蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦出血后腦水腫的影響*

王 蔚 杜 淵 白 雪 楊思進(jìn)△

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蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦出血后腦水腫的影響*

王 蔚1杜 淵2白 雪1楊思進(jìn)1△

目的觀察蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)大鼠腦出血后腦含水量、血腦屏障超微結(jié)構(gòu)、血腦屏障通透性的影響。方法將195只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊高、中、低劑量組，各組又分為12h、48h、72h三個(gè)亞組，采用自體尾部血注入法制備腦出血大鼠模型，采用干濕重法檢測(cè)腦含水量，伊文思藍(lán)法對(duì)各組進(jìn)行血腦屏障通透性檢測(cè)，電子顯微鏡下觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果與模型組比較，ZL低、中、高劑量組腦含水量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組12h(P<0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)各藥物組(P<0.01)；ZL低、中、高劑量組大鼠腦組織EB含量均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組在12h、48h及72h具有顯著性差異(P<0.01)。電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)血管周圍水腫程度較為輕微，血腦屏障的結(jié)構(gòu)得到明顯改善。結(jié)論蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯減輕腦出血大鼠腦水腫，保護(hù)血腦屏障組織結(jié)構(gòu)，避免其通透性破壞，改善血腦屏障功能，該作用存在一定的量效關(guān)系，ZL高劑量組作用最為明顯。

蛭龍活血通瘀膠囊；腦出血；血腦屏障功能；腦含水量

腦出血是常見的內(nèi)科急癥，臨床病理研究證實(shí)[1]，腦出血急性期惡化死亡的主要原因是腦水腫及出血。腦出血后在出血區(qū)域形成血腫，對(duì)周圍腦組織造成壓迫，引起腦內(nèi)的急性占位效應(yīng)，并對(duì)周圍的腦組織產(chǎn)生進(jìn)一步的損害，因此腦水腫被認(rèn)為是腦出血后最重要的繼發(fā)性病理變化之一，往往成為腦出血病情加重的重要原因。腦出血后周圍組織水腫的發(fā)生機(jī)制與諸多因素有關(guān)[2]，其中，血腦屏障破壞被認(rèn)為是主要的因素之一。本實(shí)驗(yàn)研究觀察具有益氣活血、化瘀通絡(luò)功效的蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)大鼠腦出血后腦組織含水量、血腦屏障通透性和血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)的雄性健康SD大鼠195只，體質(zhì)量250～300g，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(川)2013-065。動(dòng)物按照每籠5只進(jìn)行飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，濕度30%～40%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物及試劑蛭龍活血通瘀膠囊：主要成分包括黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物，規(guī)格為0.4g/粒，相當(dāng)于生藥 2.625g，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20151201；水合氯醛：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：141203；肝素鈉注射液：成都市海通藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150709；醫(yī)用碘伏消毒液：四川金山制藥有限公司，批號(hào)：150101；0.9%生理鹽水：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：B1510908；過氧化氫溶液：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10011208；伊文思藍(lán)：上海醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司，批號(hào)：20150104；甲酰胺：重慶東方紅試劑廠，批號(hào)：140918。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器大鼠腦立體定位儀：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；ATPB457A小動(dòng)物電子稱：深圳安普特電子科技有限公司；AUY220精密電子天平：日本島津公司；UPH-II-10T超純水機(jī)：南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司；GR60DR全自動(dòng)高壓滅菌器：廈門致微公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：蘇州江東精密儀器有限公司；電子恒溫三用水箱：北京億百川科技發(fā)展有限公司；Model 680酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad；ANKE TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；IMS-40全自動(dòng)雪花制冰機(jī)：常熟雪珂電器有限責(zé)任公司；JEM-1400電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社；Leica熱膨脹式超薄切片機(jī)：河南榮程聯(lián)合科技有限公司。

