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    CIT2基因?qū)ν蛔冡劸平湍改咎抢糜绊懙难芯?/h1>
    2016-12-22 02:03:17李維維陳朝儒曲娟娟頓寶慶李桂英
    生物技術(shù)進(jìn)展 2016年6期
    關(guān)鍵詞:三角瓶木糖釀酒

    李維維, 張 驥, 陳朝儒, 王 智, 曲娟娟, 頓寶慶*, 李桂英, 路 明

    1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030

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    CIT2基因?qū)ν蛔冡劸平湍改咎抢糜绊懙难芯?/p>

    李維維1,2, 張 驥1, 陳朝儒1, 王 智1, 曲娟娟2*, 頓寶慶1*, 李桂英1, 路 明1

    1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030

    木糖利用困難是秸稈燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化的制約因素,改造釀酒酵母使其能夠代謝木糖生成乙醇是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。為了研究CIT2基因?qū)z傳改良釀酒酵母C5D-P-M菌株中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中木糖利用的影響,設(shè)計(jì)引物并應(yīng)用重疊PCR技術(shù)獲得敲除CIT2基因的敲除組件,通過(guò)同源重組的方法將C5D-P-M中的CIT2基因敲除得到突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ。通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株和突變菌株的生長(zhǎng)速率、葡萄糖利用率、木糖利用率及乙醇產(chǎn)量進(jìn)行研究,結(jié)果表明突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的上述指標(biāo)比出發(fā)菌株C5D-P-M均有一定程度的提高。因此推測(cè),釀酒酵母中CIT2基因是影響木糖利用的因素之一,CIT2基因的敲除可提高釀酒酵母的木糖利用率。

    釀酒酵母;CIT2基因;基因敲除;木糖代謝

    能源短缺、氣候變化是目前全世界共同面臨的重大問(wèn)題之一[1]。因此,世界各國(guó)紛紛積極開(kāi)展新能源、可再生生物質(zhì)能的研究與開(kāi)發(fā)[2],其中以燃料乙醇的研究開(kāi)發(fā)最為成功,也是最可能的替代能源之一[3,4]。

    我國(guó)人口眾多,土地資源相對(duì)貧乏,用緊缺的糧食生產(chǎn)乙醇燃料受條件限制。然而資源豐富、價(jià)格低廉的農(nóng)作物秸稈類纖維素生物質(zhì)尚未得到有效充分利用與開(kāi)發(fā)。秸稈類纖維素物質(zhì)具有木質(zhì)纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu),木質(zhì)纖維素的組成和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。半纖維素構(gòu)成了秸稈類纖維素物質(zhì)中的相當(dāng)部分,約為30%,其水解產(chǎn)物是D-木糖類的五碳糖[5~7],其中木糖的有效利用是乙醇產(chǎn)業(yè)化利用的重要限制因素之一[8]。

    生產(chǎn)燃料乙醇用到的最主要的微生物是釀酒酵母,但是釀酒酵母不能直接代謝利用木糖,因其沒(méi)有專一性代謝木糖生成木酮糖的酶系,并且存在細(xì)胞膜上木糖跨膜運(yùn)輸障礙[9],只有在釀酒酵母中引入木糖代謝流[10]并利用木酮糖的代謝酶系,將其代謝分解隨后進(jìn)入磷酸戊糖途徑,才能進(jìn)入其本身的代謝流,解決釀酒酵母中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響[11~13]。目前已知在全基因組測(cè)序的釀酒酵母S288C中,擁有DUP多基因家族[14]。釀酒酵母的DUP基因家族包括23個(gè)成員,其中可分為兩個(gè)亞族包括DUP240和DUP380。DUP基因家族編碼的部分蛋白能夠促進(jìn)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[15]。DUP240有3個(gè)保守區(qū)域C1、C2、C3和兩個(gè)預(yù)測(cè)橫跨膜結(jié)構(gòu)H1和H2,并且在Dup380蛋白質(zhì)序列中觀察到一個(gè)直接重復(fù)的C1-H1-H2-C2模塊[16]。DUP380亞家族由11個(gè)分別命名為COS1-COS11的基因組成,還包括2個(gè)假基因,所有這些基因連同與其相關(guān)的9個(gè)基因殘基都集中分布在酵母16條染色體的端粒區(qū)域。研究表明,DUP240家族蛋白均與細(xì)胞膜有關(guān),他們具有不同的亞細(xì)胞定位而且沒(méi)有多余的互作因子[17]。這些DUP家族蛋白可能均在細(xì)胞膜運(yùn)輸中起作用[18]。

