喉癌干細胞的培養(yǎng)及其放射抗拒相關miRNA的篩選研究

段廣亮 戴輝萍 唐婷婷 丁飛 朱桂婷

喉癌干細胞的培養(yǎng)及其放射抗拒相關miRNA的篩選研究

段廣亮 戴輝萍 唐婷婷 丁飛 朱桂婷

目的 通過培養(yǎng)Hep-2喉癌細胞株，分離并擴增出腫瘤干細胞，放療后篩選出調控放射抗拒的miRNA。方法 含生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep-2喉癌細胞株，流式細胞儀檢測細胞中側群細胞的比例。當側群細胞比例達25%時，收集全部細胞球，篩選出CD133+、CD44+細胞作為喉癌干細胞，X線照射喉癌干細胞。miRNA生物芯片檢測照射與未照射的喉癌干細胞，篩選出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA，確定用以調控放射抗拒的miRNA。結果 成功培養(yǎng)出側群細胞，流式細胞儀檢測其比例達到26.2%，篩選出的CD133+、CD44+細胞的比例均高于91%。通過miRNA芯片成功檢測出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA。結論 本研究成功培養(yǎng)出喉癌干細胞，成功篩選出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)了可能用以調控放射抗拒的miRNA。

無血清培養(yǎng)基 miRNA 側群細胞 放療

腫瘤干細胞是腫瘤組織中少數(shù)具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞，且具有放射抵抗能力，因此腫瘤干細胞被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和放射抵抗的根源。側群細胞和CD133+、CD44+腫瘤細胞是較為認可的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的標志干細胞[1]。miRNA是目前腫瘤細胞內已知的一類最重要的基因調控分子，特異性miRNA對腫瘤干細胞的細胞特性起獨特而重要的調控作用[2-6]，包括對輻射耐受基因的調控作用。放射特異miRNA對腫瘤干細胞放射抗拒相關基因發(fā)揮著重要的調控作用[7-9]。放療是治療喉癌的重要方法，但喉癌細胞的放射抗拒仍是目前嚴重干擾療效的難題。本研究通過模擬放療照射喉癌干細胞，比較照射與未照射的喉癌干細胞的基因檢測結果，篩選出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA,結合miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫miGEN結果，確定擬調控的放射抗拒相關基因及miRNA，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 Anti-CD44-FITC、Anti-CD133-PE(美國e－Bioscience公司)，miRNA分離試劑盒 (美國Ambion公司)，miRNA芯片（丹麥Exiqon公司），重組表皮生長因子（EGF）、成纖維生長因子(bFGF)（美國PeproTech公司），流式細胞儀（美國BD公司）

1.2 方法

1.2.1 干細胞微球體分離培養(yǎng) 將Hep-2喉癌細胞株接種于含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代。待細胞生長至80%瓶底面積時，用PBS液清洗，質量濃度為2．5g/L的胰蛋白酶消化，吸管反復吹打制成單細胞懸液。離心除去終止消化時殘留的含血清培養(yǎng)基后重懸于無血清培養(yǎng)基中，無血清培養(yǎng)基為在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加EGF（20μg/L）和bFGF（10μg/L）、L-谷氨酰胺（2mmol/ L）、胰島素（4U/L）、青霉素G（1×105U/L）、鏈霉素（100mg/L）。臺盼藍染色、計數(shù)重懸成103/ml單細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶直立、每日搖數(shù)次以利細胞懸浮生長，觀察微球形成，每2d在每個培養(yǎng)瓶中加入2ml新鮮無血清培養(yǎng)基，每6d傳代。喉癌細胞增殖形成細胞球4d后，Accutase消化、吹打成單細胞，洗滌后在SFM中傳代培養(yǎng)，以擴增和富集喉癌干細胞，按1∶4的比例傳代。

1.2.2 側群細胞檢測 選擇對數(shù)生長期細胞，細胞計數(shù)，調節(jié)細胞懸液密度至1×109/L。準備2支無菌干燥標準流式上樣管（5ml規(guī)格，聚丙烯材料），2管中分別加入上述細胞懸液1ml，再加入Hoechst33342溶液至終濃度為5mg/L（Hoechst33342組），同時在其中1支上樣管中加入維拉帕米溶液至終濃度50mg/L（Hoechst33342+維拉帕米組）。吹打均勻后 37℃恒溫水浴箱作用120min，期間每15min柔和晃動上樣管1次，混勻溶液使細胞充分染色。染色完成后4℃1 000r/min離心10min，棄上清液，加入4℃PBS吹洗1次，4℃1 000r/ min離心 10min，小心抽棄上清液，重懸于4℃含體積分數(shù)為2%FBS的PBS中。置于4℃環(huán)境中待上流式細胞儀檢測。

