錦鯽Clock基因表達(dá)量分析中的內(nèi)參基因穩(wěn)定性比較

彭治桃,蔣國(guó)民,鄒 利,李金龍,程小飛,房麗娟,王曉清,劉 麗1,

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410153;3.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410153; 4.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410012)

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錦鯽Clock基因表達(dá)量分析中的內(nèi)參基因穩(wěn)定性比較

彭治桃1,2,蔣國(guó)民3,鄒 利3,李金龍3,程小飛3,房麗娟4,王曉清1*,劉 麗1,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410153;3.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410153; 4.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410012)

為研究錦鯽Clock基因表達(dá)量分析中的內(nèi)參基因穩(wěn)定性，采用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，并用Ge Norm 和 Norm Finder軟件對(duì)5個(gè)內(nèi)參基因(RPL13，GAPDH，18SrRNA，β-actin和RPS29)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，篩選出不同組織中最適合的內(nèi)參基因，以準(zhǔn)確定量Clock基因的相對(duì)表達(dá)水平.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)內(nèi)參基因中，18SrRNA在錦鯽的肌肉、心臟、肝臟中表達(dá)最穩(wěn)定，β-actin在腸中表達(dá)最穩(wěn)定，RPL13在腎中表達(dá)最穩(wěn)定；根據(jù)篩選的內(nèi)參基因定量Clock基因的相對(duì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，Clock基因在錦鯽肌肉中相對(duì)表達(dá)量最高，其次依次是肝臟、腎、腸，心臟中最低.本研究準(zhǔn)確定量Clock基因, 為錦鯽生物鐘節(jié)律機(jī)制的下一步研究奠定了理論基礎(chǔ).

內(nèi)參基因；qRT-PCR；錦鯽；Ge Norm程序；Norm Finder程序

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)因具有靈敏度高、重復(fù)性好以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于生物科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域.但這一技術(shù)能否準(zhǔn)確定量取決于很多因素，如實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)量、RNA質(zhì)量、cDNA第一鏈合成效率及內(nèi)參基因的選擇[1].其中，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，獲得更接近于目的基因特異性表達(dá)的真實(shí)值是基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵[2].內(nèi)參基因，也叫看家(持家)基因，是用來做內(nèi)部參照的基因, 因具有在各個(gè)組織和細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定的特點(diǎn)而作為目的基因的相對(duì)表達(dá)水平時(shí)的參照基因.一個(gè)理想的內(nèi)參基因要在不同組織、不同發(fā)育階段以及不同處理因素下都能體現(xiàn)恒定的表達(dá)水平.然而，現(xiàn)實(shí)中穩(wěn)定表達(dá)的基因幾乎不存在，因此選擇合適的內(nèi)參基因用于基因表達(dá)差異分析非常關(guān)鍵.Clock基因是一種生物鐘基因，在動(dòng)物的各個(gè)組織中廣泛表達(dá)[3]，在維持正常的近日節(jié)律中起著至關(guān)重要的作用.本研究選擇RPL13，GAPDH，18SrRNA，β-actin和RPS29共 5個(gè)候選內(nèi)參基因，采用 SYBR greenⅠqRT-PCR方法，利用Ge Norm程序和Norm Finder程序研究錦鯽Clock基因表達(dá)量分析中這5個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品采集于湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所原種中心，取平均體重為(50±5) g的健康錦鯽中不同組織，包括肌肉、肝臟、心臟、腸、腎共5個(gè).采樣前將錦鯽用 MS-222(80 mg/L)麻醉[4]，取樣時(shí)在放置有冰袋的解剖盤上進(jìn)行， 樣品采集后迅速置于液氮中保存，再轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱儲(chǔ)藏備用.

1.2 總 RNA提取和 c DNA合成

分別取100 mg 凍存組織樣品，按照 Trizol試劑法(Invitrogen公司, 美國(guó))提取總 RNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)28 S 和18 S rRNA的完整性進(jìn)行鑒定，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280的值，以檢測(cè)總RNA的純度和濃度.按照Prime Script TM reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程(TaKaRa公司,日本)，取2 μg總RNA合成cDNA第一鏈.置于-20 ℃ 備用.

1.3 Clock基因及內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)

選擇不同功能的5個(gè)常用內(nèi)參基因，即RPL13(核糖體蛋白基因L13)，GAPDH(3′-磷酸甘油醛脫氫酶)，18SrRNA(18 S核糖體RNA)，β-actin(β-肌動(dòng)蛋白基因)和RPS29(核糖體蛋白S29基因)進(jìn)行研究.根據(jù) NCBI 中已公布的錦鯽及與其同源性較高的序列，用 Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，并驗(yàn)證引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，引物合成和擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列測(cè)定由上海生工公司完成.

