殼寡糖對(duì)阿霉素腎病大鼠的作用研究?

劉玉英， 遲金華， 蔣志雯， 李 南， 楊 艷， 劉萬(wàn)順， 韓寶芹

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

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殼寡糖對(duì)阿霉素腎病大鼠的作用研究?

劉玉英， 遲金華， 蔣志雯， 李 南， 楊 艷， 劉萬(wàn)順， 韓寶芹??

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

本文探討殼寡糖(COS)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎病大鼠的作用效果。通過(guò)股靜脈注射阿霉素構(gòu)建阿霉素腎病大鼠模型，分別灌胃殼寡糖高、中、低劑量，檢測(cè)尿蛋白和腎臟重量系數(shù)的變化，血清肌酐、尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、IL-1β、TNF-α、TGF-β1的變化，以及腎臟組織中GSH-PX和SOD的變化，并對(duì)腎臟組織病理切片進(jìn)行觀察。結(jié)果表明COS各劑量組均能有效降低尿蛋白含量，明顯降低血清肌酐、尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、IL-1β、TNF-α、TGF-β1含量，顯著提高血清總蛋白、白蛋白含量以及腎組織中GSH-PX、SOD活力，COS作用劑量與效果間呈量效關(guān)系。說(shuō)明COS保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)和功能效果顯著，能夠提高腎臟抗氧化能力，抑制介導(dǎo)纖維化、炎癥反應(yīng)和腎小球硬化進(jìn)展的相關(guān)因子的合成或釋放，對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用。

殼寡糖；腎小球硬化；阿霉素

局灶性節(jié)段性腎小球硬化(Focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)是腎小球腎炎的一種，其病變特點(diǎn)為部分腎小球的小葉發(fā)生硬化，臨床主要表現(xiàn)為腎病綜合征。FSGS很少自動(dòng)緩解，多數(shù)呈慢性進(jìn)展，多發(fā)展為慢性腎小球腎炎，50%的患者在發(fā)病后十年內(nèi)發(fā)展為終末期腎小球腎炎[1]。近年來(lái)原發(fā)性FSGS發(fā)病率呈增高趨勢(shì)，因此對(duì)FSGS的治療研究具有重要意義。在1976年首次報(bào)道阿霉素誘導(dǎo)的腎病大鼠模型后，阿霉素腎病模型被廣泛和深入研究。阿霉素是一種經(jīng)典的嚙齒類(lèi)腎臟損傷誘發(fā)劑，導(dǎo)致的癥狀包括腎小球硬化、腎間質(zhì)炎癥和纖維化，能夠很好的模擬人類(lèi)FSGS[2]。

殼聚糖是一種天然陽(yáng)離子堿性多糖，主要提取自海洋生物的甲殼中，是目前海洋生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要研究材料。而殼寡糖(Chitosan oligosaccharides, COS)由殼聚糖經(jīng)酶水解制得，具有水溶性好，安全無(wú)毒、易吸收等優(yōu)點(diǎn)。COS具有很好的抗腫瘤、抗氧化、降血糖血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等的作用[3-4]。本文研究了COS對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病模型的作用，為FSGS的治療以及COS在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料 殼寡糖，由本實(shí)驗(yàn)室制備并純化，MALDI-TOF-MS圖譜分析其聚合度為2～6糖。

1.1.2 試劑 阿霉素，大連美侖生物技術(shù)有限公司。尿蛋白、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、白蛋白、BCA法蛋白定量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試盒以及Masson染液、糖原(PAS)染液試劑盒均為南京建成生物工程研究所。大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta1(TGF-β1)ELISA試劑盒、大鼠白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒，為武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠，雄性，體重(250±30)g，60只，由青島市藥品檢驗(yàn)所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(魯)2014 0002。在清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的商品飼料，飲用水為無(wú)菌蒸餾水，空氣清潔度為10 000級(jí)，相對(duì)濕度40%～80%，溫度20～25 ℃。

1.2 阿霉素腎病(AN)大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，術(shù)前12 h禁食不禁水，用3%戊巴比妥鈉(1 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，剔除手術(shù)部位多余被毛并消毒，在腹股溝處切開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉，暴露股靜脈，造模大鼠一次性股靜脈注射6 mg/kg的阿霉素構(gòu)建阿霉素腎病模型，注射后用無(wú)菌棉球壓迫血管片刻，縫合皮膚并消毒?？瞻讓?duì)照大鼠注射等量的生理鹽水，作空白對(duì)照組。

