miR-99a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的負(fù)向調(diào)控機(jī)制研究

張瑋 陳羅泉 葉治國(guó) 王青青

●論 著

miR-99a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的負(fù)向調(diào)控機(jī)制研究

張瑋 陳羅泉 葉治國(guó) 王青青

目的 探討miR-99a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響，并初步分析其影響乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的可能分子機(jī)制。方法 利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7中miR-99a的表達(dá)。運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法分別將miR-99a模擬物（miR-99a mimics）、miR-99a抑制物（miR-99a inhibitors）以及相應(yīng)對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞，通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲力；采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-99a的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 （1）高轉(zhuǎn)移潛能的MDA-MB-231細(xì)胞中miR-99a表達(dá)明顯低于低轉(zhuǎn)移潛能的MCF-7細(xì)胞，劃痕實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染miR-99a mimics的與轉(zhuǎn)染control mimics的MDA-MB-231細(xì)胞比較遷移能力顯著減弱（P＜0.05），而MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitors后遷移能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。（2）Transwell的侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miR-99a mimics后MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱（P＜0.01）；MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitors后遷移能力增強(qiáng)（P＜0.01），而侵襲能力基本不變（P＞0.05）。（3）生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)微管相關(guān)蛋白（MTMR3）是miR-99a的靶點(diǎn)，實(shí)時(shí)定量PCR和3'UTR熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了該靶點(diǎn)。（4）干擾了MTMR3后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。結(jié)論 （1）miR-99a對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。（2）miR-99a可能通過(guò)靶向于MTMR3發(fā)揮其對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。

乳腺癌 miR-99a 侵襲 遷移 MTMR3

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥之一，也是引起女性癌癥患者死亡的第二大癌癥（僅次于肺癌）[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是引起乳腺癌患者死亡的主要原因。對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制的深入了解可為研究抗癌策略提供新的思路。miRNA是長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它通過(guò)與靶基因的3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合來(lái)抑制靶基因mRNA的翻譯或降解靶基因的mRNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[2-4]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，多種miRNA在腫瘤的侵襲和遷移過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5-7]。miR-99a是miR-99家族中的一員，目前有研究表明miR-99a能顯著抑制肺癌和口腔癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[8-14]，但其是否也參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移文獻(xiàn)報(bào)道少見(jiàn)。因此，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-99a模擬物（miR-99a mimics）提高乳腺癌細(xì)胞中miR-99a的活性，轉(zhuǎn)染miR-99a抑制物（miR-99a inhibitors）抑制乳腺癌細(xì)胞中miR-99a的活性，以探討miR-99a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-99a的靶基因并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，初步分析miR-99a影響乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（低轉(zhuǎn)移潛能）和MDA-MB-231（高轉(zhuǎn)移潛能）（美國(guó)ATCC公司），人胚腎細(xì)胞系HEK-293（中科院上海細(xì)胞所），RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS（美國(guó)Hyclone公司），OPTI-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco公司），Invitrogen LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó) Invitrogen公司），Transwell侵襲小室（美國(guó)Corning公司），基質(zhì)膠（美國(guó) BD公司），miR-99a mimics及control mimics、微管相關(guān)蛋白（MTMR3）siRNA（上海吉瑪公司），DAPI染料（瑞士羅氏公司），PCR引物序列（生物工程上海股份有限公司），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒中量制備試劑盒（美國(guó)AxyGen公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶（大連寶生物工程公司），對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK、Dual-LuciferaseR報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)、熒光發(fā)光測(cè)定儀（美國(guó)Promega公司），微量移液器、低溫臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），顯微圖象采集系統(tǒng)（日本尼康公司），PCR儀、CFX-96實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和接種 MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基置于37℃恒溫、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1d將培養(yǎng)好的MDA-MB-231細(xì)胞鋪于6 cm培養(yǎng)皿中，使其匯合度在60%～70%，置于37℃恒溫、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)染 miR-99a mimics及對(duì)照（control mimics），miR-99a inhibitors及對(duì)照（control inhibitors），MTMR3 siRNA及對(duì)照（control siRNA）干粉離心后配制成終濃度為20μmol/L的工作液。鋪板24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Invitrogen LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h將培養(yǎng)液更換成正常的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 miR-99a和MTMR3表達(dá)水平的檢測(cè) 按照Takara公司實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒的說(shuō)明提取RNA，并將抽提的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析miR-99a和MTMR3的表達(dá)，分別以U6和-actin作為內(nèi)參，相關(guān)引物序列如下。miR-99a逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAGA-3′；miR-99a上游引物：5′-GCAACCCGTAGATCCGAT-3′；miR-99a下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物（同時(shí)作為U6逆轉(zhuǎn)錄引物）：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；MTMR3上游引物：5′-CCCAATGGGGGAGACCTTTC-3′；MTMR3下游引物：5′-CAGCCTCCTCCTTTAGCTCG-3′；-actin上游引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′；-actin下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)