1.2.3 喉癌干細胞的篩選 當側群細胞比例達25%時，收集全部生長細胞球，制成單細胞PBS懸液100μl，計數(shù)細胞密度為1×107/ml。用臺盼藍染色計活細胞數(shù)，要求活細胞數(shù)＞90%～95%。加入Anti-CD44-FITC和Anti-CD133-PE各5μl，4℃避光孵育30min。離心去上清液，PBS洗滌至少3次，1 500r/min，離心3min，200目細胞網篩過濾。加300μl PBS（pH=7.4），上流式細胞儀檢測。

1.2.4 喉癌干細胞的放射處理 采用模擬臨床非致死劑量對腫瘤干細胞進行放射處理：喉癌干細胞SFM懸液，調整細胞至1×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中。短期培養(yǎng)后，直線加速器對培養(yǎng)的細胞進行照射，條件為6MV X線垂直照射，劑量率為2Gy/min，照射時于培養(yǎng)板底部加入1.5cm組織等效填充物，源皮距100cm。照射5Gy/次，共3次，照射間隔72h。

1.2.5 差異miRNA的篩選 miRNA分離試劑盒富集和純化miRNA：總RNA和5倍體積的裂解/結合緩沖液相混合，加入1/10體積的miRNA勻漿添加劑，冰上孵育，加入1/3體積的無水乙醇，混勻后通過濾管。收集液體加入2/3體積的無水乙醇，混勻后95℃預熱后二次過濾。用牛腸堿性磷酸酯酶制備標記反應物，用T4連接酶熒光標記miRNA并過柱純化。在熒光miRNA樣本中加入10×GE阻斷劑和2×HiRPM雜交緩沖液，并用雜交儀及其旋轉烘箱進行miRNA芯片雜交。結束后分別將芯片在GE緩沖液中清洗，Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號，挑選2倍差異表達miRNA并分析結果。

2 結果

2.1 喉癌干細胞的誘導和富集 Hep-2喉癌細胞株接種后2～3h開始大部分細胞貼壁，第3～7天部分細胞開始懸浮并增生形成松散的串珠狀，另一部分細胞凋亡崩解，不能在無血清培養(yǎng)基中存活生長。第9天時，串珠狀細胞團分解、凋亡，但仍可見小部分細胞持續(xù)擴增形成細胞球，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可見不多的細胞球沉于培養(yǎng)瓶底部。球內細胞折光性較好，連接緊密，不能準確區(qū)分細胞與細胞間的界限。新形成的腫瘤干細胞球不甚規(guī)則，新生單個細胞常以“出芽”的方式連接在球體上。Accutase消化、吹打成單細胞懸液后第l～2天單個細胞間相互聚集連接成“樹枝狀”懸浮于SFM中，第3～4天形成不規(guī)則細胞球，第5～6天逐漸形成規(guī)則球形。隨著傳代次數(shù)的增加，球體趨于圓形。見圖1。

圖1 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)喉癌細胞形成的細胞球（×200）

2.2 側群細胞的分選 Hoechst33342組側群細胞能排出熒光染料Hoechst33342而呈弱染色狀態(tài)，位于細胞流式圖的左下角熒光弱染區(qū)域。Hoechst33342+維拉帕米組中加維拉帕米，抑制了細胞轉運蛋白的功能，改變了側群細胞外排熒光染料的特性，使側群細胞的比例減少到（0.0±0.0）%，經多次擴增和富集后成功使側群細胞達到26.2%。見圖2。

2.3 喉癌干細胞的篩選 采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞微球體，富集喉癌干細胞。流式細胞儀分別篩選出CD133+、CD44+喉癌干細胞。分選前喉癌細胞CD133+、CD44+的表達率均低于為3%，分選后均高于91%，分選后喉癌細胞HE染色可見細胞分布均勻，體積較大，呈梭形，細胞核與細胞質的比例接近于1∶1，核大濃染，核仁大而突出，有病理性核分裂相，符合惡性腫瘤干細胞病理特點。見圖3、4。

圖2 側群細胞流式檢測圖（a:Hoechst33342組；b:Hoechst33342+維拉帕米組）

圖3 流式細胞儀篩選實體瘤來源的喉癌干細胞結果（a：CD44+細胞；b：CD133+細胞）

圖4 凋亡細胞流式檢測圖（a：喉癌干細胞；b：喉癌細胞）

2.4 差異miRNA的篩選結果 放療前后經Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號，挑選2倍差異表達miRNA，結果發(fā)現(xiàn)明顯升高2倍以上的miRNA有3條，而明顯降低達2倍以上的miRNA有15條，其名稱及序列見表1。