1.3 分組及給藥

建模后，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(N)，造模大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(M)、COS高劑量組(CH)、COS中劑量組(CM)、COS低劑量組(CL)，每組12只。COS高、中、低劑量組分別以0.3、0.2和0.1 g·kg-1·d-1的劑量灌胃給予COS，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量的蒸餾水，每日1次，連續(xù)灌胃8周。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6只，統(tǒng)一配置足量鼠糧和飲用水，每天定時(shí)清潔大鼠排泄物，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔。

1.4 實(shí)驗(yàn)觀察及指標(biāo)檢測(cè)

大鼠日常狀態(tài)觀察：觀察并記錄各組大鼠的飲食、排泄、精神狀態(tài)。

標(biāo)本采集及指標(biāo)測(cè)定：分別于造模前一天和灌胃后1、2、3、4、5、6、7、8周末，采集各組大鼠24 h尿液，定量檢測(cè)尿蛋白。在灌胃后的第4周、第8周末，大鼠禁食12 h，隨機(jī)取各組大鼠6只，分別稱(chēng)體重；腹主動(dòng)脈取血，收集血清，檢測(cè)血清肌酐、尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、IL-1β、TNF-α、TGF-β1；取雙側(cè)腎臟稱(chēng)重，計(jì)算大鼠腎臟重量系數(shù)；取0.55 g左側(cè)腎臟，剪碎，放入含有5 mL預(yù)冷生理鹽水的10 mL離心管中，用組織均漿機(jī)制備10%腎組織均漿，檢測(cè)SOD和GSH-PX活性；取部分右側(cè)腎組織于10%福爾馬林溶液中固定，HE染色、Masson染色和PAS染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠日常狀態(tài)大體觀察和體重變化

空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色有光澤，活動(dòng)靈敏，飲食水正常。造模大鼠注射阿霉素5 d左右開(kāi)始出現(xiàn)異常，阿霉素導(dǎo)致的副作用明顯，飲水?dāng)z食量明顯減少，腹瀉，動(dòng)作遲滯，精神萎靡，體重下降。造模大鼠中，約有30%在注射部位出現(xiàn)不同程度的腐爛，經(jīng)過(guò)持續(xù)的消毒處理，情況逐漸好轉(zhuǎn)。在2周左右，上述癥狀明顯改善，造模大鼠逐漸恢復(fù)正常。COS高劑量組和COS中劑量組較模型組恢復(fù)較快。

各組大鼠在第4、8周時(shí)的體重見(jiàn)圖1，M組、CH組、CM組、CL組大鼠體重均明顯低于N組(P<0.05)；第4、8周時(shí)，CH組、CM組大鼠體重均顯著高于M組(P<0.05)，表明COS對(duì)阿霉素所致毒副作用具有一定的緩解作用，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

(*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01; Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.)

圖1 大鼠體重變化

Fig.1 Change of body weight of the rats

2.2 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠尿蛋白和腎臟重量系數(shù)的影響

由表1可以看出，實(shí)驗(yàn)后1周，M組、CH組、CM組、CL組大鼠較N組大鼠24 h尿蛋白排泄量顯著升高(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)后3周，CH組較M組顯著降低(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)后4周，CH組、CM組較M組均顯著降低(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)后7周，CH組、CM組、CL組較M組均顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有降低阿霉素腎病大鼠尿蛋白的作用，并呈量效關(guān)系。

由表2可以看出，在4、8周時(shí)，M組、CH組、CM組、CL組大鼠較N組大鼠腎重量系數(shù)顯著升高(P<0.01)；4周時(shí)，CH組、CM組較M組顯著降低(P<0.01)；8周時(shí)，CH組、CM組、CL組較M組均顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有降低阿霉素腎病大鼠的腎臟重量系數(shù)的作用，并呈量效關(guān)系。

2.3 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠血清甘油三酯、總膽固醇、總蛋白和白蛋白的影響

COS對(duì)血脂的影響見(jiàn)表3。M組、CH組、CM組、CL組大鼠的血清甘油三酯和總膽固醇較N組大鼠顯著升高(P<0.01)；4周時(shí)，CH組較M組顯著降低(P<0.01)；8周時(shí)，CH組、CM組、CL組較M組均顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有降低阿霉素腎病大鼠血清甘油三酯和總膽固醇的作用，并呈量效關(guān)系。

