慢性炎癥痛過程脊髓背角Caveoline-1蛋白表達變化

韓 坤，王丹萍

1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 生理教研室(河南 漯河 462000) 2.漯河市中心醫(yī)院(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院) 內(nèi)分泌科(河南 漯河 462000)

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慢性炎癥痛過程脊髓背角Caveoline-1蛋白表達變化

韓 坤1，王丹萍2

1.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 生理教研室(河南 漯河 462000) 2.漯河市中心醫(yī)院(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院) 內(nèi)分泌科(河南 漯河 462000)

目的 觀察慢性炎癥痛過程脊髓背角Caveoline-1蛋白表達。方法 實驗動物分組和動物模型制作：空白組4只：不作任何處理同期條件分籠飼養(yǎng)。炎性痛(足底注射CFA)模型組24只，炎性痛假手術(shù)組24只。炎性痛模型組和炎性痛假手術(shù)組大鼠按處理時間不同又分為1、3、5、7、10、14 d每組4只，分別于1、3、5、7、10、14 d制備動物模型。痛行為學(xué)檢測：術(shù)后1、3、5、7、14 d，測定各組機械撤足閾值和熱撤足潛伏期，手術(shù)組和空白組、假手術(shù)組對比，確定疼痛模型制作成功。組織標本制備和組織中總蛋白的提取及檢測：炎性痛模型和炎性痛假手術(shù)組大鼠分別在術(shù)后第15 d處死取L5脊髓，按同側(cè)和對側(cè)分別提取L5脊髓組織總蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法(western-blot)檢測Caveolin-1在各實驗分組脊髓背角同側(cè)和對側(cè)的表達量。結(jié)果 在同側(cè)脊髓背角，注射CFA后的第5、7、10、14 d，Caveolin-1表達量比假手術(shù)組分別升高了(78.8±3.31)%，(115.3±3.56)%，(69.2±5.21)%，(61.5±5.06)%，其中第5、7、10 d有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，第14 d差異有顯著性(P<0.01)。在CFA后各個時間點與假手術(shù)組相比，對側(cè)脊髓背角Caveolin-1的表達無明顯變化。結(jié)論 炎癥引起的慢性痛可誘導(dǎo)SD大鼠Caveolin-1在同側(cè)脊髓背角表達的增加。

炎性痛;谷氨酸代謝型受體;脊髓背角;Caveoline-1

疼痛是機體與組織損傷有關(guān)的復(fù)雜情感體驗[1]，分為生理性疼痛和病理性疼痛。炎癥性疼痛是病理性疼痛中的一個重要分類，是指受損的組織受到化學(xué)或物理因素刺激痛覺感受器而誘導(dǎo)機體發(fā)生血管的舒縮變化、軀體的感受獲得改變以及外周感受器的敏化等一系列改變，進而誘發(fā)持續(xù)性疼痛[2]，該過程中多種潛在機制可能發(fā)揮作用，包括神經(jīng)遞質(zhì)、異位沖動、受體和離子通道的表達以及功能改變等。其中，脊髓背角谷氨酸代謝型受體(metabotropicglutmate receptors，mGluRs)廣泛參與痛覺過敏、自發(fā)痛和觸誘發(fā)痛等病理性疼痛，在疼痛中發(fā)揮重要作用[3]。Caveolin是一種整合膜蛋白，其功能是在調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮信號通路的樞紐作用，該作用需與多種蛋白相互作用才能發(fā)揮。研究表明[4]Caveolin-1和mGluR1/5定位共存，Caveolin-1調(diào)控mGluR1/5轉(zhuǎn)運和信號傳導(dǎo)，進一步研究還發(fā)現(xiàn)Caveolin-1可以調(diào)控依賴mGluR5的ERK-MAPK途徑的激活[5]。Caveolin-1和mGluR在神經(jīng)元信號傳導(dǎo)中的共同作用已被多項研究所證實，而mGluR通過磷酸肌醇水解途徑、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑等多種途徑在炎性痛、神經(jīng)損傷疼痛及脊髓損傷慢性中樞痛中均發(fā)揮重要作用，但炎癥引起的慢性痛過程是否伴有Caveolin-1在背根神經(jīng)節(jié)和相關(guān)脊髓背角的表達變化至今未見報道。本實驗旨在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑水平觀察炎癥痛模型中大鼠脊髓后角Caveolin-1的表達水平，進一步明確疼痛體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物 60只成年SD大鼠(2月齡，180～250 g)雄性，SPF級，由河南省實驗動物中心提供(許可證號：SCXK豫2010-0002，合格證號：0008142)。于該實驗室動物房分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃，濕度40%～60%,白/夜12 h，自由飲食水。