表1 2倍差異表達的miRNA

3 討論

HNSCC居于癌癥病死率的第6位，全世界每年新發(fā)病例50萬，過去幾十年治療HNSCC的主要方法是手術和放療。臨床證明放療對HNSCC有一定作用，但治療結果的進展有限，復發(fā)和治療失敗仍然有相當?shù)谋嚷?。本課題組前期開展了一系列喉癌干細胞相關的研究：從Hep-2喉癌細胞株與人實體瘤組織中成功分離、鑒定并擴增了喉癌干細胞，構建了喉癌干細胞裸鼠成瘤模型，在喉癌干細胞耐藥/輻射耐受機制方面取得了部分研究成果。本研究在前期研究的基礎上進一步從基因角度深入研究喉癌干細胞放射抗拒的機制。

miRNA作為一類廣泛存在的非蛋白編碼的小分子RNA，通過轉錄后水平調節(jié)基因的表達而參與調控一系列的生命活動，包括細胞增殖、生長發(fā)育、器官形成、造血、凋亡，甚至腫瘤發(fā)生。特異性miRNA在腫瘤干細胞的細胞特性方面起獨特而重要的調控作用，如對輻射耐受基因的調控作用?？梢酝茢啵派涮禺惖膍iRNA對腫瘤干細胞放射抗拒相關基因發(fā)揮著同樣調控作用?；谏鲜龇治?，本研究對制備的模擬放療前后喉癌干細胞的純化miRNA雜交后經Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號，挑選2倍差異表達miRNA，結果發(fā)現(xiàn)明顯升高2倍以上的miRNA有3條，明顯降低2倍的有15條。國內學者運用基因芯片技術對miRNA在喉癌組織與正常組織中表達譜的差異進行了篩選，結果發(fā)現(xiàn)有13種miRNA在喉癌組織中的水平較正常組織有顯著差異；其中mir-let-7a、miR-203、miR-205、miR-21、miR-98和miR-16-1的表達水平在腫瘤組織中升高，miR-100、miR-l-2、miR-122a、miR-143、miR-145、miR-26a-1和miR-34c等7種miRNA在腫瘤組織中的表達水平降低。Amin等[10]對人類癌細胞多種miRNA在放射中的反應作了研究，發(fā)現(xiàn)在人宮頸腺癌傳代細胞系中，miR-21和miR-17-5p隨著照射時間的延長，表達增加；在人結腸癌HCT1 16細胞中，照射后miR-21和miR-17-5p表達都增強，但在人乳腺癌SKBR3細胞和人前列腺癌PC3細胞中卻沒有發(fā)生此現(xiàn)象。這說明特異的miRNA表達水平在照射后發(fā)生的變化具有細胞特異性。但目前尚無喉癌干細胞放療前后的miRNA的表達差異研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的這些明顯差異的miRNA為喉癌干細胞放射抗拒相關的miRNA。這可能為解決喉癌放療抗拒難題，研發(fā)新型高效的放療增敏劑，提高放療療效提供重要基礎資料。

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Screening of radioresistance-related miRNA from laryngeal cancer stem cells

DUAN Guangliang,DAI Huiping,TANG Tingting,et al. Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou 310015,China

Objective To screen radioresistance-related miRNA from laryngeal cancer stem cells. Methods Laryngeal cancer Hep-2 cells were cultured in SFM containing growth factor,and cancer stem cells(CD133+CD44+)were detected and isolated with flow cytometry.The isolated laryngeal cancer stem cells were exposed to high energy X-ray.The differentially expressed miRNA(2-fold)were screened with miRNAbiologicalchips in irradiated and non-irradiated laryngealcancer stem cells. Results Overtop 91%CD133+CD44+cells were harvested by FACS.The miRNAs of2-fold differentialexpression were successfully screened from irradiated stem cells. Conclusion Laryngeal cancer stem cells have been isolated from Hep-2 cells,and miRNAs related to radioresistance have been screened from laryngealcancerstem cells.

SFM miRNA Side population Radiotherapy

2015-06-29）

（本文編輯：李媚）

2012年杭州市科技計劃引導項目[杭科計（2012）259號（17）]

310015 杭州師范大學附屬醫(yī)院腫瘤診治中心

段廣亮，E-mail:dglzx333@163.com