1.5.1 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，待細(xì)胞豐度達(dá)到90%時(shí)，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓12h，然后每個(gè)平皿用20μl的小槍頭劃一條劃痕，在顯微鏡下取劃痕處幾個(gè)不同視野拍照（0h），37℃恒溫、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)并每隔24h拍照，然后分析圖片中不同視野劃痕的寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.2 Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)5×104鋪于24孔Transwell小室，每孔鋪200μl細(xì)胞，然后在板孔中加入600μl完全培養(yǎng)基，小室中補(bǔ)加 200μl無(wú)血清培養(yǎng)基。其中侵襲實(shí)驗(yàn)在小室接種細(xì)胞前一晚將Matrigel（基質(zhì)膠）無(wú)血清DMEM-H培養(yǎng)基稀釋成濃度為1∶7，每個(gè)侵襲小室加60μl，而遷移實(shí)驗(yàn)不加基質(zhì)膠。37℃恒溫、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，侵襲實(shí)驗(yàn)36h后（遷移實(shí)驗(yàn)24h后）取出小室用DAPI染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取8個(gè)低倍視野（×100）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 miR-99a靶基因預(yù)測(cè) 采用TargetScan、PicTar4和miRanda 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miR-99a檢索，預(yù)測(cè)其靶基因。

1.6.1 靶基因載體的構(gòu)建與鑒定 從TargetScan網(wǎng)站上獲取MTMR3 mRNA 3′UTR與miR-99a結(jié)合的序列，設(shè)計(jì)目標(biāo)引物序列（MTMR3），在5′端添加SpeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)連接之用。具體引物序列如下（下劃線為酶切位點(diǎn)SpeⅠ和HindⅢ）：MTMR3上游引物：5′-GGACTAGTGGGAAGGTTGGAGAAGAG-3′；MTMR3下游引物：5′-CCCAAGCTTGAGTCGGAAGGCTATCTG-3′。兩條寡核苷酸退火，作為與pMIR-REPORT TM luciferase質(zhì)粒（pMIR-Luc，為帶熒光素酶基因的載體）連接的插入片段，空載體PMIR-Luc雙酶切后，與插入片段連接過(guò)夜。將重組質(zhì)粒PMIR-Luc-MTMR3轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，挑選陽(yáng)性單菌落過(guò)夜搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后，由Invitrogen公司測(cè)序正確后使用。

案例1：學(xué)生到學(xué)校生物園觀察植物，回到教室后遭到了教師的質(zhì)問(wèn)：為什么要到那兒去？教師的本意是讓學(xué)生明白，我們身邊到處都有可供觀察的植物，但是他的質(zhì)問(wèn)已構(gòu)成了對(duì)學(xué)生自主行為的一種干預(yù)，這或許是教師權(quán)威主義的瞬間行為。

1.6.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性檢測(cè) 轉(zhuǎn)染前24h將2×105/ml的人胚腎細(xì)胞系HEK-293接種于96孔板，每孔加100μl無(wú)抗1640培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度至培養(yǎng)板底部的75%～80%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分4組（pMIR-empty+control mimics組、pMIR-empty+miR-99a mimics組、pMIR-MTMR3+control mimics組、pMIR-MTMR3+miR-99a mimics組），各組中均轉(zhuǎn)入對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK。按每孔量25μl opti-MEM培養(yǎng)基稀釋0.5μl LipofectmineTM2000脂質(zhì)體，輕柔混合，室溫靜置5min；按每孔用量25μl opti-MEM培養(yǎng)基稀釋0.2μg報(bào)告基因載體、0.01 μg pMIR-TK和0.375μl寡核苷酸，輕柔混合；將兩者混合，室溫孵育20min。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別將50μl質(zhì)粒DNA-寡核苷酸-轉(zhuǎn)染試劑混合物加至96孔板中，稍微震蕩混勻，4h更換1640培養(yǎng)基，37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。按照 Dual-LuciferaseR報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，在熒光發(fā)光儀上檢測(cè)得到各組螢火蟲(chóng)熒光素酶活性值（F）和海腎熒光素酶活性值（R），以R為內(nèi)參，取F/R為相對(duì)活性值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞遷移能力及miR-99a表達(dá)水平的比較 見(jiàn)表1。