1.2 主要儀器及試劑 完全弗氏試劑(CFA)(美國Sigma公司)，機械痛敏檢測儀(美國Stoeling公司)，熱痛刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)，兔Caveolin-1受體-抗購自美國Cell Signaling公司；小鼠Beta-actin單克隆抗體購自美國SIGMA公司，Blottinggradegoat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自美國Bio-Rad公司，Blottinggrade Affinity Purifiedgoat Anti-Mouse IgG(H+L) 購自美國Bio-Rad公司，vonFrey纖維絲購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組和動物模型制作 空白組4只：不作任何處理同期條件分籠飼養(yǎng)。炎性痛(足底注射CFA)模型組24只，炎性痛假手術(shù)組24只。炎性痛模型組和炎性痛假手術(shù)組大鼠按處理時間不同又分為1、3、5、7、10、14 d每組4只，分別于1、3、5、7、10、14 d制備動物模型。

1.3.2 痛行為學(xué)檢測 術(shù)后1、3、5、7、14 d，測定各組機械撤足閾值和熱撤足潛伏期，手術(shù)組和空白組、假手術(shù)組對比，確定疼痛模型制作成功。

1.3.3 組織標本制備和組織中總蛋白的提取及檢測 炎性痛模型和炎性痛假手術(shù)組大鼠分別在術(shù)后第15 d處死取L5脊髓，按同側(cè)和對側(cè)分別提取L5 脊髓組織總蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法(western-blot)檢測Caveolin-1在各實驗分組脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)同側(cè)和對側(cè)的表達量。

2 結(jié)果

2.1 炎性痛模型機械縮足閾值和熱撤足潛伏期檢測結(jié)果 與假手術(shù)組和空白對照組相比，炎性痛模型組在術(shù)后1、3、5、7、14d均出現(xiàn)機械撤足閾值和熱撤足潛伏期降低(P<0.05)，而假手術(shù)組和空白對照組在各時間點變化無統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果表明炎性痛模型組術(shù)后大鼠手術(shù)側(cè)足部均出現(xiàn)明顯痛覺過敏現(xiàn)象，模型建立成功(見圖1、圖2)。

VS假手術(shù)組and空白對照組，*：P<0.05，n=4圖1 CFA組大鼠熱撤足潛伏期測試結(jié)果

VS假手術(shù)組and空白對照組，*：P<0.05，n=4圖2 CFA組大鼠50%機械撤足閾值測試結(jié)果

2.2 炎性痛模型不同作用時間脊髓背角Caveolin-1表達量變化SD大鼠足底注射CFA可引起Caveolin-1在同側(cè)脊髓背角表達的升高。在同側(cè)脊髓背角，注射CFA后的第5、7、10、14d，Caveolin-1表達量比假手術(shù)組分別升高了(78.8±3.31)%，(115.3±3.56)%，(69.2±5.21)%，(61.5±5.06)%，其中第5、7、10d有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，第14d差異有顯著性(P<0.01)。在CFA后各個時間點與假手術(shù)組相比，對側(cè)脊髓背角Caveolin-1的表達無明顯變化(見圖3)。

VS假手術(shù)組，*：P<0.05,**：P<0.01，n=4圖3 炎性痛模型組不同作用時間脊髓背角Caveolin-1表達量變化

3 討論

本研究采用大鼠足底注射CFA誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生炎癥性慢性痛模型，結(jié)合western-bolt檢測了大鼠注射CFA后1、3、5、7、10、14d，Caveolin-1在同側(cè)和對側(cè)L5脊髓背角的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在脊髓背角注射CFA后的第5、7、10、14d，Caveolin-1表達量比假手術(shù)組分別升高了(78.8±3.31)%，(115.3±3.56)%，(69.2±5.21)%，(61.5±5.06)%，其中第5、7、10d有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，第14d差異有顯著性(P<0.01)。在CFA后各個時間點與假手術(shù)組相比，對側(cè)脊髓背角Caveolin-1的表達均無明顯變化，表明在慢性炎癥痛模型中可誘導(dǎo)Caveolin-1在脊髓背角表達顯著升高，提示脊髓背角Caveolin-1的表達與炎性疼痛大鼠痛覺變化和信號的傳導(dǎo)中可能發(fā)揮重要作用。

疼痛傳導(dǎo)通路中痛覺傳入纖維進入脊髓后，在后角更換神經(jīng)元并發(fā)出纖維交叉到雙側(cè)，再經(jīng)脊髓丘腦側(cè)束上行抵達丘腦的體感覺核，轉(zhuǎn)而向皮層體表感覺區(qū)投射，在本實驗中同側(cè)Caveolin-1在DRG和脊髓背角表達顯著增加，對側(cè)DRG和脊髓背角Caveolin-1的表達各個時間點與對照組相比，均無明顯變化，更進一步證實了慢性痛中Caveolin-1介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的作用的存在。

