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    膠質(zhì)瘤相關性癲癇組織高遷移率族蛋白B1的表達

    2016-12-23 09:26:23沈云松蓋雪松
    中國老年學雜志 2016年23期
    關鍵詞:遷移率級別膠質(zhì)瘤

    林 嵐 楊 淑 沈云松 蓋雪松 梅 茸 唐 浩

    (云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,云南 昆明 650032)

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    膠質(zhì)瘤相關性癲癇組織高遷移率族蛋白B1的表達

    林 嵐 楊 淑 沈云松1蓋雪松2梅 茸 唐 浩

    (云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,云南 昆明 650032)

    目的 探討膠質(zhì)瘤相關性癲癇致癇組織中蛋白B1的表達。方法 選取72例膠質(zhì)瘤相關性癲癇患者的膠質(zhì)瘤標本作膠質(zhì)瘤并癲癇組,同期行手術治療的70例未伴發(fā)癲癇的膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤標本作膠質(zhì)瘤無癲癇組,同期70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標本作非腫瘤癲癇組,20例接受顱內(nèi)減壓術治療的患者的腦組織標本作對照組。分析膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級別和高遷移率族蛋白B1表達水平的關系、四組高遷移率族蛋白B1表達情況、膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤病理級別對癲癇的影響。結果 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達與膠質(zhì)瘤病理級別(r=0.154,P<0.05)、癲癇發(fā)作頻率(r=0.429,P<0.05)及癲癇持續(xù)時間(r=0.254,P<0.05)呈正相關;膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達陽性率顯著高于膠質(zhì)瘤無癲癇組(χ2=8.990,P<0.05)、非腫瘤癲癇組(χ2=19.864,P<0.05),膠質(zhì)瘤無癲癇組顯著高于對照組(χ2=32.699,P<0.05),非腫瘤癲癇組顯著高于對照組(χ2=20.793,P<0.05);高遷移率族蛋白B1在中低級別中表達水平顯著高于高級別(χ2=11.614,P<0.05),高遷移率族蛋白B1在高級別膠質(zhì)瘤中的表達水平與是否并發(fā)癲癇有關(χ2=11.445,P<0.05)。結論 高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤相關性癲癇致癇組織中具有較高表達水平,膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1可能是誘發(fā)相關性癲癇的重要因素。

    膠質(zhì)瘤相關性癲癇;致癇組織;高遷移率族蛋白B1

    有資料表明,顱內(nèi)膠質(zhì)瘤誘發(fā)癲癇發(fā)生率高達約69.9%,治療膠質(zhì)瘤相關性癲癇的主要方法為膠質(zhì)瘤并致癇病灶切除術,且取得了顯著療效〔1,2〕。高遷移率族蛋白B1是一種染色質(zhì)非組蛋白核蛋白,廣泛分布于機體內(nèi)的真核細胞中,相關實驗〔3〕證實,高遷移率族蛋白B1與其相關受體Toll樣受體4(TLR4)在癲癇大鼠模型的發(fā)病及復發(fā)中活躍度較高,且人體顳葉癲癇患者海馬中TLR4、高遷移率族蛋白B1表達的組織病理學模型與癲癇大鼠模型極其相似,因此推測高遷移率族蛋白B1與其受體糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、TLR4等可經(jīng)免疫反應引發(fā)癲癇。此外,近些年有相關學者研究〔4〕指出,高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤、結腸癌等腫瘤疾病中具有較高表達水平。本研究旨在進一步探討高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤相關癲癇組織的表達意義。

    1 對象及方法

    1.1 對象 選取2010年6月至2016年2月在我院神經(jīng)外科行手術治療的72例膠質(zhì)瘤相關性癲癇患者的膠質(zhì)瘤標本作膠質(zhì)瘤并癲癇組,另選取同期行手術治療的70例未伴發(fā)癲癇的膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤標本作膠質(zhì)瘤無癲癇組,70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標本作非腫瘤癲癇組,20例接受顱內(nèi)減壓術治療的患者的腦組織標本作對照組。四組患者性別、年齡等基本信息對比無統(tǒng)計學差異(P>0.05),具有研究價值,且本研究經(jīng)我院倫理委員會審核同意。

