• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    肉及肉制品中大鼠成分PCR檢測(cè)方法研究

    2016-12-22 02:47:55李宗夢(mèng)趙良娟馬興趙宏鄭文杰張宏偉武鵬程尹長(zhǎng)城
    食品研究與開發(fā) 2016年24期
    關(guān)鍵詞:肉制品空白對(duì)照靈敏度

    李宗夢(mèng),趙良娟,馬興,趙宏,鄭文杰,張宏偉,武鵬程,尹長(zhǎng)城

    (1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心,天津300461;2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司,北京101318)

    肉及肉制品中大鼠成分PCR檢測(cè)方法研究

    李宗夢(mèng)1,趙良娟1,馬興1,趙宏1,鄭文杰1,張宏偉1,武鵬程2,尹長(zhǎng)城2

    (1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心,天津300461;2.北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司,北京101318)

    我國(guó)肉類摻假現(xiàn)象屢禁不止,尤以使用來(lái)源不明的鼠肉冒充高價(jià)肉販賣最為惡劣。褐家鼠(Rattusnorvegicus)俗稱大鼠,由于分布廣、數(shù)量多、體型較大的特點(diǎn)最容易成為肉類摻假的來(lái)源。針對(duì)我國(guó)缺乏肉及肉制品中大鼠成分檢測(cè)方法的問(wèn)題,本研究針對(duì)包括大鼠在內(nèi)的共17種動(dòng)物線粒體cytb基因序列進(jìn)行分析比對(duì),設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物。該方法特異性好,可檢出混合樣品中低至0.1%的大鼠成分,靈敏度較高。結(jié)果表明,本方法對(duì)熱處理混合肉樣品和市售樣品也具有較好的檢測(cè)能力,靈敏度達(dá)到0.1%。本研究為肉類食品安全監(jiān)管提供了新方法。

    肉制品;PCR;大鼠;食品摻假

    2013年初隨著歐洲“馬肉風(fēng)波”這一食品安全事件的發(fā)生,食品摻假這一全球性問(wèn)題引發(fā)了公眾對(duì)食品安全的擔(dān)憂以及各國(guó)政府的關(guān)注。我國(guó)常見肉類摻假現(xiàn)象多以在牛羊肉中摻入價(jià)格便宜的豬肉、鴨肉為主,更為惡劣的是有媒體報(bào)道某些不法商販用死老鼠肉制成羊肉串進(jìn)行販賣。此類惡性摻假行為多見于流動(dòng)攤販,難于監(jiān)管。作為各種疫病傳播的載體,人食用鼠肉制品存在感染疫病的風(fēng)險(xiǎn),還可能導(dǎo)致鼠藥二次中毒。由此可見,此類惡性肉類摻假事件已經(jīng)嚴(yán)重威脅到消費(fèi)者健康和公共安全,對(duì)政府監(jiān)管部門和檢測(cè)機(jī)構(gòu)提出了新的挑戰(zhàn)。

    褐家鼠(Rattusnorvegicus),別稱溝鼠、大家鼠或挪威鼠,是我國(guó)最常見和危害最大的一種家鼠。由于其體型大、分布廣、數(shù)量大,最容易成為鼠肉摻假的來(lái)源。除此之外,用于科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)大鼠,如Wistar大鼠[1]、Sprague Dawley大鼠[2]等也屬于褐家鼠種。此類大鼠使用量大且經(jīng)過(guò)未知藥物處理,其肉制品一旦流入市場(chǎng),將對(duì)食品安全造成嚴(yán)重威脅。

