zhì)樣細(xì)胞

內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（endogenous neural stem cells，ENSCs）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中保留的具有自我更新、多向分化潛能的原始細(xì)胞，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等［1］。因其免疫原性低、無(wú)致瘤性等生物學(xué)特性，給中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療點(diǎn)燃了無(wú)限希望。處于干細(xì)胞巢（stem cells niche）中的ENSCs在顱內(nèi)微環(huán)境（intrcranial microenviroment）的調(diào)節(jié)，在顱內(nèi)微環(huán)境中的增殖、分化及遷移等細(xì)胞行為學(xué)特點(diǎn)一直是神經(jīng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)［2］。本研究分離大鼠腦組織海馬結(jié)構(gòu)，通過(guò)低溫振蕩、高速離心、滅菌等方法提取海馬可溶性因子（hippocampus soluble factors，HSF）。將ENSCs接種于含HSF不同終濃度的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基中，觀察在不同濃度的HSF中，ENSCs的形態(tài)學(xué)發(fā)育，并使用免疫細(xì)胞化學(xué)、western blot免疫印跡技術(shù)對(duì)發(fā)育的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為模擬顱內(nèi)微環(huán)境探索ENSCs于宿主中的發(fā)育歸宿提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物均購(gòu)買(mǎi)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分別為:體重250 g的Wistar大鼠；出生3天以?xún)?nèi)的Wistar乳鼠（動(dòng)物合格證號(hào):NO.44002100005375）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 3.6%水合氯醛、Neurobasal培養(yǎng)基、DMEM/F12、EDTA、左旋胞嘧啶、木瓜蛋白酶、胰酶抑制劑、胎牛血清、0.01mol/L PBS、0.3%Triton X-100、山羊血清封閉液、兔抗Nestin（1∶200，sigma）、兔抗GFAP（1∶300，abcam）、兔抗 CD133（1∶200，Santa Cruz）、兔抗P75NGFR（1∶300，abcam）、兔抗 S100（1∶400，abcam）、兔抗MAP2（1∶300，sigma）、兔抗β-tubullin III（1∶400，abcam）、Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200），Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200）、1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10%脫脂奶粉封閉液、PBST、DAPI防淬滅的封片劑等等。

1.3 海馬可溶性因子提取 選擇體重為250 g的Wistar大鼠，腹腔注射3.6%水合氯醛（1mL/100 g）后斷頭。低溫環(huán)境下將海馬結(jié)構(gòu)放置在離心管中，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按每只大鼠的海馬結(jié)構(gòu)浸泡于2mL的冷DMEM/F12，在搖床中低溫振蕩2小時(shí)后，使用高速離心（15000 g，30min，4℃），經(jīng)過(guò)濾滅菌，分裝1mL/管，于-20℃保存。該方法已授權(quán)為國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利（專(zhuān)利號(hào):NO.201210492449.5.）。

1.4 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 選取出生1天的Wistar乳鼠1只，在顯微鏡下無(wú)菌取出大腦組織，置于含冷DMEM/高糖培養(yǎng)基的無(wú)菌皿內(nèi)，于顯微鑷下，切除小腦，盡量去除腦膜及血管，分離海馬，將分離所得海馬置于滅菌青霉素瓶?jī)?nèi)；將含DMEM/F12、EDTA及木瓜蛋白酶的消化液加入青霉素瓶?jī)?nèi)，將海馬組織碎片轉(zhuǎn)移到15mL離心管內(nèi)消化20分鐘后；使用胎牛血清及胰酶抑制劑終止消化，通過(guò)適當(dāng)吹打松解細(xì)胞，盡量呈現(xiàn)單細(xì)胞狀態(tài)；經(jīng)500目網(wǎng)篩過(guò)濾，收取細(xì)胞并離心；棄上清液備用。

1.5 模擬顱內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn) 收集上述取材的細(xì)胞接種于含海馬可溶性因子終濃度分別為0，50，100，200，和400μl/mL的DMEM/F12中培養(yǎng)4天。普通光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)并計(jì)算在第2、6天各組細(xì)胞球數(shù)量。