    COS12蛋白(YGL263W )為DUP380家族成員,源于釀酒酵母ATCC204508/S288c 菌株。蛋白序列全長(zhǎng)為380個(gè)氨基酸,并且已經(jīng)從蛋白水平上得到證實(shí)[19,20]。該蛋白位于細(xì)胞膜上,為跨膜蛋白,COS12與物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸有關(guān)[21],但目前為止關(guān)于其在調(diào)控木糖利用機(jī)制方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用C5D-P-M菌株構(gòu)建COS12的缺失突變株C5D-P-M-CIT2Δ,研究共生長(zhǎng)特性,以期揭示CIT2基因?qū)︶劸平湍改咎抢玫挠绊憽?/p>

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及載體 質(zhì)粒pUG6、pSH65由實(shí)驗(yàn)室保存,釀酒酵母菌株C5D-P-M(表型為MatAura3-52,轉(zhuǎn)入含有攜帶TPI-PxylA基因的質(zhì)粒pYES2,能夠代謝木糖)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

    1.1.2 酶類及其他生化試劑TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司;RNA提取試劑盒RNeasy?Mini Kit (50) Cat.NO.74104、TAKARA熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Omniscrippt?Reverse Transcription購(gòu)自QIAGEN公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基配方 大腸桿菌培養(yǎng)基LB:1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,l% NaCl,pH 7.0。

    酵母培養(yǎng)基YPD:1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖,平板添加2%瓊脂。

    選擇培養(yǎng)基SC:0.67%YNB,2%葡萄糖,平板添加2%瓊脂。

    釀酒酵母誘導(dǎo)表達(dá)YPG培養(yǎng)基:1.0%酵母膏,2.0%蛋白胨,1.34% YNB,4×10-5%生物素,1.0%甘油;10.0% 100 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液,水1 000 mL。

    1.2 方法

    1.2.1 釀酒酵母C5D-P-M中CIT2基因的敲除①敲除組件引物設(shè)計(jì)。根據(jù)已知的CIT2基因和質(zhì)粒pUG6的核甘酸序列,設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1。

    表1 CIT2基因敲除及驗(yàn)證引物Table 1 CIT2 gene knockout and verified primers.

    ②敲除組件的PCR合成。以pUG6質(zhì)粒為模板,用敲除組件引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增敲除組件。PCR反應(yīng)體系(20 μL):2 μL 10×ExTaqBuffer,0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L),0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L),0.4 μL 的dNTP Mix(5mmol/L each dNTP),0.1 μL的pUG6模板,0.1 μL 的ExTaq酶,0.1 μL ddH2O。

    PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?9℃蓋子預(yù)熱, 94℃預(yù)變性5 min;94℃ 45 s,52℃ 45 s,72℃ 1 min 20 s,25個(gè)循環(huán);72℃ 10 min,4℃無(wú)限延伸。

    ③敲除組件連接pGEM-T載體。連接體系如下:目的PCR片段(可變),pZeroBack載體(約25 ng/μL)1 μL,2×Reaction Buffer 5 μL,T4 DNA Ligase(5 U/μL)0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足到10 μL。輕輕彈動(dòng)離心管以混勻內(nèi)容物,短暫離心3~5 s,將混合反應(yīng)液放置室溫(22℃)反應(yīng)5 min,反應(yīng)結(jié)束后,將離心管置于冰上。取部分連接產(chǎn)物加到50~100 mL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,輕彈混勻,冰浴30 min。將離心管置于42℃恒溫90 s,取出管后立即置于冰浴中放置2~3 min,期間不要搖動(dòng)離心管。向離心管中加入250~500 mL 37℃預(yù)熱的LB(不含抗生素)培養(yǎng)基,150 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)45 min。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá),使菌體復(fù)蘇。將離心管中的菌液混勻,吸取100 mL加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無(wú)菌的彎頭玻璃棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培養(yǎng)12~16 h。

    1.2.2 突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的構(gòu)建 出發(fā)菌株化學(xué)轉(zhuǎn)化pSH65及Kanr基因的切除:活化轉(zhuǎn)進(jìn)敲除組件的釀酒酵母C5D-P-M,用滅菌去離子水清洗兩遍后加入1 mL滅菌去離子水取100 μL備用;鮭魚(yú)精50 μL放入沸水中煮10 min備用;PEG3350取240 μL及LiAC36 μL加入以上釀酒酵母與鮭魚(yú)精和敲除組件渦懸混勻后放入30℃水浴中30 min,再放入42℃水浴45 min;加入1 mL YPD培養(yǎng)基于30℃ 120 r/min培養(yǎng)1 h;取20 μL涂于含有抗生素腐草霉素的YPD平板上48 h左右觀察:將轉(zhuǎn)進(jìn)pSH65的菌株用YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)4~7 h,誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65上Cre基因表達(dá),切除基因組上Kanr基因,去除抗性;用YPD培養(yǎng)基傳代丟失釀酒酵母中質(zhì)粒pSH65,得到CIT2缺失的C5D-P-M-CIT2Δ。