    近年來(lái)基于核酸和蛋白質(zhì)的多種分子生物學(xué)物種鑒定方法被相繼開發(fā)和應(yīng)用。相較于蛋白質(zhì),DNA熱穩(wěn)定性高,物種間多態(tài)性豐富,使其成為重要分子靶標(biāo)。其中,線粒體DNA在細(xì)胞中含量豐富,進(jìn)化速度快,用作遺傳分析靈敏度高,具有較高的種間多樣性和較低的種內(nèi)變異[3-5]。常用的線粒體靶基因有細(xì)胞色素b(cytb)基因[6-8]、12S和16S核糖體RNA亞基[9-10]、D-loop區(qū)[11-13]等?;诰€粒體靶基因設(shè)計(jì)特異性引物,應(yīng)用單重或多重PCR技術(shù)對(duì)動(dòng)物源性成分進(jìn)行定性或半定量鑒別已被研究者廣泛采用[14-18]。然而,鼠源性成分尤其是大鼠成分鑒定的研究較少且大多以細(xì)胞系污染分析為目的。如Almeida等采用多重PCR及測(cè)序技術(shù)分析小鼠細(xì)胞系中短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat)進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行鑒別[19]。Higgins等采用單重PCR法,使用商品化試劑盒對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞系進(jìn)行鑒別以區(qū)分大鼠、小鼠來(lái)源的細(xì)胞系污染[20]。食品中尤其是肉及肉制品中鼠源性成分鑒別方法鮮見報(bào)道。

    本研究通過(guò)分析褐家鼠(Rattusnorvegicus)及其他常見畜禽品種線粒體細(xì)胞色素b(cytb)基因序列,設(shè)計(jì)并篩選可特異性擴(kuò)增褐家鼠目的片段的PCR引物,所得PCR產(chǎn)物大小為397 bp。結(jié)果顯示,該方法特異性好,靈敏度可達(dá)到0.1%,適用于肉及肉制品中大鼠源性成分檢測(cè)。

    1 材料

    1.1 樣品

    大鼠新鮮組織樣本由天津中醫(yī)藥大學(xué)饋贈(zèng)。其余16種用于特異性實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物樣本或基因組DNA為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備樣品,均在識(shí)別動(dòng)物整體形態(tài)條件下采樣,經(jīng)過(guò)基因組測(cè)序和比對(duì)確認(rèn)為相應(yīng)物種。靈敏度實(shí)驗(yàn)中作為基質(zhì)的羊肉樣品購(gòu)買于本地超市,依照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法》確認(rèn)羊成分。從天津市濱海新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、燒烤攤共購(gòu)買18份羊肉制品。其中羊肉串9份、冷凍羊肉卷、羊肉片6份、羊肉餡3份。從福建省寧化縣、龍巖、南平及廣西宜州購(gòu)買可食用鼠肉制品共4份,均為熏制鼠肉干。所有樣品使用無(wú)菌水清洗去除多余的腌漬醬料、骨、皮部分,使用潔凈的均質(zhì)器進(jìn)行混勻。

    1.2 儀器與試劑

    主要儀器包括終點(diǎn)PCR儀(PTC-200,MJResearch,加拿大),GelDoc XR凝膠分析系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories,美國(guó)),核酸蛋白分析儀(1510,Thermo Fisher,美國(guó))。動(dòng)物組織基因組提取試劑盒購(gòu)自Promega公司;HSEx Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、6 x Loading Buffer購(gòu)自大連寶生物公司。引物合成和測(cè)序均由上海生物工程公司完成。

    1.3 引物設(shè)計(jì)

    從GenBank中獲得大鼠及其他16種常見畜禽動(dòng)物線粒體cytb基因序列,物種及序列信息見表1。

    表1 物種GenBank序列號(hào)Table1 GenBank accession number of anim als

    使用Geneious6.0(Biomatters Ltd.,New Zealand)進(jìn)行序列分析,設(shè)計(jì)大鼠特性引物Rat-CYT-F1/R1。擴(kuò)增片段大小為397 bp,引物序列見表2。

    表2 大鼠PCR引物序列Table2 Primer sequenceof ratspecific PCR

    2 方法

    2.1 基因組DNA提取

    依照Promega公司動(dòng)物組織基因組提取試劑盒操作說(shuō)明對(duì)本研究中所有動(dòng)物組織進(jìn)行基因組DNA提取,初始樣本量為10mg。

    2.2 核酸純度及濃度測(cè)定

    提取的DNA樣品采用核酸蛋白分析儀進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。A260/A280比值介于1.8~2.0之間的DNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

    2.3 PCR反應(yīng)體系

    20μLPCR反應(yīng)體系中含10×PCR buffer(含Mg2+)2μL;10mmol/LdNTP混合液2μL;引物(5μmol/L)各0.8μL;HSEx Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL;DNA模板(10μg/mL)1μL。

    2.4 PCR擴(kuò)增條件

    94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃ 30 s;72℃5min,30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 引物特異性實(shí)驗(yàn)

