微生物濁度法測(cè)定硫酸新霉素效價(jià)方法探討

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(衡陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·技術(shù)與方法·

微生物濁度法測(cè)定硫酸新霉素效價(jià)方法探討

江勛，彭婷婷

(衡陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的建立濁度法測(cè)定硫酸新霉素效價(jià)含量的方法并驗(yàn)證方法的可行性。方法建立濁度法測(cè)定硫酸新霉素效價(jià)含量的方法，以金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)為試驗(yàn)菌株，選取硫酸新霉素溶液0.40、0.60 U/mL兩個(gè)劑量濃度(劑間比1∶1.5)，以抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ培養(yǎng)2～4 h，使用WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀(測(cè)定波長(zhǎng)530 nm)測(cè)定吸光度進(jìn)行計(jì)算，并與管碟法測(cè)定結(jié)果相比較。結(jié)果硫酸新霉素溶液濃度在0.10～1.00 U/mL的范圍內(nèi)，濃度與吸收度呈較好的線性關(guān)系，符合技術(shù)要求?；厥章蕿?00.17%，精密度試驗(yàn)濁度法的RSD為0.22%(n=6)，優(yōu)于管碟法的RSD 1.28%(n=6)。結(jié)論濁度法操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、可信限率低，可應(yīng)用于硫酸新霉素效價(jià)含量測(cè)定。

硫酸新霉素； 效價(jià)含量測(cè)定； 濁度法； 管碟法

硫酸新霉素(Neomycin Sulfate)，為新霉素的硫酸鹽，易溶于水，屬氨基糖苷類抗生素，為廣譜抗生素，對(duì)大腸埃希菌、葡萄球菌屬(甲氧西林敏感株)、棒狀桿菌屬、克雷伯菌屬、變形桿菌屬等腸桿菌科細(xì)菌有良好抗菌作用，目前市面所售產(chǎn)品主要為新霉素B和新霉素C的混合物。新霉素全身用藥具有顯著的腎毒性和耳毒性，因此目前僅限于口服或局部應(yīng)用，主要應(yīng)用于結(jié)腸手術(shù)前準(zhǔn)備及肝昏迷時(shí)輔助治療等。

抗生素微生物檢定法是以抗生素的抗菌效能作為衡量其含量的方法，可直觀地反映其抗菌活性,顯示其臨床特點(diǎn)[1]。目前國(guó)內(nèi)主要采用管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)，其具有直觀、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛采用，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，影響結(jié)果的因素較多，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)操作不當(dāng)就會(huì)造成很大誤差，導(dǎo)致整組試驗(yàn)失敗。而在國(guó)際上，抗生素效價(jià)測(cè)定方法則以管碟法和濁度法并用。相比管碟法而言，濁度法具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、人為影響因素少、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度與精密度高等優(yōu)點(diǎn)[2]。2010年版《中國(guó)藥典》中抗生素微生物檢定法收載了35個(gè)品種測(cè)定的管碟法和22個(gè)品種測(cè)定的濁度法，對(duì)新霉素濁度法的測(cè)定效價(jià)濃度范圍標(biāo)注為0.92～1.50 U/mL，但并未確定具體的劑間比[3]。本文采用濁度法測(cè)定硫酸新霉素的效價(jià)，使用0.40、0.60 U/mL濃度的二劑量法(劑間比1∶1.5)，以拉丁方陣排列，實(shí)行全自動(dòng)化培養(yǎng)操作，進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，并與傳統(tǒng)的管碟法進(jìn)行比較，以期建立一種簡(jiǎn)單、可信的硫酸新霉素效價(jià)測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品(130309-200811，效價(jià)645 U/mg)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ、培養(yǎng)基Ⅲ(由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供)、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀。

1.2儀器WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀(測(cè)定波長(zhǎng)530 nm)、ZY-300IV多功能微生物抑菌圈測(cè)量?jī)x，由北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司提供；Mettler AE240電子分析天平；高壓滅菌鍋、恒溫干燥箱。

1.3濁度法實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備 取金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在35～37 ℃培養(yǎng)20～22 h。臨用時(shí)，用0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，制成金黃色葡萄球菌菌懸液，備用[3]。