時(shí)間TimeNMCHCMCL1周1w284．05±20．691321．83±112．92??1354．89±151．73??1298．22±132．60??1335．34±136．64??2周2w276．34±26．373397．27±136．46??3289．43±168．44??3357．04±195．14??3402．18±161．09??3周3w279．12±21．234342．25±160．48??3587．01±180．15??##4221．38±213．66??4384．77±319．17??4周4w280．91±24．495633．58±269．47??4351．63±241．59??##4960．20±156．47??#5473．87±328．38??5周5w283．97±22．876309．58±237．71??5120．69±225．48??##5761．55±133．46??#6154．21±294．47??6周6w281．46±19．046425．47±281．34??4781．51±176．67??##5424．37±207．58??##6022．97±330．67??7周7w280．52±26．546282．77±234．21??4476．36±172．79??##5195．82±186．77??##5822．54±151．22??#8周8w280．08±22．396349．77±327．22??4156．38±221．16??##4836．76±133．11??##5361．08±154．45??##

注：*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。

Note:Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01; Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.

組別Group4周4work8周8workN2．23±0．072．21±0．05M3．64±0．11??5．62±0．14??CH3．02±0．13??##2．86±0．14??##CM3．36±0．12??##3．27±0．11??##CL3．73±0．13??3．68±0．09??##

注：*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。

Note: Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.

COS對(duì)血清總蛋白和白蛋白的影響見(jiàn)表4。M組、CH組、CM組、CL組大鼠較N組大鼠的血清總蛋白和白蛋白顯著降低(P<0.01)；4周時(shí)，CH組、CM組較M組均明顯升高(P<0.05)；8周時(shí)，CH組、CM組、CL組較M組均顯著升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有提高阿霉素腎病大鼠血清總蛋白和白蛋白的作用，并呈量效關(guān)系。

2.4 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠腎功能的影響

由表5可見(jiàn)，M組、CH組、CM組、CL組大鼠的血清肌酐和尿素氮較N組大鼠顯著升高(P<0.01)；4周時(shí)，CH組大鼠的血清肌酐和尿素氮較M組大鼠顯著降低(P<0.05)；8周時(shí)，CH組、CM組、CL組大鼠的血清肌酐和尿素氮均較M組大鼠顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有降低阿霉素腎病大鼠血清肌酐和尿素氮的作用，并呈量效關(guān)系。

表3 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠血清甘油三酯和總膽固醇的影響±s，n=6)

注：*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。

Note: Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.

表4 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠血清總蛋白和白蛋白的影響±s，n=6)

注：*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。

Note: Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.

表5 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠血清肌酐和尿素氮的影響±s，n=6)

注：*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。

Note:Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.

2.5 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟組織中GSH-PX和SOD活力的影響

由表6可見(jiàn)，M組、CH組、CM組、CL組大鼠腎臟中GSH-PX和SOD的活性較N組大鼠明顯降低(P<0.01)；4周時(shí)，CH組大鼠腎臟中GSH-PX和SOD的活性與M組相比明顯升高(P>0.05)；8周時(shí)，CH組和CM組大鼠腎臟中GSH-PX和SOD的活性均較M組大鼠均顯著升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有提高阿霉素腎病大鼠腎組織GSH-PX和SOD活力的作用，并呈量效關(guān)系。

組別GroupGSH?PX/U4周4work8周8workSOD/U·mgprot-14周4work8周8workN818．83±17．59806．74±22．18377．46±12．65381．18±14．79M613．19±36．09??216．21±48．58??285．01±20．58??181．95±33．97??CH696．35±34．20??#525．76±32．57??##325．51±12．81??#303．38±22．75??##CM644．85±42．51??410．36±26．74??##303．93±22．04??256．06±25．59??##CL619．34±33．45??282．50±44．23??286．17±13．34??205．99±19．21??

注：*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。

Note:Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.