    采用2.3、2.4中PCR體系及反應(yīng)條件,以無(wú)菌水為空白對(duì)照,對(duì)雞、鴨、鵝、貓、狗、豬、馬、牛、水牛、綿羊、驢、鹿、駱駝、兔、貂、狐貍以及大鼠基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證引物的特異性。擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

    圖1 引物特異性實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gelelectrophoresisof PCR products in specificity test

    如圖1所示,引物Rat-CYT-F1/Rat-CYT-R1對(duì)大鼠DNA擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶,擴(kuò)增片段大小為397 bp。其他16個(gè)物種及空白對(duì)照擴(kuò)增為陰性,說(shuō)明該引物對(duì)檢測(cè)大鼠成分具有良好的特異性。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序、比對(duì),結(jié)果顯示擴(kuò)增片段序列分別與大鼠cytb基因目的片段具有100%同源性,進(jìn)一步確證了PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。

    3.2 絕對(duì)靈敏度實(shí)驗(yàn)

    將大鼠基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,制成100、10、1、0.1、0.01μg/mL的模板。以無(wú)菌水為空白對(duì)照,按2.3、2.4中反應(yīng)體系對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

    圖2 絕對(duì)靈敏度實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Gelelectrophoresisof PCR products in absolutesensitivity test

    結(jié)果顯示,隨稀釋度增加,大鼠陽(yáng)性擴(kuò)增條帶逐漸減弱,其中模板濃度為100、10、1、0.1μg/mL時(shí)均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。而0.01μg/mL及空白對(duì)照擴(kuò)增為陰性。確定其最低絕對(duì)靈敏度為0.1μg/mL。

    3.3 實(shí)際靈敏度實(shí)驗(yàn)

    選用常見摻假對(duì)象羊肉作為基質(zhì)肉,制備大鼠肉與基質(zhì)肉的梯度混合樣品?;旌媳壤秊?0%、1%、0.1%、0.01%?;旌先鈽悠愤M(jìn)行基因組DNA提取,濃度調(diào)整為10μg/mL。以大鼠DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以羊DNA作為陰性對(duì)照,以無(wú)菌水作為空白對(duì)照,按2.3、2.4中反應(yīng)體系對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

    圖3 實(shí)際靈敏度實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Gelelectrophoresisof PCR productsam plified from meat m ixture

    結(jié)果顯示,大鼠陽(yáng)性對(duì)照、比例為10%、1%、0.1%的大鼠肉、羊肉混合樣品均能擴(kuò)增出條帶。隨大鼠肉混合比例下降,條帶亮度有下降趨勢(shì)。而0.01%混合比例及陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。該結(jié)果顯示本方法可用于檢測(cè)混合肉中大鼠成分,靈敏度可達(dá)到0.1%。

    3.4 高溫處理對(duì)方法靈敏度的影響

    將3.3中所述大鼠肉、羊肉混合樣品經(jīng)100℃處理30min,按2.1所述方法進(jìn)行基因組DNA提取。以大鼠DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以羊DNA作為陰性對(duì)照,以無(wú)菌水作為空白對(duì)照,按2.3、2.4中反應(yīng)體系對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

    圖4 高溫處理樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Gelelectrophoresisof PCR productsam plified from heat treatedm eatm ixture

    結(jié)果顯示,10%、1%、0.1%混合肉樣品經(jīng)過(guò)高溫處理后仍可以成功擴(kuò)增出目的條帶,隨大鼠成分比例下降,條帶擴(kuò)增亮度下降趨勢(shì)相較于未經(jīng)熱處理樣品更為明顯(見圖3)。而0.01%混合比例及陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。此結(jié)果說(shuō)明經(jīng)高溫處理的樣品應(yīng)用本方法時(shí),擴(kuò)增效率會(huì)有所降低,但仍能將0.1%混合比例的樣品中大鼠成分檢出,方法穩(wěn)健性較好。

    3.5 市售肉類樣品檢測(cè)

    以大鼠DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以無(wú)菌水為空白對(duì)照,用建立的方法對(duì)18份市售羊肉制品及4份鼠肉制品進(jìn)行大鼠成分檢測(cè)。結(jié)果見圖5。