1.6 神經(jīng)球免疫熒光鑒定 收集100μl/mL組中培養(yǎng)4天的細(xì)胞球移入2mLEP管中，依次進(jìn)行0.01 mol/L PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30min；0.01 mol/L PBS沖洗3次；0.3%Triton X-100破膜；正常山羊血清封閉1小時(shí)。滴加一抗:兔抗Nestin（1∶200，sigma）和兔抗CD133（1∶200，Santa Cruz）后，孵育過(guò)夜，經(jīng)PBS沖洗3次后；使用二抗（Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200）和Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200）孵育2小時(shí)，PBS沖洗3次；DAPI復(fù)染細(xì)胞核后涂片觀察。陰性對(duì)照試驗(yàn)是以抗體稀釋液代替一抗，鏡下不顯色，便為陰性結(jié)果。

1.7 神經(jīng)球western blot鑒定 收集100μl/mL組中神經(jīng)球于2mLEP管內(nèi)，并加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，將處理好的樣品上樣并電泳，依次經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉，PBST洗膜后，加入兔抗CD133（1∶1000，Santa Cruz）和兔抗Nestin（1∶1000，sigma）孵育2小時(shí)，再次同上述洗膜后；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，再一次顯影、定影。

1.8 海馬可溶性因子分化神經(jīng)干細(xì)胞 收集100μl/mL組中培養(yǎng)4天的神經(jīng)球，移入含海馬可溶性因子100μl/mL、1%胎牛血清的DMEM/F12的24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)并觀察神經(jīng)球的形態(tài)改變。

1.9 神經(jīng)干細(xì)胞分化后細(xì)胞鑒定 吸棄上述24孔板中的培養(yǎng)液，分別經(jīng)0.01 mol/L PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30min，破膜，山羊血清封閉1小時(shí)后。加入一抗:兔抗GFAP（1∶300，abcam）、兔抗P75NGFR（1∶300，abcam）、兔抗S100（1∶400，abcam）、兔抗 MAP2（1∶300，sigma）和兔抗β-tubullin III（1∶400，abcam），孵育過(guò)夜，經(jīng)PBS沖洗3次后；使用二抗（Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200）和Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200）孵育2小時(shí)，PBS沖洗3次；DAPI復(fù)染細(xì)胞核后涂片觀察。陰性對(duì)照試驗(yàn)是以抗體稀釋液代替一抗，鏡下不顯色，便為陰性結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞于不同濃度海馬可溶性因子成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果的分析采用One Way ANOVAs方法統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài) Wistar乳鼠的海馬組織取材后接種于DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞為球形，懸浮單細(xì)胞狀態(tài)，胞體透亮且小，邊緣光滑（圖1A，B）。

圖1 原代內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸浮狀態(tài)倒置相差顯微鏡A:100×，B:200×

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn) ENSCs在含不同濃度（0、50、100、200、400μl/mL）的 HSF的DMEM/F12中培養(yǎng)2天后，對(duì)照組（圖2A）中無(wú)細(xì)胞球形成［與100μl/mL組（圖2C）比較，P1=0.00（圖3A）］，與對(duì)照組比較，100μl/mL實(shí)驗(yàn)組有顯著差異（P1=0.00＜0.05，圖3A）；至第6天，在100μl/mL組（圖2H）中的神經(jīng)球數(shù)量明顯多于其余各組（圖2F，J，I，J；圖 3B，P1′=P2′=P3′=P4′=0.00）。

圖3 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞于不同海馬可溶性因子中第2天及第6天的成球?qū)嶒?yàn)定量條圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P1=P2=P3=P4=0.00＜0.05，P1′=P2′=P3′=P4′=0.00＜0.05

2.3 神經(jīng)球免疫熒光鑒定 在100μl/mL實(shí)驗(yàn)組中形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，可見(jiàn)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞高親和蛋白 Nestin（圖4A）及 CD133（圖4B）陽(yáng)性，而對(duì)照組中的細(xì)胞表達(dá)Nestin蛋白及CD133陰性，同時(shí)陰性對(duì)照中無(wú)Nestin及CD133表達(dá)（圖4C）。