1.3.2 Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基的制備 按照培養(yǎng)基的標(biāo)示稱取并加適量的水進(jìn)行配制(pH 7.0～7.2)，滅菌。

1.3.3 pH 7.8磷酸鹽緩沖液的制備 取磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O) 5.59 g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.41 g ，溶于1 000 mL水，滅菌，即得。

1.3.4 抗生素溶液的配制 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，加滅菌水制成濃度為1 000 U/mL的溶液，用pH 7.8的磷酸鹽緩沖液分別稀釋到0.40、0.60 U/mL。(本實(shí)驗(yàn)選擇劑間比為1∶1.5，抗生素最終濃度為0.40、0.60 U/mL，該濃度可以根據(jù)培養(yǎng)結(jié)束后其吸收度大小在線性實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。)

1.3.5 抗生素溶液的分裝 取高溫滅菌的石英比色管16支，分配dS1、dS2、dT1及dT2各4支，分別作好標(biāo)記，按照拉丁方陣順序排列。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液dSl、dS2及供試品溶液dT1、dT2各1.00 mL按編號(hào)加到相應(yīng)的比色皿中，加入溶液時(shí)，均應(yīng)在比色管的標(biāo)記處沿管壁加入，以便培養(yǎng)基將沾在管壁上的抗生素溶液沖入管內(nèi)。

1.3.6 預(yù)實(shí)驗(yàn) 接種試驗(yàn)菌量的確定需作預(yù)試驗(yàn)，取2.1的菌懸液適量進(jìn)行純菌培養(yǎng)(不加抗生素，僅加培養(yǎng)基)，使培養(yǎng)后(37 ℃，一般2～4 h)吸收度A在0.3～0.7之間。

1.3.7 培養(yǎng)基的分裝 將濁度法試驗(yàn)用的培養(yǎng)基，在接種試驗(yàn)菌后以每管9.00 mL加抗生素溶液的標(biāo)記處稍上方移入比色管中，沿管壁流入，并立即振搖，使抗生素溶液與培養(yǎng)基均勻混合。

1.3.8 培養(yǎng) 使用WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀在37 ℃培養(yǎng)2～4 h。

1.3.9 測(cè)量與計(jì)算 使用WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀選擇波長(zhǎng)530 nm進(jìn)行在線快速測(cè)量(每10 min測(cè)量一次)，并生成實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

2 結(jié) 果

2.1線性及其范圍實(shí)驗(yàn)精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，加滅菌水制成1 000 U/mL的溶液后用pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋到表1中相應(yīng)的濃度，按照濁度法操作在0.10～1.00 U/mL內(nèi)進(jìn)行線性及范圍實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。結(jié)果分析：相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5，說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(C)在0.10～1.00 U/mL的濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)一定時(shí)間(一般為2～3 h)后，所測(cè)得的培養(yǎng)皿的吸光度A與 lgC線性關(guān)系良好[4]。其中，0.40、0.60 U/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度分別為0.551 1、0.416 9(應(yīng)在0.3～0.7之間)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液接種菌種后濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)與吸光度(A)的線性關(guān)系

表1標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度及吸光度值

指標(biāo)0.10(U/mL)0.20(U/mL)0.30(U/mL)0.40(U/mL)0.50(U/mL)0.60(U/mL)0.80(U/mL)1.00(U/mL)lgC-1.0000-0.69897-0.52288-0.39794-0.30103-0.22185-0.096910.00000吸光度/A0.90120.75240.63290.55110.47690.41690.35120.2801

2.2回收率試驗(yàn)(自身對(duì)照法) 選擇90%、100%、110%三個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：取1 000 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液5.00 mL置于50 mL容量瓶中，加入pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得100 U/mL的溶液。分別取100 U/mL的溶液0.40 mL、0.60 mL置于100 mL容量瓶中，用pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得0.40、0.60 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為濁度法實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

90%處樣品溶液的制備：取1 000 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液4.50 mL置于50 mL容量瓶中，加pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得90 U/mL的溶液；分別取90 U/mL的溶液0.40 mL、0.60 mL置于100 mL容量瓶中，加pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得0.36、0.54 U/mL的樣品溶液，作為濁度法實(shí)驗(yàn)用90%點(diǎn)處的樣品溶液備用。

