槐花多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響研究

李榮喬，賈東升，溫春秀，崔施展，劉靈娣，謝曉亮

（河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

槐花多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響研究

李榮喬，賈東升，溫春秀，崔施展，劉靈娣，謝曉亮*

（河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

研究槐花多糖對免疫低下小鼠的免疫功能的調節(jié)作用。采用腹腔注射環(huán)磷酰胺制造免疫抑制小鼠模型，考察槐花多糖對免疫抑制小鼠臟器指數(shù)、巨噬細胞吞噬功能、淋巴細胞增殖活性、血清IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ水平、溶血素水平和溶血空斑形成數(shù)量的影響。結果表明槐花多糖能明顯提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、巨噬細胞吞噬能力、脾淋巴細胞的增殖能力、溶血素含量和溶血空斑形成數(shù)量，促進細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ分泌。槐花多糖具有免疫增強活性，具有良好的開發(fā)應用潛力。

槐花；多糖；免疫功能

槐花為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾或花，主產(chǎn)于我國北部、華南及西南地區(qū)，其中河北省產(chǎn)量較為豐富?；被ㄔ谖覈秤脷v史悠久，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其富含多糖、多酚、黃酮、氨基酸、蛋白質、揮發(fā)油、有機酸及微量元素等多種成分[1-2]，具有輔助降血壓、降血糖、增強免疫力等功效。多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵鏈接而成的聚糖，是生物體內(nèi)一類重要的大分子，具有提高免疫能力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒等功能，是現(xiàn)代醫(yī)學和食品功能化學共同的研究焦點。目前槐花的研究主要集中在其黃酮類化合物及揮發(fā)油的提取、純化及其開發(fā)利用方面，而對多糖的研究卻鮮有報道。本研究采用水提醇沉法從槐花中提取槐花多糖，采用透析、離子交換層析和分子篩層析對多糖進行分離純化得到純度較高的槐花多糖，考察其對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，以期為槐花的開發(fā)利用提供一定試驗支持。

1 試驗材料

1.1 試劑

環(huán)磷酰胺（CTX，批號：13110925）：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：上海浩然生物技術有限公司；刀豆素A（ConA）：江蘇揚州科能生物科技有限公司；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）：北京索萊寶科技有限公司；都氏試劑：sigma公司；IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ試劑盒：美國BD公司；DEAESephadex A-25、Sephacryl-200：上海純優(yōu)生物科技有限公司；豚鼠血清、雞紅細胞：上海晶天生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

RE52CS-1旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1B-50真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；EP2.5 96孔板離心機：廣州科僑實驗技術設備有限公司；752PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MK3型酶標儀：Thermo Fisher。

1.3 材料

槐花：購于安國中藥材市場；小白鼠（昆明種）：購于河北醫(yī)科大學動物室。

2 試驗方法

2.1 槐花多糖制備與含量測定

水提醇沉法制備槐花粗多糖，粗多糖經(jīng)Sevag法脫除蛋白，采用截留分子量為3 000的透析袋透析、DEAE-Sephadex A-25離子交換層析、Sephacryl-200分子篩層析分離獲得高純度槐花多糖[3]，濃縮、冷凍干燥后得槐花多糖干燥粉，苯酚-硫酸法測定多糖含量。

2.2 槐花多糖免疫活性測定

2.2.1 小鼠分組與造模處理

將75只昆明種小鼠（體重17 g～21 g，雌性37只，雄性38只）隨機平均分成空白對照組、模型對照組和槐花多糖低、中、高劑量組（低、中、高劑量分別為50、1 00、200mg/kg）共5組。正常飼養(yǎng)10天后，空白對照組每天腹腔注射和灌胃生理鹽水各0.3mL；模型對照組每天腹腔注射CTX 30mg/kg，灌胃生理鹽水0.3mL；槐花多糖低、中、高劑量組小鼠分別每天灌胃多糖溶液0.3mL，同時腹腔注射CTX 30mg/kg，分別給藥21 d。

2.2.2 小鼠臟器指數(shù)測定

胸腺和脾臟是機體重要免疫器官，是淋巴細胞分化成熟的重要場所，其重量可間接反映機體免疫水平。末次給藥1天后，各實驗組取5只小鼠秤取活重，摘眼球取血后脫頸椎處死，摘取胸腺和脾臟，洗凈、吸干后稱重，按式（1）計算胸腺和脾臟指數(shù)。

2.2.3 腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定

腹腔巨噬細胞在機體特異性和非特異性免疫中均具有重要功能。各實驗組取5只小鼠，末次給藥后腹腔注射10%雞紅細胞0.5mL，10 h后脫頸椎處死，剪開腹部皮膚用生理鹽水沖洗[4]，吸取腹腔沖洗液滴于載玻片上，37℃孵育30min，用生理鹽水漂洗，干燥后用固定液（丙酮∶甲醇=1∶1）固定，瑞氏染液染色，利用油鏡觀察，計數(shù)，按式（2）和式（3）計算吞噬率及吞噬指數(shù)[4-5]。