    1.2.3 突變菌株木糖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平熒光定量分析 以試劑盒所提RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋100倍為模板做熒光定量PCR。按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)液及操作。

    利用Primer Express 3.0軟件所設(shè)計(jì)的9對(duì)引物如表2所示。分別是參與三羧酸循環(huán)的ACO1(烏頭酸酶)基因、TCA循壞中的關(guān)鍵酶FUM1(延胡索酸酶)基因、在糖酵解第二步中GND1(6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)基因、三羧酸循環(huán)中重要的限速酶IDH2(異檸檬酸脫氫酶)基因、在三羧酸循環(huán)中提供能量的MDH1(蘋(píng)果酸脫氫酶)基因、TCA循環(huán)中唯一一個(gè)整合于膜上的多亞基酶SDH1(琥珀酸脫氫酶,是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一,為線粒體的一種標(biāo)志酶)基因、催化糖酵解第二部分開(kāi)始的TDH3(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因、木糖代謝進(jìn)入到戊糖磷酸途徑后的TKL1(轉(zhuǎn)酮醇酶)基因。

    表2 內(nèi)參肌動(dòng)蛋白及差異基因熒光定量引物Table 2 Fluorescence quantitative primer of actin and differentially expressed genes.

    1.2.4 突變菌株生理生化分析 ①生長(zhǎng)速率測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ單菌落分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中,于30℃ 160 r/min培養(yǎng),至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí),用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌的50 mL三角瓶,分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC,將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中,每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè),通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出來(lái)具體每種菌株所需接種體積),每種菌株設(shè)置5個(gè)平行,菌體濃度OD600,分別取0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、14 h、22 h、28 h、34 h、40 h培養(yǎng)液測(cè)OD600值。

    ②剩余葡萄糖含量測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中,于30℃ 160 r/min培養(yǎng),至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌50 mL三角瓶,分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC,將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中,每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè),通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出每種菌株所需接種體積),每種菌株設(shè)置5個(gè)平行,菌體濃度OD600,在0 h 、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、23 h、31 h、39 h、47 h、55 h、63 h、71 h分別取培養(yǎng)液1.5 mL。發(fā)酵樣品用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾,濾液放于-80℃冰箱保存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量用高效液相色譜分析儀(HPLC)進(jìn)行分析。色譜分離柱為BioRad公司離子色譜柱(300 mm×7.8 mm,9 μm),保護(hù)柱為Micro-Guard cation H(30 mm×4.6 mm),流動(dòng)相為4~12 mmol/L H2SO4,流速為0.5 mL/min,折光示差檢測(cè)器SHO-DEX RI-101進(jìn)行檢測(cè)。

    ③剩余木糖含量測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中,于30℃ 160 r/min培養(yǎng),至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌50 mL三角瓶,分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC,將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中,每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè),通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出來(lái)具體每種菌株所需接種體積),每種菌株設(shè)置5個(gè)平行,菌體濃度OD600,在0 h 、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、23 h、31 h、39 h、47 h、55 h、63 h、71 h分別取培養(yǎng)液1.5 mL。發(fā)酵樣品用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾,濾液放于-80℃冰箱保存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量用高效液相色譜分析儀(HPLC)進(jìn)行分析。色譜分離柱為BioRad公司離子色譜柱(300 mm×7.8 mm,9 μm),保護(hù)柱為Micro-Guard cation H(30 mm×4.6 mm),流動(dòng)相為4~12 mmol/L H2SO4,流速為0.5 mL/min,折光示差檢測(cè)器SHO-DEX RI-101進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 釀酒酵母C5D-P-M中CIT2基因的敲除

    通過(guò)PCR方法獲得敲除組件(1 808 bp),擴(kuò)增測(cè)序分析,證實(shí)獲得的序列與理論設(shè)計(jì)引物序列一致。

    圖1 敲除組件PCR電泳對(duì)照?qǐng)DFig.1 Knockout component PCR electrophoretogram.M:DL 2 000; 1:敲除組件1 808 bp