1.4 動(dòng)物造模及模型評(píng)估大鼠術(shù)前禁食12h，稱重麻醉后斷尾取尾部自體血50μl。將大鼠用立體定位儀俯臥位固定，備皮消毒，暴露手術(shù)區(qū)域，沿頭皮正中縱行切開約10mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜，參照的Rosenber[3]的方法，并根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》[4]進(jìn)行尾殼核定位(矢狀縫右側(cè)旁開3.0mm，前囟前0.2mm處)，用微量進(jìn)樣器按5μl/min的速度緩慢勻速注入自體血后，留針15分鐘緩慢退針，骨蠟封閉顱骨，縫合頭皮。假手術(shù)組只進(jìn)針，不注血。參照Z(yǔ)ea Longa[5]“5分制法”對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。以評(píng)分為1～3 分認(rèn)為造模成功，0分則認(rèn)為造模失敗，4分和死亡大鼠均被剔除實(shí)驗(yàn)并根據(jù)分組進(jìn)行相應(yīng)補(bǔ)充。假手術(shù)組大鼠在術(shù)后清醒后無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分為0分。

1.5 動(dòng)物分組及給藥將195只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀低、中、高劑量組(分別簡(jiǎn)稱為“ZL低劑量組”、“ZL中劑量組”、“ZL高劑量組”)，每組39只。并按指標(biāo)檢測(cè)的時(shí)間劃分為12h、48h、72h三個(gè)亞組，每亞組13只。大鼠麻醉自然蘇醒后進(jìn)行灌胃。各藥物組均給予蛭龍活血通瘀膠囊藥物的等體積和相應(yīng)的濃度進(jìn)行灌胃。蛭龍活血通瘀膠囊成人的臨床用藥量為3.6g/d，按照人體用量的5倍、10倍、20倍定為低、中、高劑量。成人體質(zhì)量按60kg計(jì)算，換算成各藥物組大鼠的每日用藥量，分別為0.3g/kg/d、0.6g/kg/d、1.2g/kg/d。大鼠的灌胃體積為3ml/次，給藥次數(shù)為1次/日。模型組、假手術(shù)組給予同藥物組等體積(3ml/次)的生理鹽水灌胃，給藥次數(shù)同藥物組。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 腦組織含水量大鼠稱重麻醉后快速斷頭取腦，去除軟腦膜及表面血液，切取雙側(cè)大腦半球組織置于電子天平稱重后，切取右側(cè)大腦組織稱得出血側(cè)腦濕質(zhì)量，再將其移入恒溫鼓風(fēng)干燥箱以110℃ 24h烘干至恒重，置于電子天平稱得出血側(cè)腦組織干質(zhì)量。腦組織含水量(BWC)及腦系數(shù)計(jì)算公式為[6]：腦組織含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%；腦系數(shù)(%)=全腦質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.6.2 血腦屏障超微結(jié)構(gòu)樣本經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定，0.01M磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，蒸餾水漂洗，50%丙酮脫水，環(huán)氧丙烷置換，滲透包埋，用Leica熱膨脹式超薄切片機(jī)切片，厚度為60nm；切片經(jīng)枸櫞酸鉛雙染色后，在電子顯微鏡下觀察血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)。

1.6.3 血腦屏障通透性參照Belagev等[7]的方法，采用檢測(cè)伊文思藍(lán)(evens blue，EB)法進(jìn)行測(cè)定。采樣前2h，大鼠稱重麻醉，經(jīng)股靜脈以20mg/kg注入2%伊文思藍(lán)，2h后用0.9%生理鹽水心臟灌注后斷頭取腦，冠狀位切取針孔后腦組織稱取濕質(zhì)量后浸于盛有3ml甲酰胺的試管中，經(jīng)電子恒溫水箱45℃加熱水浴24h，取上清1000rpm離心5 min，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)620nm)測(cè)得光密度值(OD值)。以O(shè)D/g表示EB含量，反應(yīng)血腦屏障的通透性。

2 結(jié)果

2.1 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦組織含水量的影響每組取5只比較腦組織含水量。假手術(shù)組組內(nèi)在各時(shí)間點(diǎn)，腦含水量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組和ZL低、中、高劑量組的腦含水量均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，ZL低、中、高劑量組大鼠腦含水量均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，低劑量組于12h時(shí)(P<0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)各藥物組(P<0.01)。ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組在12h、48h及72h具有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量(%)比較 (只，