2.2.4 脾淋巴細胞增殖活性的測定

脾淋巴細胞轉化能力是評價機體細胞免疫功能的主要指標。取“2.2.2”所得小鼠脾臟，制備脾細胞并調整濃度[6]，各取脾細胞1mL至24孔培養(yǎng)板中，加入200mg/LConA溶液75μL，RPMI-1640完全培養(yǎng)液代替ConA做對照，培養(yǎng)72 h[7]。培養(yǎng)68 h后各取上清液0.7mL，加入RPMI-1640（不含小牛血清）培養(yǎng)液0.7mL和已除菌的5mg/mLMTT溶液80μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后各加入酸性異丙醇1mL，混合均勻，每孔3個平行轉移至96孔培養(yǎng)板中，利用酶標儀于570nm處測定吸光值[8-10]，按式（4）計算淋巴細胞增殖指數(shù)。

式中：A處理為加ConA孔吸光值；A對照為空白孔吸光值。

2.2.5 血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ的測定

細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和TNF-γ在機體免疫細胞活化過程中起促進作用。取2.2.2摘眼球所取血液，離心取血清，按試劑盒的說明操作，檢測各組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ水平。

2.2.6 溶血素及溶血空斑形成測定

血清溶血素和溶血空斑水平與機體體液免疫水平相關。于“2.2.1”方法基礎上，給藥第一天各組取5只小鼠腹腔注射5%的雞紅細胞0.3mL進行免疫，末次給藥1 h后摘取眼球取血，離心取血清用生理鹽水稀釋，將稀釋血清、5%雞紅細胞和10%新鮮豚鼠血清以2∶1∶1（體積比）比例混勻，以生理鹽水代替豚鼠血清做空白對照，37℃保溫30min，4℃離心，于540 nm處測定上清液的吸光值，檢測溶血素水平[11]。

小鼠取血致死后，取脾臟并勻漿，用都氏液調整細胞個數(shù)至4×109/mL。將脾細胞懸液、0.2%雞紅細胞和10%新鮮豚鼠血清以1∶1∶1（體積比）比例混勻，生理鹽水代替豚鼠血清做空白對照，37℃保溫1 h，離心，于413 nm處測定上清液的吸光值，檢測溶血空斑數(shù)量[11]。

2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS9.1軟件進行統(tǒng)計分析，以平均值±標準差（±SD）表示數(shù)值，差異顯著性分析采用單因素方差分析。

3 結果與分析

3.1 槐花多糖含量測定

多糖含量測定標準曲線：Y=0.005 7X+0.041 2，R2= 0.999 1，槐花純化多糖的得率為2.15%，多糖含量為91.33%。

3.2 槐花多糖對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

槐花多糖對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響見表1。

表1 槐花多糖對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響（±SD）Table1 Effectof SFP on immuneorgan indexes in immunosuppressivem ice（±SD）

表1 槐花多糖對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響（±SD）Table1 Effectof SFP on immuneorgan indexes in immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；★★與模型組比較P<0.01。

組別 劑量/（mg/kg） 胸腺指數(shù)/（mg/g） 脾臟指數(shù)/（mg/g）正常組 0 3.713±0.402 5.327±0.493模型組 0 1.487±0.153▲▲ 3.234±0.356▲▲低劑量組 50 1.751±0.172★ 3.673±0.437中劑量組 100 2.312±0.292★★ 4.036±0.486★高劑量組 200 3.254±0.324★★ 4.638±0.482★★

由表1可以看出，模型組小鼠臟器指數(shù)均顯著降低（P<0.01），造模成功。50mg/kg槐花多糖可以顯著增加胸腺重量，但對脾臟重量無影響；100mg/kg槐花多糖可以增加脾臟重量，對胸腺增重影響極顯著；200mg/kg槐花多糖對胸腺和脾臟增重均有極顯著影響。

3.3 槐花多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

槐花多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響見表2。

表2 槐花多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±SD）Table2 Effectof SFP on abdom inalcavitymacrophage function in immunosuppressivem ice（±SD）

表2 槐花多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±SD）Table2 Effectof SFP on abdom inalcavitymacrophage function in immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；★★與模型組比較P<0.01。

組別 劑量/（mg/kg） 吞噬率/% 吞噬指數(shù)正常組 0 42.568±5.563 0.562±0.063模型組 0 27.362±3.462▲▲ 0.354±0.042▲▲低劑量組 50 31.416±3.049 0.382±0.043中劑量組 100 35.372±4.283★ 0.421±0.045★高劑量組 200 40.134±4.361★★ 0.503±0.054★★