表1 Clock基因及內(nèi)參基因的引物序列

1.4 Clock基因及內(nèi)參基因qRT-PCR分析

qRT-PCR反應(yīng)在CFX96TMReal-Time System(BIO-RAD公司,美國(guó))中進(jìn)行.參照SYBR? Premix Ex Taq II( Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書，準(zhǔn)備反應(yīng)體系為熒光染料SYBR Premix 12.5 μL，cDNA 模板2.0 μL， Forward primer 1.0 μL，Reverse primer 1.0 μL，加無菌水補(bǔ)至總體積25 μL.反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性5 s, 65 ℃退火、延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)繪制溶解曲線：65～95 ℃，每0.1 s讀板一次.

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行初步處理，采用2ΔCT法進(jìn)行計(jì)算[5],即在Excel 中設(shè)定不同樣本中某一看家基因CT值最小者的表達(dá)量為1，其他樣本與此看家基因的相對(duì)表達(dá)量則為 2-ΔCT，將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入Ge Norm程序(http:∥medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/)計(jì)算內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M(M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定)，并通過看家基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析(Vn/(n+1))來判定內(nèi)參基因的最適數(shù)目[6].另外，應(yīng)用 Andersen 編寫的程序 Norm Finder算出表明穩(wěn)定程度的S值(S值越小，表達(dá)越穩(wěn)定)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因與Ge Norm程序分析結(jié)果進(jìn)行綜合比較，從而優(yōu)選出最佳內(nèi)參基因[6].公式為目的基因的表達(dá)量=2-ΔΔCT[7]，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對(duì)照組.采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較，P<0.05具有顯著性差異，所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SE)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性分析

圖1 組織總RNA電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis of total RNA in different tissues

提取5個(gè)組織的總RNA用1.2%的瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)28 S rRNA和18 S rRNA條帶清晰，沒有彌散現(xiàn)象，說明RNA的完整性良好,沒有降解(圖1).紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280比值為1.9～2.1，說明所提取的組織總RNA符合下一步實(shí)驗(yàn)質(zhì)量要求.對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行普通PCR驗(yàn)證，其擴(kuò)增片段的特異性和準(zhǔn)確性均很好.熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線指數(shù)期較明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性較好，熔解曲線的熔點(diǎn)峰較窄而尖，無雙峰現(xiàn)象，說明產(chǎn)物特異性較好(圖2).

2.2 內(nèi)參基因的表達(dá)譜分析

CT值與基因的表達(dá)量成反比，即CT值越大,表達(dá)量越小,反之亦然.用Sigma Plot 10.0軟件對(duì) 20個(gè)樣品 5 種內(nèi)參基因的表達(dá)水平(CT)進(jìn)行分析(圖3)，圖中箱代表四分位數(shù)，即分別代表第25 百分位數(shù)和第75百分位數(shù)，箱中間的線代表中位數(shù)，上下線分別代表最大值和最小值.結(jié)果顯示7個(gè)看家基因的CT值在17～33之間,其中18SrRNA，RPL13和β-actin的CT值較低，RPS29和GAPDH的CT值較高,說明各內(nèi)參基因在錦鯽中的表達(dá)量不同，而且差別比較大.

圖2 熒光定量PCR圖(A:擴(kuò)增曲線;B:溶解曲線)Fig.2 Amplification curve (A) and Melting curve (B) of qRT-PCR

圖3 qRT-PCR中內(nèi)參基因的CT值分布Fig.3 The CT value distribution of five reference genes in qRT-PCR

2.3 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性比較

圖4顯示，通過Ge Norm 軟件分析得出M值來評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性不同.M值從大到小(基因穩(wěn)定性從最不穩(wěn)定到最穩(wěn)定)依次為：肌肉中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13和18SrRNA；心臟中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13和18SrRNA；肝臟中，RPS29，GAPDH，β-actin，18SrRNA和RPL13；腸中，18SrRNA，RPS29，GAPDH，β-actin和RPL13；腎中，RPS29，18SrRNA，β-actin，RPL13和GAPDH，說明肌肉、心臟和肝臟的2個(gè)最適合內(nèi)參基因均為RPL13和18SrRNA，而腸為β-actin和RPL13，腎為RPL13和GAPDH.通過Ge Norm標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)5個(gè)內(nèi)參基因在5個(gè)組織中，Vn/(n+1)均小于1.5，說明有n個(gè)基因可以作為qRT-PCR 定量分析的內(nèi)參基因，無需再選擇使用≥n+1個(gè)基因作為內(nèi)參.