2.4 神經(jīng)球western blot鑒定 在100μl/mL實(shí)驗(yàn)組形成的神經(jīng)球與誘導(dǎo)前的ENSCs經(jīng)Western Blot法鑒定，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞可見(jiàn)神經(jīng)干細(xì)胞高親和蛋白CD133及Nestin高表達(dá)的條帶，CD133蛋白的分子量為120 kDa，Nestin蛋白的分子量為177 kDa，內(nèi)參為35kD的GAPDH（圖4D）。而未誘導(dǎo)的ENSCs表達(dá)的Nestin與CD133蛋白極其微量。

圖4 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞于100μl/mL濃度的海馬可溶性因子中成球后熒光鑒定（nestin:A；CD133:B；陰性對(duì)照:C，藍(lán)色為DAPI核染）及western blot鑒定（D）

2.5 神經(jīng)干細(xì)胞于HSF中分化及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 100μl/mL組中的神經(jīng)干細(xì)胞在終濃度為含100μl/mL的HSF、1%胎牛血清的DMEM/F12中繼續(xù)分化，接種2小時(shí)后，神經(jīng)球開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)并伸出突起，3天后細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形，突起變長(zhǎng)（圖5A）。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，分化的細(xì)胞為表達(dá)GFAP（圖5D）、S100（圖5E）、P75 NGFR（圖5F）陽(yáng)性的膠質(zhì)樣細(xì)胞，不表達(dá)神經(jīng)元特異蛋白MAP2（圖5B）和β-tubullin III（圖5C）。

圖5 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞于含血清的100μl/mL濃度的海馬可溶性因子中分化為表達(dá)GFAP，S100，p75NGFR陽(yáng)性（紅色）的膠質(zhì)樣細(xì)胞，不表達(dá)神經(jīng)元特異性抗體MAP2，β-tubullin。藍(lán)色為DAPI核染。熒光顯微鏡200×

3 討 論

神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及臨床研究一直是神經(jīng)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中存在神經(jīng)干細(xì)胞，這些存在自身的干細(xì)胞稱(chēng)為內(nèi)源性干細(xì)胞［3］。內(nèi)源性干細(xì)胞所處的居所稱(chēng)為干細(xì)胞巢，而干細(xì)胞巢的穩(wěn)定性有賴(lài)于所處的微環(huán)境，即由基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及各種調(diào)控因子等共同構(gòu)成［4］。生理情況下，巢中干細(xì)胞常保持“睡眠”狀態(tài)，但病理過(guò)程時(shí)，受一些信號(hào)（如Wnt，Notch，bHLH等）激活后，神經(jīng)干細(xì)胞即發(fā)生增殖，遷移和分化等細(xì)胞行為。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能重建具有巨大潛力［5］，為治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了廣闊前景。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)提取大鼠的海馬中HSF體外模擬宿主細(xì)胞顱內(nèi)微環(huán)境，跟蹤ENSCs在體內(nèi)的發(fā)育及分化等歸宿。ENSCs在含HSF100μl/mL無(wú)血清DMEM/F12中發(fā)育為表達(dá)Nestin及CD133陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞。更重要的是，在該濃度的HSF中發(fā)育而成的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)一步分化為表達(dá)GFAP、S100、P75NGFR陽(yáng)性且不表達(dá)神經(jīng)元特異蛋白βtubullin III和MAP2的膠質(zhì)樣細(xì)胞。故而，我們初步假設(shè)，在神經(jīng)組織受到創(chuàng)傷情況下，其微環(huán)境中沉默的單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞很可能發(fā)育、不斷增殖成神經(jīng)球并進(jìn)一步分化成膠質(zhì)樣細(xì)胞，且膠質(zhì)樣細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞替代或分泌營(yíng)養(yǎng)因子，改善損傷灶周?chē)h(huán)境而參與修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［6］。