由表2可以看出，模型組小鼠巨噬細胞的吞噬功能顯著降低（P<0.01），造模成功。50mg/kg槐花多糖對巨噬細胞的吞噬功能無顯著影響，100mg/kg槐花多糖可以顯著提高巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)；當槐花多糖劑量達200mg/kg時可以極顯著提高吞噬率和吞噬指數(shù)。

3.4 槐花多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

槐花多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響見表3。

表3 槐花多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響（±SD）Table3 Effectof of SFP on lymphocyte proliferation in imm unosuppressivem ice

表3 槐花多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響（±SD）Table3 Effectof of SFP on lymphocyte proliferation in imm unosuppressivem ice

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05。

組別 劑量/（mg/kg） 脾淋巴細胞增殖指數(shù)正常組 0 89.426±9.164模型組 0 65.437±7.531▲▲低劑量組 50 70.762±7.537中劑量組 100 74.742±7.513高劑量組 200 79.260±7.433★

由表3可以看出，模型組小鼠脾淋巴細胞的增殖能力顯著降低（P<0.01），造模成功。50mg/kg和100mg/kg槐花多糖對淋巴細胞增殖活性無顯著影響，當劑量達200mg/kg時可以顯著提高淋巴細胞增殖活性。

3.5 槐花多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影響

槐花多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影響見表4。

表4 槐花多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影響（±SD）Table4 Effectof SFP on the the levalof IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α，TNF-γin immunosuppressivem ice（±SD）

表4 槐花多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影響（±SD）Table4 Effectof SFP on the the levalof IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α，TNF-γin immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；★★與模型組比較P<0.01。

組別 劑量/（mg/kg） IL-2/（pg/mL） IL-4/（pg/mL） IL-6/（pg/mL） TNF-α TNF-γ正常組 0 32.173±2.658 37.656±3.912 248.712±54.631 467.292±100.215 1.048±0.214模型組 0 14.415±1.533▲▲ 22.562±2.734▲▲ 113.562±13.655▲▲ 254.167±25.149▲▲ 0.455±0.076▲▲低劑量組 50 17.257±2.169★ 25.224±2.613 138.657±22.397 295.345±30.632★ 0.526±0.082中劑量組 100 21.516±2.327★★ 28.572±3.013★ 164.198±32.338★ 317.326±35.461★ 0.616±0.091★高劑量組 200 26.537±3.206★★ 30.261±3.672★★ 182.354±37.335★★ 362.725±42.068★★ 0.725±0.115★★

由4可以看出，模型組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。50mg/kg槐花多糖可以顯著提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和TNF-α含量，對IL-4、IL-6、TNF-γ含量無顯著影響；100mg/kg槐花多糖可以顯著提高血清中IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量，對IL-2含量增加有極顯著影響；當槐花多糖劑量達200mg/kg時對IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ水平提高均有極顯著影響。

3.6 槐花多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響

槐花多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響見表5。

表5 槐花多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響（±SD）Table5 Effectof SFP on the formation of hemolysin and hem olytic plaque in immunosuppressivem ice（±SD）

表5 槐花多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響（±SD）Table5 Effectof SFP on the formation of hemolysin and hem olytic plaque in immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；★★與模型組比較P<0.01。

溶血空斑A413nm（n=5）正常組 0 0.535±0.052 0.352±0.043模型組 0 0.335±0.028▲▲ 0.182±0.031▲▲低劑量組 50 0.376±0.037 0.213±0.029中劑量組 100 0.417±0.047★ 0.246±0.037★高劑量組 200 0.465±0.056★★ 0.283±0.034★★組別 劑量/（mg/kg） 溶血素A540nm（n=10）

由表5可以看出，模型組小鼠溶血素水平和溶血空斑形成數(shù)量與正常組相比顯著下降，造模成功。50 mg/kg槐花對免疫抑制小鼠血清溶血素水平、溶血空斑水平均無無顯著影響；100mg/kg槐花多糖對溶血素和溶血空斑水平提高有顯著影響；當槐花多糖劑量達200mg/kg時可極顯著提高溶血素和溶血空斑水平。