2.6 COS對(duì)阿霉素腎病大鼠血清中TGF-β1、IL-1β和TNF-α含量的影響

由圖2可知，M組、CH組、CM組、CL組血清中TGF-β1的含量較N組顯著升高(P<0.01)；4周時(shí)，CH組、CM組、CL組血清中TGF-β1的含量較M組無(wú)明顯差異(P>0.05)；8周時(shí)，CH組、CM組、CL組血清中TGF-β1的含量顯著低于M組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有降低阿霉素腎病大鼠血清TGF-β1含量的作用，并呈量效關(guān)系。

由圖3可知，M組、CH組、CM組、CL組血清中IL-1β的含量較N組顯著升高(P<0.01)；4周時(shí)，CH組血清中IL-1β的含量較M組顯著降低(P<0.05)；8周時(shí)，CH組、CM組、CL組血清中IL-1β的含量均顯著低于M組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明COS具有降低阿霉素腎病大鼠血清IL-1β含量的作用，并呈量效關(guān)系。

由圖4可知，M組、CH組、CM組、CL組血清中TNF-α的含量較N組顯著升高(P<0.01)；4周時(shí)，CH組、CM組血清中TNF-α的含量較M組顯著降低(P<0.05)；8周時(shí)，CH組、CM組、CL組血清中TNF-α的含量均顯著低于M組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明COS具有降低阿霉素腎病大鼠血清TNF-α含量的作用，并呈量效關(guān)系。

(*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.)

圖2 血清中TGF-β1的含量變化

Fig.2 The content of TGF-β1 in the serum

(*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.)

圖3 血清中IL-1β的含量變化

Fig.3 The content of IL-1β in the serum

(*P<0.05,**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較。Compared with blank control group*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group#P<0.05,##P<0.01.)

圖4 血清中TNF-α的含量變化

Fig.4 The content of TNF-α in the serum

2.7 大鼠腎臟組織病理學(xué)結(jié)果

HE染色結(jié)果見(jiàn)圖5，N組腎小球和腎小管均正常，未見(jiàn)異常改變。4周時(shí)，M組腎小管上皮細(xì)胞細(xì)小空泡變性廣泛，管腔內(nèi)出現(xiàn)一些蛋白管型，腎間質(zhì)水腫可見(jiàn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；CH組和CM組較M組病變明顯較輕，腎小管上皮細(xì)胞細(xì)小空泡變性呈現(xiàn)局灶性；CL組腎小管上皮細(xì)胞細(xì)小空泡變性廣泛，個(gè)別腎小管內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型。8周時(shí)，M組出現(xiàn)局灶性節(jié)段性腎小球硬化以及腎小球玻璃樣變，腎小管擴(kuò)張或萎縮均明顯，腎小管上皮細(xì)胞粗大空泡變性、脫落，管腔內(nèi)有大量的蛋白管型，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CH組和CM組與M組相比，無(wú)明顯的腎小球硬化及玻璃樣變，有個(gè)別的腎小管擴(kuò)張或萎縮現(xiàn)象，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性明顯改善，管腔內(nèi)可見(jiàn)少量的蛋白管型，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，尤其是CH組，藥物干預(yù)效果極其明顯；CL組藥物干預(yù)效果不明顯，較M組有輕微改善。

Masson染色結(jié)果見(jiàn)圖6，N組沒(méi)有纖維化現(xiàn)象。4周時(shí)，M組、CH組、CM組、CL組均可見(jiàn)輕微的腎間質(zhì)纖維化，M組相對(duì)嚴(yán)重；8周時(shí)，M組腎間質(zhì)纖維化明顯，呈彌漫性分布，CH組僅見(jiàn)輕微的腎間質(zhì)纖維化，CM組纖維化呈現(xiàn)局灶性，CL組纖維化呈輕度彌漫性。

PAS染色結(jié)果見(jiàn)圖7，N組腎小球血管袢薄而清晰，內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞數(shù)目正常。4周時(shí)，M組腎小球系膜基質(zhì)有增多現(xiàn)象，并且腎小球系膜輕度增生，CH組、CM組、CL組情況相似；8周時(shí)，M組腎小球系膜基質(zhì)嚴(yán)重增多，腎小球系膜重度增生，腎小球內(nèi)出現(xiàn)結(jié)節(jié)和團(tuán)塊狀區(qū)域，呈彌漫性分布，且伴有球囊粘連，CH組和CM組腎小球系膜增生較輕，系膜基質(zhì)有少量增多，藥物干預(yù)效果良好，CL組腎小球系膜中度增生，系膜基質(zhì)大量增多。