    2.2 熒光定量PCR測(cè)定C5D-P-M-CIT2Δ菌株木糖代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用

    熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示,其中有6個(gè)基因包括ACO1、GND1、IDH2、SDH1、TDH3、TKL1在C5D-P-M-CIT2Δ中比在C5D-P-M中表達(dá)上調(diào),2個(gè)基因包括FUM1、MDH1在C5D-P-M-CIT2Δ中比在C5D-P-M中表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的基因在一定程度上可以使發(fā)酵木酮糖的乙醇得率提高,而表達(dá)下調(diào)的基因則對(duì)糖代謝的推動(dòng)作用不明顯甚至起抑制作用。

    圖2 熒光定量PCR結(jié)果Fig.2 Fluorescence quantitative PCR result.

    2.3 工程菌株生理生化的測(cè)定

    2.3.1 生長(zhǎng)速率結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的生長(zhǎng)速率如圖3所示。其中同一時(shí)間C5D-P-M-CIT2Δ比C5D-P-M生長(zhǎng)速度略快,尤其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)C5D-P-M-CIT2Δ比C5D-P-M的生長(zhǎng)速率更快,到達(dá)穩(wěn)定期生長(zhǎng)速率基本持平。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,突變菌株平均增速是出發(fā)菌株的1.272倍,適應(yīng)期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增速明顯。

    圖3 C5D-P-M-CIT2Δ與C5D-P-M生長(zhǎng)速率比較Fig.3 The growth rate of C5D-P-M-CIT2Δ compared with C5D-P-M.

    2.3.2 剩余葡萄糖含量比較結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的剩余葡萄糖量比較如圖4所示。其中,在適應(yīng)期突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的剩余葡萄糖量略低于出發(fā)菌株;在對(duì)數(shù)期的12~31 h內(nèi)突變菌株的剩余葡萄糖量明顯低于出發(fā)菌株,且差異顯著,尤其是在15~23 h內(nèi)差異是極顯著的;隨著菌株進(jìn)入平穩(wěn)期,兩株菌的剩余葡萄糖量的差異越來(lái)越小,直到葡萄糖利用完全。

    圖4 剩余葡萄糖含量Fig.4 Residual glucose quantity.

    2.3.3 剩余木糖含量比較結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的剩余木糖量比較如圖5所示。在適應(yīng)期兩株菌的木糖含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)都在減少,其中突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的木糖含量明顯低于出發(fā)菌株C5D-P-M,且差異顯著;進(jìn)入對(duì)數(shù)期后兩株菌的剩余木糖含量還是在不斷減少,突變菌株的剩余木糖含量始終低于出發(fā)菌株,但差異越來(lái)越小。

    圖5 剩余木糖含量Fig.5 Residual xylose quantity.

    3 討論

    木糖異構(gòu)酶是木糖利用中的關(guān)鍵酶[22]。本研究利用轉(zhuǎn)入木糖異構(gòu)酶基因的重組釀酒酵母C5D-P-M,以DUP240家族中的CIT2基因?yàn)檠芯繉?duì)象,通過(guò)基因敲除技術(shù)將CIT2基因去除,獲得缺失CIT2基因的釀酒酵母C5D-P-M-CIT2Δ后,以出發(fā)菌株C5D-P-M為對(duì)照,研究其生長(zhǎng)速率、剩余葡萄糖含量及剩余木糖含量生理生化指標(biāo)及進(jìn)行熒光定量PCR分析。在生長(zhǎng)速率測(cè)定中前期選擇每2 h取樣一次,后期每隔12 h取樣一次,根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)做圖所得,在接種量相同的情況下,已經(jīng)敲除CIT2基因的釀酒酵母C5D-P-M-CIT2Δ比未敲除基因的對(duì)照菌株C5D-P-M增速明顯,且實(shí)驗(yàn)菌株是對(duì)照菌株前期每2 h平均增速的3.2倍,后期平均增速為1.6倍,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,平均增速為1.3倍,前期增速約是后期的2倍,前期增速明顯大于后期。由此可知當(dāng)敲除釀酒酵母中CIT2基因后,加強(qiáng)了釀酒酵母本身的糖運(yùn)輸或糖代謝過(guò)程,當(dāng)釀酒酵母有充足的能源時(shí),其生長(zhǎng)速率明顯提高,但當(dāng)糖運(yùn)輸或糖代謝達(dá)到一定水平時(shí)其生長(zhǎng)速率增加相對(duì)緩慢。