注：與模型組比較，1)P<0.01；與假手術(shù)組比較，2)P<0.01；與高劑量組比較，3)P<0.01

2.2 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響血腦屏障由連續(xù)毛細(xì)血管內(nèi)皮、內(nèi)皮基膜、周細(xì)胞、周細(xì)胞基膜構(gòu)成。周細(xì)胞環(huán)繞毛細(xì)血管，內(nèi)皮組織間結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮基膜及周細(xì)胞基膜完整，局部互相連接。見圖1。假手術(shù)組內(nèi)皮胞質(zhì)厚度較均勻、表面光滑，內(nèi)有少量吞飲小泡，基膜走行規(guī)則、厚薄均勻、電子密度基本一致。星形膠質(zhì)細(xì)胞腳板結(jié)構(gòu)清楚，其內(nèi)線粒體豐富。見圖2。模型組毛細(xì)血管周圍水腫明顯，血管與周圍神經(jīng)組織充滿水腫液，組織稀疏，電子密度降低，血管腔形態(tài)不規(guī)則，基膜厚薄不均，內(nèi)皮局部膨出，內(nèi)有吞飲泡，部分與基膜剝離，血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞。見圖3。ZL低劑量組血管周圍局部水腫明顯，血管形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)皮含較多小泡樣物質(zhì)，基膜的完整性破壞，周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突起較少。見圖4。ZL中劑量組血管周圍水腫程度降低，毛細(xì)血管腔面粗糙，局部形成結(jié)節(jié)樣膨大，內(nèi)皮含有較多吞飲小泡，基膜厚度不均勻，電子密度降低。見圖5。ZL高劑量組血管周圍水腫輕微，周細(xì)胞胞質(zhì)中可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體，局部水腫，內(nèi)皮含較多泡樣物質(zhì)，基膜完整，走形規(guī)則，電子密度基本均勻。見圖6。

圖1 (Figure 5)×5000

圖2 (Figure 6)×12000

圖3 (Figure 7)×12000

圖4 (Figure 8)×12000

圖5 (Figure 9)×12000

圖6 (Figure 10)×12000

2.3 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)各組大鼠血腦屏障通透性的影響每組取5只比較腦組織EB含量。假手術(shù)組在術(shù)后12h、48h、72h腦組織EB含量無(wú)明顯升高，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組及ZL低、中、高劑量組的腦組織EB含量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，ZL低、中、高劑量組大鼠腦組織EB含量均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組在12h、48h及72h具有顯著性差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織EB含量(OD/g)比較 (只，

注：與模型組比較，1)P<0.01；與假手術(shù)組比較，2)P<0.01；與高劑量組比較，3)P<0.01。

3 討論

腦水腫是腦組織內(nèi)液體過多貯積從而引起腦體積增大的一種病理狀態(tài)[8]，腦水腫時(shí)由于腦內(nèi)的水分增加，從而導(dǎo)致腦容積增大。血腦屏障(BBB)功能受損是導(dǎo)致血管源性腦水腫(vasogenic brain edema， VBE)的主要因素。血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是腦與血液及腦脊液之間的一種屏障，是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)。血腦屏障可以阻止血液中的某些物質(zhì)進(jìn)入腦組織，比如一些毒素和有害物質(zhì)，但同時(shí)也能讓營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物選擇性的順利通過，以維持腦組織內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)揮其屏障作用。腦的毛細(xì)血管屬于連續(xù)型毛細(xì)血管，內(nèi)皮細(xì)胞之間具有緊密的連接以封閉內(nèi)皮，其外有完整的基膜，并有周細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的突起包繞[9]。構(gòu)成血腦屏障的基本組織為腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)及其間緊密連接(TJ)、內(nèi)皮基膜和星型膠質(zhì)細(xì)胞足突[10]。當(dāng)血腦屏障功能遭到破壞，水分就在滲透壓壓力梯度的作用下穿過受損的血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，出現(xiàn)腦水腫影響顱內(nèi)壓。