表1 MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞遷移能力及miR-99a表達(dá)水平的比較

由表1可見(jiàn)，MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)傷口愈合率顯著高于MCF-7細(xì)胞，而miR-99a表達(dá)水平顯著低于MCF-7細(xì)胞。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-99a mimics后MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化 見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-99a mimics后MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化

由表2可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染miR-99a mimics后MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)傷口愈合率、侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)中侵出小室的細(xì)胞數(shù)均顯著低于轉(zhuǎn)染control mimics后的MDA-MB-231細(xì)胞。劃痕、侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果的代表性照片見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitors后MCF-7細(xì)胞遷移能力的變化 見(jiàn)表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitors后MCF-7細(xì)胞遷移能力的變化

由表3可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitors后的MCF-7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)傷口愈合率、遷移實(shí)驗(yàn)中侵出小室的細(xì)胞數(shù)均顯著高于轉(zhuǎn)染control mimics后的MCF-7細(xì)胞，因侵襲實(shí)驗(yàn)中MCF-7細(xì)胞幾乎沒(méi)有侵襲能力，即使轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitors后侵襲能力有輕微上升，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），故本研究未顯示結(jié)果。

同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-99a mimics后的MDA-MB-231細(xì)胞的MTMR3表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染control mimics后的MDA-MB-231細(xì)胞（P＜0.01），見(jiàn)圖2c。為驗(yàn)證MTMR3對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移的調(diào)控作用，利用MTMR3的siRNA敲減其在MDA-MB-231中的表達(dá)，再進(jìn)行Transwell的侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2d、 2e，轉(zhuǎn)染MTMR3 siRNA后的MDA-MB-231的侵襲和遷移能力顯著低于轉(zhuǎn)染control siRNA后的MDA-MB-231細(xì)胞（均P＜0.01）。

圖2 MTMR3靶基因預(yù)測(cè)

3 討論

近年來(lái)，乳腺癌的診斷和治療取得了一定的進(jìn)展，但是乳腺癌患者依然存在著轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后不良以及死亡的風(fēng)險(xiǎn)，有一半以上的乳腺癌患者在接受化療或者激素藥物治療以后仍會(huì)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移性疾病，所以如何抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移是降低乳腺癌患者病死率的關(guān)鍵。miRNA是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的非編碼RNA，它通過(guò)與靶基因的3′UTR結(jié)合來(lái)抑制靶基因mRNA的翻譯或者降解靶基因mRNA進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。它在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育、造血、器官形成、細(xì)胞分化、增殖、凋亡，甚至腫瘤發(fā)生[15]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道多種miRNA在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展的不同過(guò)程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，包括表皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞的干性以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[16-17]。

研究表明，miR-99a在包括前列腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肺癌、食管癌和口腔癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)，miR-99a可能發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的功能。其中Cui等[11]發(fā)現(xiàn)miR-99a能夠引起腎癌細(xì)胞的G1期細(xì)胞周期阻滯，Chen等[12]報(bào)道m(xù)iR-99a下調(diào)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和H1299細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，但對(duì)其機(jī)制沒(méi)有深入研究。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)miR-99a可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。

MCF-7和MDA-MB-231是常用的乳腺癌細(xì)胞系，MCF-7為低/無(wú)轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系，而MDA-MB-231具高轉(zhuǎn)移潛能。本研究比較MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中miR-99a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-99a的表達(dá)顯著低于MCF-7細(xì)胞。為了明確miR-99a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的調(diào)控作用，本研究將miR-99a mimics轉(zhuǎn)染至高轉(zhuǎn)移性的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，觀察其在MDA-MB-231細(xì)胞中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-99a mimics來(lái)過(guò)表達(dá)miR-99a能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲及遷移能力。MCF-7細(xì)胞中miR-99a的表達(dá)水平顯著高于MDA-MB-231細(xì)胞，將miR-99a inhibitors轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，抑制miR-99a在MCF-7細(xì)胞中的活性。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 miR-99a inhibitors后的MCF-7細(xì)胞劃痕愈合速度顯著高于轉(zhuǎn)染control mimics后的MCF-7細(xì)胞。同時(shí)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitors后的MCF-7細(xì)胞侵出小室的細(xì)胞數(shù)顯著增多，說(shuō)明敲減miR-99a后，無(wú)轉(zhuǎn)移潛能的MCF-7細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。但體外Transwell的侵襲實(shí)驗(yàn)中MCF-7細(xì)胞幾乎沒(méi)有侵襲能力，即使轉(zhuǎn)染miR-99a inhibitor后其侵襲能力有輕微上升，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明單獨(dú)miR-99a的降低并不足以使其獲得侵襲能力，可能miR-99a在調(diào)控細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用。MDA-MB-231和MCF7兩株乳腺癌細(xì)胞本身就存在著很多基因和蛋白表達(dá)的不同，包括前者為ER-PR-，后者則為ER+PR-[18]，這些復(fù)雜的因素共同決定著腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，以及對(duì)治療的敏感性，而在體內(nèi)，腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境更是通過(guò)各個(gè)層次對(duì)其轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[19]，因此還需要更深入細(xì)致的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步揭示miRNA在其中發(fā)揮的調(diào)控作用。