    圖5 市售肉類樣品大鼠成分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Gelelectrophoresisof PCR productsamplified from comm ercialm eat products

    凝膠電泳結(jié)果顯示,從市面購(gòu)得的所有羊肉制品均未檢出大鼠成分,而4種鼠肉制品均檢出大鼠成分??瞻讓?duì)照則無(wú)擴(kuò)增。將4種鼠肉制品PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠基因序列具有>99%同源性。

    4 結(jié)論

    考慮到經(jīng)濟(jì)利益和可獲得性,小鼠體型小、可獲得肉含量不足以驅(qū)使鼠肉摻假行為。而分布最廣、來(lái)源多、肉含量大的褐家鼠(大鼠)則可能成為不法分子非法添加的目標(biāo)。為解決我國(guó)肉及肉制品中大鼠成分檢測(cè)方法不足的問(wèn)題,本研究通過(guò)搜集大鼠及其他16種常見畜禽動(dòng)物線粒體cytb基因序列并進(jìn)行分析比對(duì),設(shè)計(jì)篩選出大鼠特異性引物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法對(duì)16種動(dòng)物基因組DNA均無(wú)非特異擴(kuò)增,具有很好的特異性。在肉制品加工過(guò)程中常見的腌制、熏制及高溫加熱等處理方式往往造成DNA損傷或降解,最終影響獲得的DNA質(zhì)量[21]。結(jié)果表明,本方法可成功檢測(cè)混合生肉制品及熱處理混合肉制品中大鼠成分,靈敏度為0.1%,對(duì)于加工肉制品也具有一定的適用性。Fang等報(bào)道了采用Taqman探針?lè)蓪?duì)鼠源性成分進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增,但該方法無(wú)法區(qū)分大鼠、小鼠成分[22]。此外,實(shí)時(shí)熒光PCR方法成本高,對(duì)技術(shù)人員要求也較高,不利于推廣使用。本方法基于傳統(tǒng)PCR方法,成本低、操作簡(jiǎn)便,更適用于一些經(jīng)費(fèi)有限的實(shí)驗(yàn)室采用,有助于相關(guān)部門對(duì)肉類食品安全實(shí)施監(jiān)管。

    [1] Clause B T.TheWistar Institute Archives:Rats(NotMice)and History[J].MendelNewsletter,1998,2(7):20-24

    [2] Crincoli CM,Nikiforov A I,Rihner M O,et al.A 90-day oral(dietary)toxicity and mass balance study of corn starch fiber in Sprague Dawley rats[J].Food Chem Toxicol,2016,97(11):57-69

    [3]Murugaiah C,Noor ZM,Mastakim M,etal.Meatspecies identification and Halal authentication analysis usingmitochondrial DNA[J]. MeatScience,2009,83(1):57-61

    [4] Girish PS,Anjaneyulu A S,Viswas K N,etal.Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)ofmitochondrial 12S rRNA gene[J]. MeatScience,2005,70(1):107-112

    [5]V Fajardo,IGonzález,M Rojas,etal.A review of currentPCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J].Trends in Food Science&Technology,2010,21(8):408-421

    [6] Tobe SS,Linacre A M.A multiplex assay to identify 18 European mammal species from mixtures using themitochondrial cytochrome b gene[J].Electrophoresis,2008,29(2):340-347

    [7] Kumar D,Singh SP,Karabasanavar N S,et al.Authentication of beef,carabeef,chevon,mutton and pork by a PCR-RFLP assay of mitochondrial cytb gene[J].JFood SciTechnol,2014,51(11):3458-3463

    [8]BarakatH,El-Garhy H A,MoustafaMM.Detection ofpork adulteration in processed meat by species-specific PCR-QIAxcel procedurebased on D-loop and cytb genes[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2014,98(23):9805-9816

    [9] Karlsson A O,Holmlund G.Identification ofmammal species using species-specific DNA pyrosequencing[J].Forensic Sci Int,2007, 173(1):16-20

    [10]Abuzinadah OH,Yacoub H A,El AshmaouiH M,etal.Molecular detection ofadulteration in chicken productsbased onmitochondrial12S rRNA gene[J].MitochondrialDNA,2015,26(3):337-340

    [11]Mane BG,Mendiratta SK,Tiwari A K.Polymerase chain reaction assay for Identification of chicken in meat and meat products[J]. Food Chem,2009,116(3):806-810