但在本實驗中，炎癥引起的慢性痛可誘導(dǎo)Caveolin-1在同側(cè)DRG和脊髓背角表達的升高與與以往的研究中Caveolin-1發(fā)揮的負性調(diào)控作用的結(jié)論不一致[6]。考慮Caveolin-1的負性調(diào)控作用并非適用于所有的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同時研究證實也只有部分mGluR5和Caveolin-1相關(guān)而非全部[7]。所以，在慢性疼痛的信號傳導(dǎo)通路中更多的信號傳導(dǎo)途徑及其更詳細的分子機制都有待進一步證實。

綜上，Caveolin-1在慢性痛過程痛覺信號的傳遞中可能發(fā)揮重要作用，慢性炎癥性痛可誘導(dǎo)Caveolin-1在同側(cè)DRG和脊髓背角表達的增加，進一步明確了體內(nèi)疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制，并為臨床上疼痛的治療提供理論基礎(chǔ)。

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[3]NeugebauerV，LuckeT，SctmibleHg．Requirementofmetabotropicglutamatereceptorsforthegenerationofinflammationevokedhyperexcitabilityinratspinalcordneurons[J]．EurJNeurosci，1994，6(7)：1 179-1 186.

[4]AnnaFrancesconi,RanjuKumari,andR.SuzanneZukin．RegulationofgroupIMetabotropicglutamateReceptorTraffickingandSignalingbytheCaveolar/LipidRaftPathway[J].TheJournalofNeuroscience,2009,29(11):3 590-3 602.

[5]BhatnagarA,ShefflerDJ,KroezeWK．Caveolin-1interactswith5-HT2Aserotoninreceptorsandprofoundlymodulatesthesignalingofselectedgalphaq-coupledproteinreceptors[J].BiolChem，2004(279):34 614-34 623.

[6]FrancesconiA,KumariR,ZukinRS．RegulationofgroupIetabotropicglutamatereceptortraffickingandsignalingbytheCaveolar/lipidraftpathway[J].Neurosci,2009,29(11):3 590-3 602.

[7]ShenJ，MaS，ChanP．Nitricoxidedown-regulatesCaveolin-1expressioninratbrainsduringfocalcerebralischemiaandreperfusioninjury[J].Neurochem,2006，81(96):1 078-1 089.

責(zé)任編輯：牟冬生

The Caveoline-1 Protein Expression of Spinal Cord Dorsal Horn in Inflammatory Pain Model

Han Kun1,Wang Danping2

[1.DepartmentofPhysiology，LuoheMedicalColloge,Luohe462000,China; 2.LuoheCentralHospital(DepartmentofEndocrinology,The1stAffiliatedHospitalofLuoheMedicalCollege),Luohe462000,China]

Objective To observe the Caveoline-1 protein expression of spinal cord dorsal horn in inflammatory pain model.Methods 4 rats in the blank group were raised in the same condition.24 rats (plantar injection CFA) were in the inflammatory pain model group and 24 rats were in the inflammatory pain sham operation group.According to the different processing time,the rats in the two groups were prepared respectively on 1,3,5,7,10 d and 14 d.4 rats in each group were made into animal model on 1,3,5,7,10 d and 14 d.The mechanical shrinkage foot threshold and hot shrinkage foot incubation period were detected 1,3,5,7,10 d and 14 d after operation.The surgery group,blank group and sham operation group were compared to be successful in the pain model.The rats in the inflammatory pain model group and inflammatory pain sham operation group were put to death 15 days after operation and extracted L5 spinal cord.The total protein was extracted from L5 spinal cord according to the same side and the contralateral side. The Caveolin-1 expression of spinal cord dorsal horn was detected by the Western-blot method.Results on 5,7，10，14 d after the CFA injection in the same side of the spinal cord dorsal horn,the Caveolin-1 expressions were increased by(78.8±3.31)%, (115.3±3.56)%,(69.2±5.21)% and (61.5±5.06)%. It had statistic difference on 5,7,10 d (P<0.05) and the difference was significant on 14 d (P<0.01).Compared with the sham operation group at every times after CFA,the Caveolin-1 expressions on the contralateral side of spinal cord dorsal horn had no significant change.Conclusion the chronic pain caused by the inflammation can increase the Caveolin-1 expressions on the same side of spinal cord dorsal horn for SD rats.

inflammatory pain；metabolicglutamate receptor;spinal cord dorsal horn;caveolin-1

韓坤(1982- )，男，河南漯河人，研究生，講師，研究方向：神經(jīng)生理和內(nèi)分泌。

R741；R966

A

1008-8164(2016)04-0004-03

2016-11-09