100%處樣品溶液的制備：同標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。

110%處樣品溶液的制備：取1 000 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液5.50 mL置于50 mL容量瓶中，加入pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得110 U/mL的溶液；分別取110 U/mL的溶液0.40 mL、0.60 mL置于100 mL容量瓶中，加入pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得0.44、0.66 U/mL的樣品溶液，作為濁度法實(shí)驗(yàn)用110%點(diǎn)處的樣品溶液備用。

按照濁度法操作過(guò)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液回收率測(cè)定(以高劑量抗生素溶液進(jìn)行計(jì)算)

濃度點(diǎn)理論濃度(U/mL)測(cè)得量(U/mL)回收率(%)平均回收率(%)偏離平行平均可信限90%0.540.5439100.720.537899.590.5421100.39100.23合格1.33合格1.97合格2.53100%0.600.6044100.730.6011100.180.598899.80100.24合格1.73合格2.61合格2.25110%0.660.6611100.170.657999.680.659899.9799.94合格2.35合格2.54合格2.50平均——100.17—2.20

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三點(diǎn)的總平均回收率為100.17%

2.3濁度法精密度實(shí)驗(yàn)取2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液為自身對(duì)照用濁度法進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，共測(cè)定6次，測(cè)得結(jié)果分別為644.09、647.03、646.31、647.46、646.49、648.22 u/mg，為標(biāo)示量的99.86%、100.31%、100.20%、100.38%、100.23%、100.50%。平均結(jié)果為646.32 u/mg，為標(biāo)示量的100.20%。6次測(cè)量結(jié)果的RSD為0.22%， 6次測(cè)量結(jié)果的可信限率分別為2.31%、1.97%、2.21%、1.95%、3.10%、1.61%，平均為2.19%。

2.4管碟法精密度實(shí)驗(yàn)分別取2.2中100 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液4.00 mL、8.00 mL于50 mL容量瓶中，加入pH 7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得8.0、16.0 U/mL(劑間比1∶2)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以自身對(duì)照用管碟法進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)[3]，使用抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ于37 ℃培養(yǎng)15 h，共測(cè)定6次，測(cè)得結(jié)果分別為642.10、655.64、641.32、642.51、633.39、633.07 u/mg，為標(biāo)示量的99.55%、101.65%、99.43%、99.61%、98.20%、98.15%。平均結(jié)果為641.34 u/mg，為標(biāo)示量的99.43%。6次測(cè)量結(jié)果的RSD為1.28%， 6次測(cè)量結(jié)果的可信限率分別為3.35%、2.64%、2.79%、2.88%、3.54%、3.10%，平均為3.05%。

3 討 論

本文采用濁度法測(cè)定硫酸新霉素的實(shí)驗(yàn)濃度劑間比為1∶1.5，在該濃度下實(shí)驗(yàn)靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定。其線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸新霉素溶液濃度在0.10～1.00 U/mL的范圍內(nèi)，濃度與吸收度呈較好的線性關(guān)系(R2=0.9955)，故應(yīng)在此濃度范圍之內(nèi)選定適宜的高低劑量。實(shí)驗(yàn)選取了0.40、0.60 U/mL兩個(gè)劑量濃度，并選擇90%、100%、110%三個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，平均回收率為100.17%，精密度試驗(yàn)濁度法的RSD為0.22%，優(yōu)于管碟法的RSD 1.28%。

以上結(jié)果表明：使用濁度法測(cè)定硫酸新霉素效價(jià)具有操作快捷簡(jiǎn)便、高靈敏度、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、人為影響因素較少、可信限率較低等優(yōu)勢(shì)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)一般培養(yǎng)2～4 h即可得出結(jié)果，其所采用的WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀具有全程恒溫控制、自動(dòng)振搖及定時(shí)測(cè)量、數(shù)據(jù)集成處理等一系列自動(dòng)化操作系統(tǒng)，相比于管碟法而言，不僅縮短了實(shí)驗(yàn)周期，而且提高了實(shí)驗(yàn)效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，因此可應(yīng)用于硫酸新霉素效價(jià)測(cè)定和制藥企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制等。

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R917

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.026

2015-05-06；

2015-08-28

蔣湘蓮)