    [12]Girish PS,Haunshi S,Vaithiyanathan S,et al.A rapidmethod for authentication of Buffalo(Bubalusbubalis)meatby Alkaline Lysis method ofDNA extraction and speciesspecific polymerase chain reaction[J].JFood SciTechnol,2013,50(1):141-146

    [13]Karabasanavar N S,Singh SP,Kumar D,et al.Detection of pork adulteration by highly-specific PCR assay ofmitochondrial D-loop [J].Food Chem,2014,145(4):530-534

    [14]Kesmen Z,Sahin F,Yetim H.PCR assay for the identification ofanimalspecies in cooked sausages[J].MeatScience,2007,77(4):649-653

    [15]Martín I,García T,Fajardo V,et al.Technical note:detection of chicken,turkey,duck,and goose tissues in feedstuffsusing speciesspecific polymerase chain reaction[J].JAnim Sci,2007,85(2):452-458

    [16]段慶梓,尚柯,張玉,等.多重PCR法用于雞、鴨肉源性的鑒定[J].食品研究與開發(fā),2014,35(5):90-93

    [17]Di Pinto A,Forte V T,Conversano M C,et al.Duplex polymerase chain reaction fordetection ofporkmeatinhorsemeat fresh sausages from Italian retailsources[J].Food Contr,2005,16(5):391-394

    [18]Karabasanavar N S,Singh SP,Kumar D,et al.Detection of pork adulteration by highly-specific PCR assay ofmitochondrial D-loop [J].Food Chem,2014,145(4):530-534

    [19]Almeida JL,Hill CR,Cole K D.Mouse cell line authentication[J]. Cytotechnology,2014,66(1):133-147

    [20]Higgins SC,Steingrimsdottir H,Pilkington G J.Human,mouse or rat?Species authentication of glioma-derived cell cultures[J].J NeurosciMethods,2010,194(1):139-143

    [21]Saez R,Sanz Y,ToldráF.PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection of animalspecies inmeatproducts[J].MeatScience, 2004,66(3):659-665

    [22]Fang X,Zhang C.Detection of adulterated murine components in meatproductsby TaqMan C real-time PCR[J].Food Chem,2016, 192(1):485-490

    Detection of Rat Com ponents in M eat and M eat Products by PCR

    LIZong-meng1,ZHAO Liang-juan1,MAXing1,ZHAOHong1,ZHENGWen-jie1,ZHANGHong-wei1,WUPeng-cheng2,YINChang-cheng2
    (1.Animal,Plantand Foodstuffs Inspection Center,Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300461,China;2.Beijing Protein Innovation Co.,Ltd.,Beijing101318,China)

    Meat fraud has been a problem for a long time in China.Adulteration ofmurinemeatwith unknown resource intohigh pricedmeathasbeen theworst.Brown rat(Rattusnorvegicus)which isnormally referred asrathasbecome themost possible resource formeatadulteration due to its broad distributions,large population and bigger size.There is lack ofdetectionmethod aimingat ratcomponents inmeatandmeatproducts in China. In this study,sequences of cytb gene coming from 17 animal species including ratwas analyzed and a pair of primers specifically targeting ratwas designed.The primers showed high specificity and sensitivity bywhich 0.1 %of ratmeat inmeatmixturewasdetectable.Moreover,thismethod wasalsoapplied to heat treatedmeatmixturesand commercialmeatproductswith sensitivity of0.1%.Thisstudy provided anew tool to control thequality ofmeatproducts forofficial laboratories.

    meatproducts;PCR;rat;food fraud

    10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.026

    2016-10-24

    國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2015IK278)