4 討論

本研究通過注射藥物CTX建立小鼠免疫功能低下模型。注射CTX后小鼠免疫器官脾臟和胸腺重量減輕，腹腔巨噬細胞吞噬率、淋巴細胞增殖指數(shù)、血清溶血素和溶血空斑水平、細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和TNF-γ水平與對照組相比均明顯下降，免疫抑制模型造模成功。通過試驗發(fā)現(xiàn)，50mg/kg槐花多糖可以顯著顯著增加胸腺重量，提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和TNF-α含量；100mg/kg槐花多糖可以顯著提高巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)、溶血素和溶血空斑水平，提高血清中IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量，對IL-2含量增加有極顯著影響；當槐花多糖劑量達200mg/kg時可以顯著提高淋巴細胞增殖活性，對吞噬率和吞噬指數(shù)增加和IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ、溶血素和溶血空斑水平提高均有極顯著影響。綜上，槐花多糖對免疫抑制小鼠的免疫反應起正調節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)槐花多糖對免疫低下小鼠的非特異性免疫系統(tǒng)、細胞免疫和體液免疫功能均有重要的促進作用。有研究報道，多糖的活性很大程度上與其結構相關，經(jīng)化學修飾后多糖生物活性會明顯增強或產(chǎn)生新的活性[11-12]，因此，為充分發(fā)揮槐花多糖的功效，有以下工作需要進一步展開：（1）研究槐花多糖的結構，如單糖構成、硫酸基團的位置，硫酸化程度以及糖苷鍵的位置、分子質量等；（2）探討槐花多糖改善免疫功能的作用機理；（3）通過硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙?；?、烷基化、硒化等修飾進一步提高其改善免疫功能活性，并對槐花多糖的其他生物活性進行研究。

[1]胡喜蘭,姜琴,尹福軍,等.正交實驗優(yōu)選槐花多糖的最佳提取工藝及抑菌活性研究[J].食品科技,2012,37(4):164-167

[2]王麗華.槐花多糖的分離純化與抗氧化活性研究[D].西安:陜西師范大學,2008:1-3

[3]邱偉芬,楊文建,薛梅,等.條斑紫菜多糖的純化、理化性質及其免疫活性研究[J].食品科學,2013,34(23):51-56

[4] Pradip P,Sunil K B,Ipsita K S,et al.Structural and immunological studiesofhetero polysaccharide isolated from the alkaline extractof Tricholoma crassum(Berk.)Sacc[J].Carbohydrate Research,2012, 362(15):1-7

[5]王凌,孫利芹,周妍.小球藻多糖體外免疫調節(jié)活性研究[J].食品研究與開發(fā),2013,34(7):30-32

[6]宋美芳,李光,陳曦,等.兩種石斛多糖提高小鼠免疫活性的初步研究[J].中國藥學雜志,2013,48(6):428-430

[7] 鐘義紅,孫杰,李世芬,等.針葉櫻桃提取物增強小鼠細胞與體液免疫功能[J].食品研究與開發(fā),2014,35(12):76-79

[8] Guoting Cui,Wuxia Zhang,Qingjie Wang,et al.Extraction optimization,characterization and immunity activity of polysaccharides from Fructus Jujubae[J].Carbohydrate Polymers,2014,111(15):245-255

[9]魏穎,谷瑞增,林峰,等.烏雞肽免疫調節(jié)作用的研究[J].食品研究與開發(fā),2014,35(16):1-4

[10]劉梁,孫維礦,趙玲.米糠多糖的免疫增強作用[J].食品研究與開發(fā),2014,35(22):24-27

[11]陳美珍,余杰,楊拉維,等.龍須菜多糖硫酸化對免疫活性的影響[J].食品科學,2010,21(15):278-282

[12]Wijesekara I,Pangestuti R,Kim SK.Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine alga[J].Carbohydrate Polymers,2011,84(1):14-21

Investigation on the Influence of Polysaccharide From Sophora japonica Flower Polysaccharides on Imm unological Function of M ice

LIRong-qiao，JIADong-sheng，WENChun-xiu，CUIShi-zhan，LIU Ling-di，XIEXiao-liang*
（CentreofMedicinal PlantResearch，InstituteofCash CropsofHebeiAcademyofAgricultureand Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

To investigate the effectof Sophora japonica flower polysaccharides（SFP）on immume function in immunosuppressivemice.Micewere injected with CTX to establish the immunosuppressivemodel.The effectsof differentdosesof SFPon the index of thymusand spleen，peritonealmacrophage activity，lymphocyte proliferation activity，the levelsof IL-2，IL-4，blood serum hemolysin and hemolytic plaque inmicewere detected.SFP waseffective in improving the immune function of immunosuppressivemice，improved the index of thymusand spleen，the phagocytic activity ofperitonealmacrophage，the proliferation activity of splenic lymphocytes，the formation ofhemolysin and hemolytic plaque，promote the secretion levelof IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α，TNF-γ. SFPcould enhance the immunologicalactivity，showed agood exploitability.

Sophora japonica flower；polysaccharide；immunological function

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.037

2016-03-16

河北省中藥材產(chǎn)業(yè)體系項目（2013001D）；河北省農(nóng)林科學院青年基金項目（A2015 050101）；河北太行山區(qū)特色功能保健食品的開發(fā)研究（11231005D）

李榮喬（1989—），女（漢），碩士研究生，主要從事功能食品開發(fā)研究。

*通信作者：謝曉亮（1962—），男（漢），研究員，博士，主要從事中藥資源、中藥加工研究。