本研究采用TargetScan、PicTar4和miRanda 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miR-99a靶基因的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MTMR3可能是與細(xì)胞侵襲、遷移相關(guān)的蛋白，是miR-99a的可能靶基因。最近有報(bào)道MTMR3可以通過(guò)活化Rac-1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[20]。本研究亦發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-99a后能夠在mRNA水平上明顯抑制MTMR3的表達(dá)。接著本研究又通過(guò)miR-99a mimics與MTMR3-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)pMIR-MTMR3+miR-99a mimics組的熒光素酶相對(duì)活性減弱，表明MTMR3確實(shí)是miR-99a的靶基因。Kuo等[14]的研究發(fā)現(xiàn)miR-99a能夠在口腔癌細(xì)胞中通過(guò)靶向MTMR3來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，但是miR-99a是否也是通過(guò)靶向于MTMR3來(lái)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲和遷移能力？本研究用siRNA敲低MTMR3在MDA-MB-231中的表達(dá)后，MDA-MB-231的侵襲和遷移能力顯著減弱。

綜上所述，本研究通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)了miR-99a能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，同時(shí)通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)MTMR3是miR-99a的靶點(diǎn)，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了靶點(diǎn)，表明miR-99a可能通過(guò)靶向于MTMR3發(fā)揮對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的負(fù)向調(diào)控作用。上述結(jié)果為揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及研發(fā)抑制轉(zhuǎn)移的策略提供了新的思路，但是miR-99a是否確實(shí)通過(guò)靶向于MTMR3來(lái)調(diào)控乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力，還需要在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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Inhibitory effects of miR-99a on invasion and migration of human breast cancer cells

ZHANG Wei,CHEN Luoquan,YE Zhiguo,et al.Department of Oncology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the effect ofmiR-99a on invasion and migration potentialofhuman breast cancer cells and its possible mechanism. Methods The expression level of miR-99a was detected in human breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7 by qRT-PCR.Human breast cancer MDA-MB-231 cells were transfected with miR-99a mimics and controlmimics by Lipofectamine.Cellinvasion potentialwas evaluated by Transwellinvasion assay;cellmigration was detected by Transwellmigration assay and wound healing assay．The possible targetgenes ofmiR-99a were forecasted by bioinformatics tools and the reliability of these genes was analyzed. Results Remarkable inhibition of cell migration was detected in MDA-MB-231 cells transfected with miR-99a mimics by wound healing and Transwellmigration assay,compared to cells transfected with control mimics.MCF-7 cells transfected with miR-99a inhibitors showed increased migration,compared to cells transfected with control inhibitors.Transfection of miR-99a mimics into MDA-MB-231 cells led to a significant decrease in cell invasion as detected by Transwell invasion assay.Myotubularin related protein 3 (MTMR3)was forecasted by bioinformatics tools as a target of miR-99a, which was verified by RT-qPCR and 3'UTR luciferase reporter assays.Knock down of MTMR3 in MDA-MB-231cells inhibited cell migration and invasion.Conclusion miR-99a negatively may regulate the invasion and migration potentialofhuman breast cancer cells through targeting MTMR3．

Breast cancermiR-99a Invasion Migration MTMR3

2015-08-17）

（本文編輯：李媚）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373115）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院，杭州市腫瘤醫(yī)院（張瑋）；浙江大學(xué)免疫學(xué)研究所（陳羅泉、葉治國(guó)、王青青）

王青青，E-mail：wqq@zju.edu.cn