海馬組織屬于大腦邊緣系統(tǒng)的一部分。海馬組織的微環(huán)境是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及干細(xì)胞均賴(lài)以生存的。所以探索ENSCs與顱內(nèi)微環(huán)境的相互作用，為神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)增殖、發(fā)育及分化過(guò)程提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。近年來(lái)的研究主要聚焦在干細(xì)胞的遷移、再生、分化以及存活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果簡(jiǎn)而概之即:HSF用以模擬顱內(nèi)的微環(huán)境，被認(rèn)為是一種復(fù)合的生理性誘導(dǎo)劑，其作用于ENSCs，能夠促進(jìn)ENSCs分裂增殖，nestin與CD133蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步分化為膠質(zhì)樣細(xì)胞［7］。其中潛在的機(jī)制可考慮:HSF中存在的某些蛋白或者小分子可激活誘導(dǎo)ENSCs分化為膠質(zhì)樣細(xì)胞的信號(hào)通路，因此該實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)方法可能快速促進(jìn)ENSCs發(fā)育成神經(jīng)干細(xì)胞，或者可考慮將HSF注射神經(jīng)損傷區(qū)域作為修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周?chē)窠?jīng)疾病的一種參考方法［8］。因?yàn)榉只募?xì)胞是表達(dá)GFAP、S100、P75NGFR陽(yáng)性的膠質(zhì)樣細(xì)胞，所以其優(yōu)勢(shì)可發(fā)揮在修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處為實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的潛在機(jī)制尚不明確，下一步擬對(duì)海馬HSF行質(zhì)譜分析，了解其中大部分蛋白質(zhì)成分，探索某些分子激活ENSCs的信號(hào)通路。

綜上所述，從海馬組織提取的的HSF，尤其是在濃度為100μl/mL作用于ENSCs時(shí)，即體外模擬顱內(nèi)微環(huán)境探索及驗(yàn)證ENSCs的發(fā)育與歸宿；100μl/mL濃度的HSF可促進(jìn)ENSCs的增殖分裂，且在該濃度中ENSCs可進(jìn)一步分化為膠質(zhì)樣細(xì)胞。

4 結(jié) 論

大鼠ENSCs在終濃度為100μl/mL的HSF作用下，可促進(jìn)ENSCs的增殖分裂，ENSCs在同樣濃度下的HSF中可進(jìn)一步分化為表達(dá)GFAP、S100、p75NGFR陽(yáng)性的膠質(zhì)樣細(xì)胞；100μl/mL的HSFS是ENSCs的一種生理性誘導(dǎo)劑或參與促進(jìn)ENSCs增殖、分化及通過(guò)細(xì)胞替代或因子分泌等機(jī)制修復(fù)神經(jīng)損傷。

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Adult rat hippocampus soluble factors:a novel method mimicking intracranial microenvironment for tracing the induction and differentiation of endogenous neural stem cells in vitro

Li Peng，Chen Fanfan，Xie Wei，et al.Neurosurgery Department of Guangzhou First Hospital Affiliated Guangzhou Medical University

Objective The aim of this study was to explore induction and differentiation of endogenous neural stem cells（ENSCs）in the hippocampus soluble factors（HSF）from the hippocampus of adult Wistar rats by mimicking an intracranial microenvironment. Methods After Wistar rats sacrificed，the hippocampus tissue was obtained in cold DMEM/F12.After centrigued and filtered，the HSF was stored at-20℃.The ENSCs was obtained from the hippocampus tissue of a neonate Wistar rat.Collected the tissue，digested and obtained the ENSCs.After we observed the morphology，the ENSCs were cultured in different concentration（0、50、100、200、400μl/mL）of HSF for 6 days，and compared the expression of Nestin and CD133 by immunocytochemistry.Meanwhile，we compared the Nestin and CD133 protein by western blot.And then we explored the optimal concentration of HSF by the numbers of all groups on the second and sixth day.Furthermore，we did the differentiated experiment using the same concentration of HSF. Results The number of neurospheres in the 100μg/mL group was significantly higher than those in the other groups on the 6th day.Immunofluorescence revealed that the neurospheres from ENSCs in the 100μg/mL group more highly expressed nestin and CD133 than control.This result was confirmed by western blot analysis.The neurospheres can differentiate into glia-like cells in 100μg/mL HSF and 1%FBS expressing GFAP，S100 and P75 NGFR by immunofluorescence. Conclusion These data indicated that HSF alone，mimicking a destination of ENSCs in vitro，could induce and differentiate neurospheres from ENSCs，as a new method to get NSCs and glia-like cells differentiated from ENCs to repair thediseases of center nervous system.

Hippocampal；Soluble factors；Microenvironment；Stem cells；Glia-like cells

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.01.001

2015-09-29）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301098）

全偉，E-mail：zhimeng_li＠163.com