圖5 腎臟組織病理切片HE染色

圖6 腎臟組織病理切片Masson染色

圖7 腎臟組織病理切片PAS染色

3 討論

阿霉素是一種含醌的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤抗生素，其在腎臟內(nèi)代謝被還原為半醌型自由基，后者與氧反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，影響腎小球上皮細(xì)胞糖蛋白代謝，破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致基底膜濾過(guò)屏障的選擇性變化，引起蛋白尿，是經(jīng)典的腎小球疾病模型之一[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)股靜脈注射阿霉素構(gòu)建了阿霉素腎病大鼠模型，從預(yù)實(shí)驗(yàn)和本次實(shí)驗(yàn)均達(dá)到了很好的模擬效果。

蛋白尿是腎小球疾病早期即出現(xiàn)的常見(jiàn)癥狀，它反映了腎小球損傷的進(jìn)展情況，并介導(dǎo)了之后的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、纖維化[5]。COS高、中、低劑量組的尿蛋白含量分別在3、4、7周時(shí)明顯下降，較對(duì)應(yīng)模型組差異顯著，表明COS能夠有效修復(fù)腎小球損傷。低蛋白血癥和高脂血癥都是腎病綜合征的主要表現(xiàn)，由于大量蛋白質(zhì)從尿中丟失，機(jī)體內(nèi)蛋白合成和分解代謝失衡，機(jī)體所需蛋白得不到滿(mǎn)足，導(dǎo)致肝臟合成和分泌脂蛋白過(guò)度。模型組血清總蛋白和白蛋白含量顯著下降，血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著升高，低蛋白血癥和高脂血癥表現(xiàn)明顯。COS高劑量組在干預(yù)4周時(shí)即顯著提高了血清總蛋白和白蛋白的含量，降低了總膽固醇和甘油三酯的含量，干預(yù)8周時(shí)，COS各劑量組的血清總蛋白和白蛋白均顯著升高，總膽固醇和甘油三酯均顯著降低，與尿蛋白檢測(cè)結(jié)果相呼應(yīng)。血清肌酐和尿素氮在一定程度上反映了腎小球?yàn)V過(guò)功能的損害程度。COS高劑量組在干預(yù)4周時(shí)血清肌酐和尿素氮的含量顯著降低，較模型組差異顯著，說(shuō)明腎小球的濾過(guò)功能得到明顯改善，COS各劑量組在干預(yù)8周時(shí)血清肌酐和尿素氮的含量較模型組均顯著降低，表明COS對(duì)腎小球具有持續(xù)的修復(fù)和保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激在阿霉素腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。有研究表明，阿霉素進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，積聚在腎小球，對(duì)其清除的延遲導(dǎo)致持續(xù)的毒性浸潤(rùn)和自由基的大量釋放，直接導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[6-7]。SOD能有效清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷。GSH-PX使有毒的過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過(guò)氧化物的干擾和損害。COS高劑量組SOD和GSH-PX的活力在干預(yù)4周時(shí)較模型組明顯升高，COS高、中劑量組SOD和GSH-PX的活力在干預(yù)8周時(shí)較模型組均顯著升高，表明COS具有抗氧化應(yīng)激的作用。

TGF-β1是多種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要因子，它介導(dǎo)上皮細(xì)胞的分化、成纖維細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的合成等多個(gè)環(huán)節(jié)，與腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。TGF-β1不僅在腎小球系膜細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，還在內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)。在FSGS病變中，TGF-β1表達(dá)量顯著增加[8]。COS各劑量組在干預(yù)8周時(shí)血清TGF-β1的含量較模型組顯著降低，表明COS能夠有效抑制TGF-β1的合成，進(jìn)而阻止TGF-β1對(duì)腎臟在多方面的損害。

IL-1β是重要的前炎癥因子，可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)到腎組織內(nèi)，破壞正常組織結(jié)構(gòu)，最終引發(fā)腎小球硬化[9]。COS高劑量組在干預(yù)4周時(shí)血清IL-1β的含量即明顯降低，較模型組差異顯著，干預(yù)8周時(shí)COS各劑量組血清IL-1β的含量較模型組均顯著降低，表明COS在作用早期就能持續(xù)有效調(diào)控IL-1β的含量，減少其在炎癥方面以及對(duì)腎小球等的損傷。