    李宗夢(mèng)(1983—),女(漢),工程師,博士,研究方向:食品安全檢測(cè)。

    猜你喜歡
    肉制品空白對(duì)照靈敏度
    蘇丹將擴(kuò)大牲畜和肉制品出口市場(chǎng)
    例析陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照在高中生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    導(dǎo)磁環(huán)對(duì)LVDT線性度和靈敏度的影響
    過(guò)表達(dá)H3K9me3去甲基化酶對(duì)豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁(yè))圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    地下水非穩(wěn)定流的靈敏度分析
    穿甲爆破彈引信對(duì)薄弱目標(biāo)的靈敏度分析
    8 種外源激素對(duì)當(dāng)歸抽薹及產(chǎn)量的影響
    GC-O風(fēng)味分析及R-index法在發(fā)酵肉制品排序中的應(yīng)用
    肉制品致腐微生物溯源技術(shù)構(gòu)建
    欧美区成人在线视频| 日韩视频在线欧美| 亚洲性久久影院| 在线看a的网站| 美女国产视频在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 中文字幕免费在线视频6| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品免费大片| 久久久久精品性色| 国产在线男女| 亚洲真实伦在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日本av免费视频播放| 91久久精品国产一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩av在线免费看完整版不卡| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| tube8黄色片| 夫妻性生交免费视频一级片| av福利片在线| 天堂8中文在线网| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品久久久噜噜| 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩欧美 国产精品| 美女国产视频在线观看| 成人影院久久| 国产精品一区www在线观看| 国产成人精品一,二区| 色网站视频免费| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av在线老鸭窝| 天天操日日干夜夜撸| 五月玫瑰六月丁香| a 毛片基地| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 男女边吃奶边做爰视频| 秋霞在线观看毛片| 亚洲在久久综合| 在线观看免费日韩欧美大片 | 高清av免费在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文字幕免费在线视频6| 免费大片黄手机在线观看| 日本午夜av视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 自线自在国产av| 国产欧美亚洲国产| 日本午夜av视频| 国产av国产精品国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久久国产网址| 少妇人妻久久综合中文| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久久久久精品精品| 久久久久久久久久久丰满| av天堂中文字幕网| 看免费成人av毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美xxⅹ黑人| 最近的中文字幕免费完整| 丝袜脚勾引网站| 青春草国产在线视频| 九九爱精品视频在线观看| 国产淫语在线视频| 免费大片黄手机在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 国产一区二区在线观看av| 久久午夜综合久久蜜桃| 99九九在线精品视频 | 久久久国产精品麻豆| 久久99精品国语久久久| 97超视频在线观看视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 曰老女人黄片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产探花极品一区二区| 国产成人精品久久久久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人二区视频| 99热这里只有是精品在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久精品性色| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美高清成人免费视频www| 精品国产露脸久久av麻豆| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美3d第一页| 日韩一区二区视频免费看| 五月开心婷婷网| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美日韩av久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品国产露脸久久av麻豆| av线在线观看网站| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 一区二区三区精品91| 欧美国产精品一级二级三级 | av专区在线播放| 看十八女毛片水多多多| 国产亚洲5aaaaa淫片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久久a久久爽久久v久久| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 爱豆传媒免费全集在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 国产亚洲一区二区精品| 美女中出高潮动态图| 亚洲成人av在线免费| 成人黄色视频免费在线看| 久久久精品94久久精品| 亚洲av免费高清在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 春色校园在线视频观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 亚洲精品国产成人久久av| 99久国产av精品国产电影| 亚洲图色成人| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品视频女| 国产成人精品婷婷| 最后的刺客免费高清国语| 18禁动态无遮挡网站| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩人妻高清精品专区| 精品午夜福利在线看| 一级毛片我不卡| 久久久久久人妻| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 在线观看www视频免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一区二区性色av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 午夜免费鲁丝| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲精品一二三| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品色激情综合| 一区二区三区免费毛片| 久久久久久久国产电影| 内射极品少妇av片p| 亚洲av国产av综合av卡| 九色成人免费人妻av| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产成人精品福利久久| 欧美日韩视频精品一区| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美日韩av久久| 美女中出高潮动态图| 久久99一区二区三区| 高清av免费在线| 国产精品一二三区在线看| 一本色道久久久久久精品综合| 六月丁香七月| 