    1.2 免疫組化方法 對標本行包埋處理,以3.0 μm厚度對其進行連續(xù)切片,隨后將其放置于載玻片上(經(jīng)防脫劑預處理)。以檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)作修復液,通過微波加熱修復法對抗原實施修復處理,完成修復后滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體;利用微波高溫對切片行加熱處理(2.0 min左右),待其溫度上升至90.0℃~95.0℃出現(xiàn)微小波動時,立即調(diào)至保溫模式(8.0 min左右),待切片溫度恢復至室溫水平時,通過蒸餾水對其進行2次沖洗,隨后將其放入3.0%H2O2液體內(nèi),9.0~10.0 min后再次蒸餾水行兩次沖洗。滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體并在4.0℃環(huán)境下過夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,滴加生物素標記二抗后于室溫條件下20.0 min孵育處理;PBS沖洗,加入辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液,隨后于室溫條件下行15.0 min孵育處理。采用DAB顯色劑對切片行顯色操作,清洗后以蘇木精復染;通過乙醇實施常規(guī)脫水及二甲苯透明處理,以中性樹膠對其行封片處置,并通過顯微鏡對其進行觀察。

    1.3 免疫組化染色評估 高遷移率族蛋白B1免疫染色情況依據(jù)染色程度和免疫組化染色率進行綜合評定。選取各切片中免疫反應最強烈的區(qū)域,并采用高倍視鏡(×400)對切片中5個非重復視野進行觀察,統(tǒng)計高遷移率族蛋白B1染色細胞數(shù)量,計算染色率〔染色率=(染色細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100.0%〕。染色率評分標準〔5〕:染色率>75.0%為4分,50.0%<染色率<74.0%為3分,25.0%<染色率<49.0%為2分,染色率≤24.0%為1分,無染色細胞為0分。免疫染色程度評分參照細胞質(zhì)染色程度進行評定〔6〕:深黃色為2分,淺黃色為1分,無色為0分。最終得分為染色率評分與免疫染色程度評分之和,并設定:4~6分為高表達,以“**”表示;1~3分為低表達,以“*”表示;0分為陰性,以“-”表示。

    1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0軟件,兩獨立樣本均數(shù)的比較采用t檢驗,計數(shù)資料組間分布采用χ2檢驗。

    2 結 果

    2.1 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級別和高遷移率族蛋白B1表達水平的關系 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達與膠質(zhì)瘤病理級別(r=0.154,P<0.05)、癲癇發(fā)作頻率(r=0.429,P<0.05)及癲癇持續(xù)時間(r=0.254,P<0.05)呈正相關。見表1。

    表1 膠質(zhì)瘤并癲癇組患者癲癇發(fā)生情況及膠質(zhì)瘤病理級別與高遷移率族蛋白B1表達水平的關系(n)

    病理因素n低表達高表達r值P值膠質(zhì)瘤病理級別 中、低級5631250.154<0.05 高級16313癲癇發(fā)作頻率(個月) >35313400.429<0.05 ≤319172癲癇持續(xù)時間(min) >53710270.254<0.05 ≤5352411

    2.2 四組高遷移率族蛋白B1表達情況對比 膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達陽性率(100%)顯著高于膠質(zhì)瘤無癲癇組(85.71%)(χ2=8.990,P<0.05)、非腫瘤癲癇組(75.71%)(χ2=19.864,P<0.05),膠質(zhì)瘤無癲癇組顯著高于對照組(20.00%)(χ2=32.699,P<0.05),非腫瘤癲癇組顯著高于對照組(χ2=20.793,P<0.05)。