TNF-α在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，它可促進(jìn)其它炎癥因子(IL-1、IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和生長(zhǎng)因子(TGF)的釋放，在介導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化、加劇腎損傷的過(guò)程中起著重要作用。TNF-α能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，刺激腎小球系膜細(xì)胞合成TGF-β，引起纖維蛋白沉積于腎小球[10]。COS高、中劑量組在干預(yù)4周時(shí)較模型組均顯著降低了血清中TNF-α的含量，在一定程度上間接減少了TGF-β1和IL-1β的含量，對(duì)于腎臟的保護(hù)具有重要意義。

綜上所述，COS能夠改善低蛋白血癥和高脂血癥，提高腎臟組織的抗氧化能力，抑制介導(dǎo)纖維化、炎癥反應(yīng)和腎小球硬化進(jìn)展的相關(guān)因子的合成或釋放，能一定程度修復(fù)腎小球損傷，對(duì)腎臟功能具有改善和保護(hù)作用，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯 高 蓓

Effects of Chitosan Oligosaccharides on Adriamycin Nephrosis in Rats

LIU Yu-Ying, CHI Jin-Hua, JIANG Zhi-Wen, LI Nan, YANG Yan, LIU Wan-Shun, HAN Bao-Qin

(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The effects of chitosan oligosaccharides(COS) on adriamycin nephrosis in rats were investigated. Adriamycin, which is a kind of classic rodent kidney damage inducer, was injected into femoral vein by syringe to make adrimycin nephrosis model in rats. And the rats of blank control group received normal saline by the same route. For the (COS)-treated adrimycin nephrosis groups, the rats were given a gavage of COS of high, middle and low doses respectively one time a day. The rats of Blank control group and model control group were given a gavage of distilled water with the equal amount. The study lasted a total of 8 weeks and urine samples of 24 hours were collected every one week. The body weight of the rats was recorded, and the blood and kidney of the rats were collected every 4 weeks. Serum, kidney tissue homogenate and kidney tissue paraffin section were made and preserved in certain conditions to prepare for corresponding detections. Urine protein, reflecting the progress of glomerular injury, was measured and kidney weight coefficient was caculated. The changes of serum creatinine, urea nitrogen, total cholesterol, triglyceride, total protein, albumin, TGF-β1, IL-1β and TNF-α were measured by corresponding kits, which indicated the changing situations of the structure and functions of kidney directly or indirectly. The activity of GSH-PX and SOD of the kidney were examined, both of which are very important antioxidant enzymes in the body. Histological changes were observed by light microscopy through three different pathological dyeing methods—hematoxin eosin(HE), periodic acid Schiff(PAS), and Masson’s trichrome stain. Results revealed that each dose of COS could apparently reduce the content of urine protein, and the level of serum creatinine, urea nitrogen, total cholesterol, triglyceride, TGF-β1, IL-1β and TNF-α, and significantly enhance the content of serum total protein and albumin and the activity of GSH-PX and SOD of the kidney tissue. In addition to this, the results presented an apparent dose effect between the therapeutic action to adrimycin nephrosis and the doses of COS. In conclusion, COS had certain protective effect to the kidney, which could effectively protect the structure and function of kidney, improve the antioxidation capacity of kidney, and inhibit the synthesis or release of relevant cytokines causing fibrosis, inflammatory reaction and glomerulosclerosis.

chitosan oligosaccharides; glomerulosclerosis; adriamycin

NSFC-山東聯(lián)合資助海洋研究中心項(xiàng)目(U1406402-5)；山東省計(jì)劃項(xiàng)目(2014ZZCX06203)資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China and the Government of Shandong Province Joint Fund Marine Science Research Center Project(U1406402-5); The Project of Shandong Province(2014ZZCX06203)

2016-02-18；

2016-03-22

劉玉英(1989-)，女，碩士生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與海洋生物材料。

?? 通訊作者：E-mail: baoqinh@ouc.edu.cn

R692.3+1；R931.77

A

1672-5174(2016)12-051-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20160021

劉玉英， 遲金華， 蔣志雯， 等. 殼寡糖對(duì)阿霉素腎病大鼠的作用研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 46(12): 51-59.

LIU Yu-Ying， CHI Jin-Hua, JIANG Zhi-Wen, et al. Effects of chitosan oligosaccharides on adriamycin nephrosis in rats[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(12): 51-59.