圖4 肌肉(A)，心臟(B)，肝臟(C)，腸(D)，腎(E)中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性比較(Ge Norm 分析和 Norm Finder分析)Fig.4 Expression stability of reference genes in different tissues by Ge Norm and Norm Finder(A, Muscle; B, Heart; C, Liver; D,Intestine; E,Kidney)

通過Norm Finder 軟件分析得出，S值從大到小(基因穩(wěn)定性從最不穩(wěn)定到最穩(wěn)定)依次為：肌肉中，β-actin，GAPDH，RPS29，RPL13，18SrRNA；心臟中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13，18SrRNA；肝臟中，GAPDH，β-actin，RPS29，RPL13，18SrRNA；腸中，RPS29，18SrRNA，GAPDH，RPL13，β-actin；腎中，RPS29，18SrRNA，β-actin，GAPDH，RPL13. Ge Norm軟件分析的結(jié)果得出最適合的內(nèi)參基因數(shù)，而Norm Finder 軟件分析能選出穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因.因此，綜合比較 2 種軟件的評(píng)價(jià)結(jié)果，篩選出肌肉、心臟、肝臟中最佳內(nèi)參基因均為18SrRNA，而腸中最佳內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，腎中的為RPL13.

2.4 Clock基因的表達(dá)水平

圖5 錦鯽Clock基因相對(duì)表達(dá)水平 Fig.5 Relative expression levels of Clock genes in Carassius auratus

根據(jù)錦鯽內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果，肌肉、心臟、肝臟以18SrRNA作為內(nèi)參基因，腸以β-actin和腎以RPL13作為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR方法進(jìn)行定量，檢測(cè)錦鯽不同組織中Clock基因表達(dá)量.圖5結(jié)果表明，Clock基因在肌肉中相對(duì)表達(dá)量最高，其次依次是肝臟、腎、腸，心臟中最低(P<0.05).

3 討論

到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)一種不受外界因素影響、能夠在所有組織細(xì)胞中都能穩(wěn)定表達(dá)的理想內(nèi)參基因[8].實(shí)驗(yàn)時(shí)如果盲目選擇某單一內(nèi)參基因，勢(shì)必會(huì)影響到定量目的基因表達(dá)水平的檢測(cè)精度.目前國(guó)外文獻(xiàn)中都要求用qRT-PCR技術(shù)首先對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行篩選和優(yōu)化，選擇最合適的看家基因作為內(nèi)參.我國(guó)也有關(guān)于內(nèi)參基因的篩選和優(yōu)化的相關(guān)文獻(xiàn)[9]，但90%以上的文獻(xiàn)還是以單個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行定量，并未對(duì)所選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析.

本研究采用Norm Finder和Ge Norm兩個(gè)軟件，對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因β-actin，GAPDH，RPS29，RPL13和18SrRNA在錦鯽的5個(gè)組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，5個(gè)內(nèi)參基因在錦鯽的肌肉、心臟、肝臟、腸和腎中表達(dá)穩(wěn)定性不同，18SrRNA在肌肉、心臟、肝臟中的表達(dá)最穩(wěn)定，β-actin在腸中的表達(dá)最穩(wěn)定，RPL13在腎中的表達(dá)最穩(wěn)定.有文獻(xiàn)報(bào)道，18SrRNA在絲光綠蠅的不同發(fā)育時(shí)期和長(zhǎng)虹獵蝽的不同組織中的表達(dá)均較為穩(wěn)定，而在褐飛風(fēng)和桔小實(shí)蝶的不同組織中表達(dá)極不穩(wěn)定[10].蔣曉梅等[11]研究表明，在鹽脅迫和熱脅迫條件下，18SrRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性最高.鮑相渤等[12]對(duì)饑餓脅迫下6個(gè)候選內(nèi)參基因在蝦夷扇貝的各個(gè)組織中的穩(wěn)定性表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)β-actin在鰓、腎、血淋巴中穩(wěn)定性最好，GAPDH受饑餓脅迫后各組織中的表達(dá)穩(wěn)定性較差，但受急性感染和升溫試驗(yàn)時(shí)表現(xiàn)出較好的表達(dá)穩(wěn)定性.而周瑞雪等[13]以β-actin、18SrRNA和GAPDH3種內(nèi)參基因定量草魚早期發(fā)育時(shí)期肌球蛋白重鏈基因的mRNA表達(dá)量時(shí)優(yōu)選出β-actin和GAPDH作為看家基因.Nishimura等[14]通過Ge Norm 分析篩選出老鼠肝臟老化研究中合適的內(nèi)參基因?yàn)镠PRT1和GAPDH. Schmidt 等[15]研究證明，GAPDH在煙草中表達(dá)不穩(wěn)定.劉金泊等[16]優(yōu)選出RPS18和RPL13作為內(nèi)參基因，分析赤擬谷盜受磷化氫誘導(dǎo)后的表達(dá).李迪等[17]通過Ge Norm軟件分析發(fā)現(xiàn)，在鱖魚不同組織中B2M和RPL13為最佳內(nèi)參基因.綜上所述，必須根據(jù)不同的試驗(yàn)對(duì)象和試驗(yàn)?zāi)康倪x用多種內(nèi)參基因比較qRT-PCR 數(shù)據(jù)，以獲得相關(guān)目的基因的準(zhǔn)確定量，特別是那些僅有細(xì)微表達(dá)差異的研究.