    根據(jù)剩余葡萄糖含量可知兩株菌對(duì)葡萄糖的利用率都是100%,但是葡萄糖要比木糖先利用完,這在葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中是普遍存在的[20],在48~60 h之間完全用完。實(shí)驗(yàn)菌株C5D-P-M-CIT2Δ比對(duì)照菌株C5D-P-M利用葡萄糖的效率要略高,這是因?yàn)樵谇贸鼵IT2基因后,實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)糖的運(yùn)輸能力比對(duì)照菌株略有加強(qiáng),因此帶動(dòng)了糖代謝的加速進(jìn)行,最終表現(xiàn)在時(shí)間上就是實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株到48 h對(duì)葡萄糖的利用量多約0.2 g/mL。木糖剩余量與葡萄糖剩余量在趨勢(shì)上是相同的,總體都是實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株利用的能力要略強(qiáng),說(shuō)明到后期兩株菌對(duì)木糖的利用率是相當(dāng)?shù)?,由此可知釀酒酵母中CIT2基因的敲除主要影響的是糖運(yùn)輸過(guò)程,并且此基因?qū)μ沁\(yùn)輸過(guò)程是抑制與阻礙作用,對(duì)于糖代謝過(guò)程是受糖運(yùn)輸過(guò)程影響,當(dāng)有豐富糖源供給時(shí)會(huì)增強(qiáng)糖代謝流向下游,但當(dāng)糖代謝過(guò)程達(dá)到一定程度后糖運(yùn)輸對(duì)糖代謝的推動(dòng)作用就會(huì)不明顯。綜上所述CIT2基因?qū)︶劸平湍咐媚咎蔷哂胸?fù)調(diào)控作用。

    根據(jù)Thomas等[23]進(jìn)行的研究結(jié)果,針對(duì)釀酒酵母中糖代謝過(guò)程中所涉及到的相關(guān)8個(gè)基因進(jìn)行熒光定量PCR分析,所得結(jié)果中6個(gè)相關(guān)基因ACO1、GND1、IDH2、SDH1、TDH3、TKL1的表達(dá)量均增加。根據(jù)這6個(gè)基因表達(dá)量的提高可知在糖運(yùn)輸作用加強(qiáng)后,釀酒酵母本身的糖代謝過(guò)程的底物量充足,促使其代謝過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)加強(qiáng),由于木糖代謝的加入,使得糖酵解本身向戊糖磷酸途徑加多,與木糖代謝一致轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油,因此TDH3(3-磷酸甘油醛脫氫酶)的表達(dá)量增加,隨之加強(qiáng)了糖代謝過(guò)程,轉(zhuǎn)向乙醇發(fā)酵。

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    Research on the Effects ofCIT2 Gene on Xylose Utilization of the RecombinantSaccharomycescerevisiae

    LI Wei-wei1,2, ZHANG Ji1, CHEN Chao-ru1, WANG Zhi1, QU Juan-juan2*, DUN Bao-qing1*, LI Gui-ying1, LU Ming1

    1.CropGeneticResourcesandGeneticImprovementofMajorNationalScienceandEngineering,InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China;2.College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

    Xylosefermentationisoneofthebottleneckofcellulosicethanolindustry.ThetransformationofSaccharomyces cerevisiaeforxylosemetabolismhasbecomeoneoftheresearchhotspotatpresent.InordertostudytheinfluenceofCIT2geneonxyloseutilizationofSaccharomyces cerevisiaestrainC5D-P-Mforglucoseandxyloseco-fermentation,theCIT2genedisruptioncassetteproducedbyoverlappingPCRtechnology,transformedintoC5D-P-MforknockoutofCIT2byhomologousrecombinationandmutantstrainC5D-P-M-CIT2Δwasgainedfinally.IncontrastwithC5D-P-M,thegrowthrate,glucoseutilization,xyloseutilization,andethanolproductionofC5D-P-M-CIT2Δhadimprovedtosomeextent.TheresultsuggestedCIT2geneisonefactorthatcaninfluencethexyloseutilizationanditsknockoutcanimprovexyloseutilizationofSaccharomyces cerevisiae.

    Saccharomyces cerevisiae; CIT2gene;geneknockout;xylosemetabolism

    2016-07-20; 接受日期:2016-09-30

    公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201503135-16)資助。

    李維維,碩士研究生,研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail: zhangji1140@126.com。*通信作者:曲娟娟,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)槲⑸镞z傳育種。E-mail:juanjuanqu@126.com;頓寶慶,副研究員,碩士生導(dǎo)師,主要從事生物質(zhì)能源及秸稈的綜合利用研究。E-mail:dunbaoqing@caas.cn

    10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.11

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