    2.3 膠質(zhì)瘤并癲癇組膠質(zhì)瘤病理級別對癲癇的影響 膠質(zhì)瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1在中低級別中表達水平(100.00%)顯著高于高級別(20.00%)(χ2=11.614,P<0.05),高遷移率族蛋白B1在高級別膠質(zhì)瘤中的表達水平與是否并發(fā)癲癇有關,并發(fā)癲癇組為20.00%,非癲癇組為92.11%(χ2=11.445,P<0.05)。

    3 討 論

    據(jù)報道,約29.4%的癲癇患者遵從醫(yī)囑堅持長期定時定量用藥治療,但病情仍難以得到完全控制,此類癲癇在臨床醫(yī)學中被稱為難治性癲癇〔7〕。外科手術是治療難治性癲癇的主要措施之一,但少數(shù)難治性癲癇患者難以明確其發(fā)病原因,如顱內(nèi)血管畸形、外傷、顱內(nèi)腫瘤等,其中膠質(zhì)瘤是發(fā)病率較高的腫瘤之一〔8〕。有文獻〔9〕指出,神經(jīng)化學物質(zhì)及腫瘤細胞成分的組成對癲癇發(fā)作具有決定性作用。膠質(zhì)瘤瘤周組織微環(huán)境和形態(tài)學的變化均可誘發(fā)癲癇,如腫瘤灶的局部刺激、腫瘤中血流減少、血腦屏障受損、突觸囊泡改變、神經(jīng)元異常遷移及谷氨酸濃度失衡等,這些變化均可對神經(jīng)化學物質(zhì)、細胞結構及神經(jīng)網(wǎng)絡的改變產(chǎn)生重要影響〔10〕。機體血腦屏障受損導致血清中谷氨酸等相關致癇物質(zhì)到達瘤周部位時,可使瘤周組織的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)顯著增加,促進膠質(zhì)細胞大量聚集;同時,瘤周角質(zhì)細胞被激活后缺乏功能性角質(zhì)細胞特有的轉(zhuǎn)運體GLAST、GLT-1,從而無法對谷氨酸進行有效清除。

    相關實驗〔11〕證實,癲癇大鼠模型海馬組織中高遷移率族蛋白B1表達水平過高時,可加劇其損傷狀態(tài),同時還可導致海馬組織中P-糖蛋白(P-gp)過量表達,進而提高癲癇發(fā)作的易感性。另有研究〔12〕指出,隨時間延長,高遷移率族蛋白B1在Sombati癲癇細胞中的表達量會不斷增加,在癲癇的生理病理中發(fā)揮重要作用。本研究顯示,高遷移率族蛋白B1在致癇灶組織中的表達情況可能直接相關于癲癇發(fā)病,與以往相關研究結果〔13〕一致,高遷移率族蛋白B1不僅在膠質(zhì)瘤組織中表達較高,同時其表達情況還與膠質(zhì)瘤的病理級別存在一定相關性,由此可以推測,高遷移率族蛋白B1在膠質(zhì)瘤非癲癇患者膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的表達水平顯著高于正常腦組織。本研究還顯示:高遷移率族蛋白B1對低病理級別膠質(zhì)瘤患者是否會并發(fā)癲癇有重要影響。分析其原因可能是膠質(zhì)瘤組織可生成大量高遷移率族蛋白B1,而高遷移率族蛋白B1可與其RAGE、TLR4等受體共同形成異常放電通路,從而構成癲癇發(fā)作的基礎;低病理級別的膠質(zhì)瘤病程相對較長,其生成的高遷移率族蛋白B1進入細胞外環(huán)境后可加劇機體炎性反應,進而構成瘤周致癇灶;而腫瘤性病變中的免疫反應、蛋白質(zhì)表達、膠質(zhì)細胞的酶及神經(jīng)元異常均可對腦功能造成影響,繼而引發(fā)癲癇。

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    〔2016-05-11修回〕

    (編輯 袁左鳴)

    1 云南省第一人民醫(yī)院檢驗科 2 云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科

    林 嵐(1969-),女,副主任醫(yī)師,主要從事臨床神經(jīng)病學、癲癇病學方面的研究。

    R742.1

    A

    1005-9202(2016)23-5837-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.028

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