高清毛片免费看| 看十八女毛片水多多多| av在线观看视频网站免费| 有码 亚洲区| 日韩免费高清中文字幕av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲在久久综合| 中文欧美无线码| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 一级毛片电影观看| 熟女人妻精品中文字幕| 中文字幕久久专区| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av免费高清在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 在线天堂最新版资源| 国产亚洲最大av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 日日啪夜夜撸| 亚洲精品日本国产第一区| 色5月婷婷丁香| 我的女老师完整版在线观看| 超碰97精品在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 9色porny在线观看| 精品久久久噜噜| 五月伊人婷婷丁香| 午夜激情福利司机影院| 免费观看av网站的网址| av卡一久久| 免费人成在线观看视频色| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产色片| 插逼视频在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩在线高清观看一区二区三区| 高清av免费在线| 亚洲av不卡在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品久久久久久av不卡| 国产探花极品一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美97在线视频| 欧美bdsm另类| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 最近2019中文字幕mv第一页| 三级国产精品欧美在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产在线男女| 国产亚洲91精品色在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| freevideosex欧美| 简卡轻食公司| 亚洲欧美精品自产自拍| 嫩草影院入口| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色哟哟·www| av在线app专区| 国产精品福利在线免费观看| 乱系列少妇在线播放| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人免费无遮挡视频| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品乱久久久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 婷婷色综合www| 国产在线免费精品| 日本av手机在线免费观看| 99久久人妻综合| 人妻一区二区av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 伦理电影大哥的女人| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 午夜老司机福利剧场| av黄色大香蕉| 日本免费在线观看一区| 亚洲国产精品专区欧美| 国模一区二区三区四区视频| 国产黄片视频在线免费观看| 国产日韩欧美视频二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲国产精品专区欧美| 秋霞在线观看毛片| 色网站视频免费| 欧美另类一区| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日韩成人av中文字幕在线观看| 伊人久久国产一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 国产 一区精品| 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 大香蕉久久网| 免费av中文字幕在线| 99久久人妻综合| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 99九九在线精品视频 | 免费高清在线观看视频在线观看| 美女内射精品一级片tv| 久久这里有精品视频免费| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av免费高清在线观看| 18+在线观看网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品日本国产第一区| 麻豆成人av视频| 女人精品久久久久毛片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 全区人妻精品视频| 免费av中文字幕在线| 成年av动漫网址| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人免费观看mmmm| 老司机亚洲免费影院| 赤兔流量卡办理| 国产真实伦视频高清在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 丁香六月天网| 免费黄色在线免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 婷婷色综合大香蕉| 免费观看的影片在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 日韩欧美一区视频在线观看 | 成人二区视频| 男人舔奶头视频| 国产淫片久久久久久久久| 色网站视频免费| 国产成人a∨麻豆精品| 国产成人freesex在线| 青春草亚洲视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产一区二区在线观看av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| 18+在线观看网站| tube8黄色片| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成人国产av品久久久| 久久青草综合色| 精品久久久噜噜| 深夜a级毛片| 日本欧美国产在线视频| 欧美高清成人免费视频www| www.色视频.com| 一级黄片播放器| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品一区蜜桃| 久久热精品热| 久久韩国三级中文字幕| 国产伦精品一区二区三区四那| 国内揄拍国产精品人妻在线| 丝袜脚勾引网站| 国产黄片美女视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 十八禁高潮呻吟视频 | 男人狂女人下面高潮的视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产亚洲精品久久久com| 国产av码专区亚洲av| 久久午夜福利片| 国产黄片美女视频| 插阴视频在线观看视频| 天堂中文最新版在线下载| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 免费大片黄手机在线观看| 久久青草综合色| 亚洲国产日韩一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人免费无遮挡视频| 伦理电影大哥的女人| 国产成人a∨麻豆精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 最近手机中文字幕大全| 国产免费一级a男人的天堂| 成年人午夜在线观看视频| 天天操日日干夜夜撸| 18禁在线无遮挡免费观看视频| av有码第一页| 一区二区三区乱码不卡18| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲人与动物交配视频| av播播在线观看一区| 在线观看www视频免费| 欧美日韩在线观看h| 久热久热在线精品观看| 视频区图区小说| 高清毛片免费看| 精品一区二区免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 