Clock基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物生物鐘基因[18]，具有高度保守性，在動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，如Clock基因的 mRNA在小鼠視交叉上核、腦、心、肝、肺、腎、睪丸和卵巢均有表達(dá)[19].山羊中Clock基因的mRNA發(fā)育性表達(dá)模式具有組織特異性[20].塞內(nèi)加爾鰨中Clock基因廣泛表達(dá)于視網(wǎng)膜、視頂蓋、間腦、小腦和肝臟[22]，虹鱒中Clock1a在視網(wǎng)膜和下丘腦中表達(dá)較高[22]，瓦氏黃顙魚中Clock基因在大腦，肝臟和小腸有表達(dá)[23].可見，Clock基因在不同物種和不同組織中表達(dá)有差異，本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，Clock基因在錦鯽5個(gè)組織中相對(duì)表達(dá)量有差異，且在肌肉和肝臟中表達(dá)較高.

綜上所述，本研究運(yùn)用Norm Finder和Ge Norm兩個(gè)軟件，成功篩選出了錦鯽5個(gè)不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，提高了錦鯽Clock基因表達(dá)量分析的準(zhǔn)確性.Clock基因表達(dá)差異性表明，其在不同組織中的生物節(jié)律調(diào)控功能不同，這為進(jìn)一步探明錦鯽生物鐘的調(diào)控機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ).

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(編輯 WJ)

Stability Comparison of Reference Genes on Expression Analysis ofClockGene inCarassiusAuratus

PENGZhi-tao1,2,JIANGGuo-min3,ZOULi3,LIJin-long3,CHENGXiao-fei3,FANGLi-juan4,WANGXiao-qing1*,LIULi1,3*

(1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China;2. Aquatic Products Seed Stock Station in Hunan Province, Changsha 410153, China;3. Fisheries Research Institute of Hunan Province, Changsha 410153, China;4. College of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410012, China)

The aim of this study is to compare the stability difference of reference genes from the expression analysis ofClockgene inCarassiusauratus. The mRNA expression of five candidate reference genes such asRPL13,GAPDH18SrRNA,β-actin, andRPS29 were detected by using the qRT-PCR method, and Ge Norm and Norm Finder software packages. The optimal reference genes selected by analyzing and evaluating their mRNA expression stability were applied to accurately quantify the relative expression level of theClockgene in different tissues ofCarassiusauratus. Our results show that one of the most stable reference genes was 18SrRNAfrom three tissues, including muscle, heart, and liver, among the five reference genes, whereas that found in intestines wasβ-actinand in kidney wasRPL13. When these optimal reference genes were selected in five tissues, we found that the relative expression level of theClockgene was the highest in the muscle tissue, followed by liver, kidney, and intestines, and the lowest was in heart. In summary, this study has accurately quantified the relative expression levels of theClockgene in tissues, which should serve as the theoretical basis for the future investigation of theClockgene rhythm system.

reference gene; qRT-PCR;Carassiusauratus; Ge Norm software; Norm Finder software

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.06.007

2016-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31372530)

S917.4

A

1000-2537(2016)06-0037-06

*通訊作者,E-mail：wangxiao8258@163.com；hnhhliliu@163.com