腦出血時(shí)血腦屏障也相應(yīng)地遭到破壞，引起血腦屏障局部或廣泛的通透性改變，進(jìn)而引起腦組織繼發(fā)性病理改變。腦出血性損傷以后各種因素綜合作用引起血腦屏障的通透性增高，腦組織內(nèi)環(huán)境紊亂，血腦屏障遭到破壞，功能障礙，產(chǎn)生并加重腦水腫形成，主要與血管源性腦水腫有關(guān)。伊文思藍(lán)(Evens blue，EB)是一種偶氮基熒光染料，具有與體內(nèi)外血清蛋白結(jié)合的特性，從而被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)血腦屏障的通透性，通過可見的藍(lán)染區(qū)域和熒光顯微鏡下出現(xiàn)的紅色熒光可以定性反應(yīng)血腦屏障的通透性，并可采用熒光分析定量檢測(cè)血管外的EB含量，目前被公認(rèn)為是一種精確反應(yīng)血腦屏障通透性的方法[11,12]。

本研究表明，自體血制備的腦出血大鼠在術(shù)后72h內(nèi)腦含水量逐漸升高，腦水腫程度呈進(jìn)行性加重的趨勢(shì)，蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯降低腦出血大鼠腦組織含水量。腦出血模型大鼠在術(shù)后12h血腦屏障的通透性即可發(fā)現(xiàn)有明顯改變，腦組織EB含量明顯升高，術(shù)后48h時(shí)升高最為明顯，72h時(shí)較之稍有下降。電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示術(shù)后48h，整個(gè)血管腔形態(tài)不規(guī)則，基膜厚薄不均，毛細(xì)血管周圍水腫明顯，組織稀疏，電子密度降低，內(nèi)皮局部膨出，部分與基膜剝離，血腦屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。當(dāng)給予蛭龍活血通瘀膠囊低、中、高劑量進(jìn)行藥物干預(yù)治療后，在術(shù)后12h、48h及72h，大鼠血腦屏障通透性較模型組均具有不同程度的改善，腦組織EB含量較之有所下降，電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)血管周圍水腫程度較為輕微，血腦屏障的結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。說明蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦出血大鼠血腦屏障功能具有明顯的改善作用。

[1] 黃友岐.神經(jīng)病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：155.

[2] 趙性泉，王擁軍. 腦出血后繼發(fā)性水腫和神經(jīng)損害的機(jī)制[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊(cè)，2004，12(8)：571-574.

[3] Rosenberg GB.Collgenose-induced intracerebral hemorrhage in rat[J]. Stroke，1990，21(5)：801-807.

[4] 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：35.

[5] Zea longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et a1.Reversibal middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[6] 王志偉，朱青. 大黃三七散改善急性腦出血大鼠神經(jīng)功缺損的研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(2)：415-417.

[7] Belayer L，Busto R，Zhao W，et a1．Ginsberg．Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats[J]．Brain Research，1996,739(1)：88-96．

[8] 李玉林，文繼舫，唐建武. 病理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：306.

[9] 蔡玉文，祝彼得，周忠光，等.組織學(xué)與胚胎學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：67.

[10] Wells WA，Bonetta L. Endothelial tight junctions form the blood brain barrier[J].Cell Biol，2005，169(3)：378.

[11] Cole DJ，Matsumura JS，Drummond JC，et al.Time and pressure dependent change in blood-brain barrier permeability after temporary middle cerebral artery occlusion[J].Acta Neuropathol，1991，82(4)：266-268.

[12] Aoki T，Sumii T，Mori T，et al.Blood-brain harrier disruptton and matmx metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury：mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rat[J].Stroke，2002，33(11)：2711-2717.

[13] 陳興洲，陸兵勛.石向群，等.大鼠大腦中動(dòng)脈暫時(shí)性閉塞后腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1998，15(1)：195-197.

四川省科技廳分階段中醫(yī)藥干預(yù)腦出血急性期優(yōu)化方案研究(No.14ZC0036)

1．西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科(瀘州 646000)；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院兒科(瀘州 646000)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.22.019

1003-8914(2016)-22-3271-04

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2016-09-21)