一边亲一边摸免费视频| av专区在线播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人妻一区二区av| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产探花极品一区二区| av天堂久久9| 久久狼人影院| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产欧美亚洲国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 日本欧美国产在线视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 精品一品国产午夜福利视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲久久久国产精品| 国产高清有码在线观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久国内精品自在自线图片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品一二三区在线看| 中文字幕制服av| 日本午夜av视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 视频区图区小说| 丝瓜视频免费看黄片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 免费少妇av软件| 久久久精品94久久精品| 国产一区二区三区综合在线观看 | 黄色怎么调成土黄色| 岛国毛片在线播放| 美女cb高潮喷水在线观看| 男的添女的下面高潮视频| a级毛色黄片| 五月伊人婷婷丁香| 日本91视频免费播放| 日韩三级伦理在线观看| 丝袜喷水一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 内射极品少妇av片p| 六月丁香七月| 我的老师免费观看完整版| 51国产日韩欧美| 国产精品成人在线| 亚洲精品一区蜜桃| 色哟哟·www| 高清视频免费观看一区二区| videossex国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲怡红院男人天堂| 国产成人精品一,二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产成人一区二区在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩一区二区三区影片| 亚洲av成人精品一二三区| 一个人免费看片子| 搡老乐熟女国产| 精品人妻熟女毛片av久久网站| videossex国产| 交换朋友夫妻互换小说| 妹子高潮喷水视频| 女人精品久久久久毛片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲电影在线观看av| 国产成人aa在线观看| 午夜av观看不卡| 久久久久久久久久久丰满| 高清av免费在线| 伦精品一区二区三区| 99九九在线精品视频 | 最近手机中文字幕大全| 久久久午夜欧美精品| 99热这里只有精品一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线播放无遮挡| 美女福利国产在线| 男的添女的下面高潮视频| 成人二区视频| 亚州av有码| 91精品一卡2卡3卡4卡| 午夜福利视频精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 男人狂女人下面高潮的视频| 97超视频在线观看视频| 久久av网站| 久久 成人 亚洲| 精品熟女少妇av免费看| a级毛色黄片| 精品久久久久久电影网| 久久久精品免费免费高清| 一区二区三区四区激情视频| 大话2 男鬼变身卡| 最近的中文字幕免费完整| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲第一av免费看| 久久久久久久精品精品| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲人成网站在线观看播放| 91精品国产国语对白视频| 欧美xxⅹ黑人| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲久久久国产精品| 99久久精品国产国产毛片| 只有这里有精品99| 老女人水多毛片| 青春草亚洲视频在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 乱系列少妇在线播放| 26uuu在线亚洲综合色| 黄色欧美视频在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线看a的网站| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品久久久久成人av| 日本与韩国留学比较| 97在线人人人人妻| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美日韩综合久久久久久| 韩国av在线不卡| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品一二三| 日韩欧美精品免费久久| 只有这里有精品99| 国产色爽女视频免费观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲成人av在线免费| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲欧美成人精品一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 久久99蜜桃精品久久| 少妇精品久久久久久久| 嫩草影院新地址| 午夜福利网站1000一区二区三区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久精品夜色国产| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产成人a∨麻豆精品| 久久免费观看电影| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产av精品麻豆| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚州av有码| 国产在线视频一区二区| a 毛片基地| 草草在线视频免费看| 国产在线男女| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲真实伦在线观看| 少妇精品久久久久久久| av国产精品久久久久影院| 交换朋友夫妻互换小说| 99久久人妻综合| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲第一区二区三区不卡| 如何舔出高潮| 免费av中文字幕在线| 最近中文字幕2019免费版| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲av福利一区| 久久久久国产网址| 乱系列少妇在线播放| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲,欧美,日韩| 老司机影院成人| 99热国产这里只有精品6| 国产精品国产av在线观看| 成人无遮挡网站| 欧美精品一区二区免费开放| 日韩视频在线欧美| 热re99久久国产66热| 只有这里有精品99| 成人综合一区亚洲| 午夜福利视频精品| 一区二区三区精品91| 日韩视频在线欧美| 嫩草影院入口| 亚洲欧美精品专区久久| 青春草视频在线免费观看| 亚洲高清免费不卡视频| 一区二区三区精品91| 中文字幕久久专区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品无大码| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲国产最新在线播放| av免费观看日本| 秋霞伦理黄片| 亚洲综合精品二区| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品一二三| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲性久久影院| 亚洲国产精品成人久久小说| 少妇人妻久久综合中文| 不卡视频在线观看欧美| 国产美女午夜福利| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲国产日韩一区二区| 秋霞在线观看毛片| 国产亚洲91精品色在线| 久久国产精品大桥未久av | 久久久久久久久大av|