單增李斯特氏菌商品化核酸檢測試劑盒評價

陳彬，林艷，柯璐，徐珊，林杰，戴曉麗，鄭晶

（福建出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建福州350001）

單增李斯特氏菌商品化核酸檢測試劑盒評價

陳彬，林艷，柯璐，徐珊，林杰，戴曉麗，鄭晶*

（福建出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建福州350001）

通過實驗室內(nèi)確認(rèn)和實驗室間協(xié)同實驗對商品化單增李斯特氏菌LAMP試劑盒進(jìn)行適用性評價，選擇具有代表性的5大類15個細(xì)類食品基質(zhì)，對劑盒方法包括靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率、相對準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性以及批間變異8項定性方法性能指標(biāo)進(jìn)行實驗室內(nèi)評估。并對10家實驗室的協(xié)同實驗結(jié)果進(jìn)行評價。試劑盒檢測結(jié)果與基準(zhǔn)方法GB 4789.30-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》檢測結(jié)果上無顯著差異，能基本滿足食品樣品的檢測要求，但蔬菜制品類的商品化核酸試劑盒法靈敏度僅為5%、假陰性率高達(dá)95%、相對準(zhǔn)確率為68%，且與基準(zhǔn)法檢測陽性確證比在5%的置信區(qū)間內(nèi)存在統(tǒng)計學(xué)差異，因此不適用于蔬菜制品的檢測。10家實驗室對3個接種水平樣本的檢測，特異性、靈敏度以及相對準(zhǔn)確度均為100%，因此LAMP試劑盒檢測法結(jié)果穩(wěn)定可靠。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；商品化核酸試劑盒；評價

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 （Listeriamonocytogenes），廣泛分布于自然界，是人類最重要的食源性病原菌之一。國家標(biāo)準(zhǔn)采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法，檢測周期長，而以現(xiàn)代分子生物學(xué)建立的細(xì)菌核酸檢測法不僅克服了費時的缺陷，在操作上也更簡便和高效[1-2]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）技術(shù)是 2000年Notomi等[3]在PCR技術(shù)上發(fā)展起來的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，在致病菌的篩選檢測上已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[4-8]。應(yīng)用該技術(shù)形成商品化的檢測試劑盒正日益為廣大食品檢測機(jī)構(gòu)和人員所使用，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒的質(zhì)量對檢測結(jié)果具有重要影響，因此對其進(jìn)行科學(xué)有效地評價是十分必要的。本實驗根據(jù)SN/T 2775-2011《商品化食品檢測試劑盒評價方法》[5]和SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》[9]要求，參考GB 4789.30-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸檢驗》[10]，研究建立了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒評價方案，并對該試劑盒進(jìn)行了評價試驗，以評估其在食品微生物檢測中的適用性。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）：均購自購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（Listeria monocytogenes Nucleic acid Detection Kit）（批號Lmo11080101、Lmo11082902、Lmo11090501）：廣州華峰生物科技有限公司。GB 4789.30-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸檢驗》中所需主要培養(yǎng)基以及試劑：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Stomacher3500拍擊式均質(zhì)器：英國SEWARD；KD-2100TBC電子天平：福建科迪技術(shù)有限公司；MODULYO-4K冷凍干燥機(jī)（配有真空泵）：美國Edword公司；BD115型恒溫培養(yǎng)箱：德國Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 添加菌樣制備

各菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面中37℃培養(yǎng)18 h～24 h。凍干菌株存儲于4℃。

1.3.2 試驗食品種類的選擇

根據(jù)SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》[10]規(guī)定選擇本次試驗的食品基質(zhì)，見表1。

表1 供試食品種類Table1 The selected food types

式中：a為LAMP試劑盒檢測確定為陽性而基準(zhǔn)法確定為陰性的樣本數(shù)；b為LAMP試劑盒檢測確定為陰性而基準(zhǔn)法確定為陽性的樣本數(shù)。

評價：當(dāng)χ2<3.84，表示兩種方法的陽性確證比率在5%的置信區(qū)間內(nèi)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，每一類食品的每一個接種水平必須達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)χ2≥3.84，表示兩者在5%置信區(qū)間存在統(tǒng)計學(xué)差異，從而必須將該類食品從適用范圍中剔除。

1.3.5 定性評價指標(biāo)與計算方式

靈敏度（P+）指LAMP方法和基準(zhǔn)方法均確證為陽性的數(shù)量除以基準(zhǔn)方法確證為陽性的總數(shù)；特異性（P-）指LAMP方法和基準(zhǔn)方法均確證為陰性的總數(shù)除以基準(zhǔn)方法確證為陰性的總數(shù)；假陰性率（pf-）指LAMP方法確證為陰性而基準(zhǔn)方法確證為陽性的數(shù)量除以基準(zhǔn)方法確證為陽性的總數(shù)，（pf-）=1-（P+）；假陽性率（pf+）指LAMP方法確證為陽性而基準(zhǔn)方法確證為陰性的數(shù)量除以基準(zhǔn)方法確證為陰性的總數(shù)，（pf+）= 1-（P-）。根據(jù)SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定待確認(rèn)方法滿足檢測要求的條件是：靈敏度≥98%、特異性≥90.4%、假陰性率<2%、假陽性率<9.6%。

相對準(zhǔn)確度（Relative Accuracy）：相同的樣品用LAMP檢測法和基準(zhǔn)法測試結(jié)果的一致程度，兩種方法均確證為陽性的樣本數(shù)與均確證為陰性的樣本數(shù)之和除以樣品總數(shù)。

檢測限：某個接種水平的一組樣本，當(dāng)檢測陽性

1.3.3 檢測方法

人工污染基質(zhì)：根據(jù)不同的基質(zhì)物理狀態(tài)和是否經(jīng)加工程序處理，添加相適應(yīng)狀態(tài)的微生物。因加工食品中的微生物狀態(tài)為受損菌，未受損的微生物接種到未加工食品中，針對干粉樣或粒狀樣品可添加凍干菌種，對潮濕的食品添加菌液。

按未接種（L0）、低（L1）、高（L2）3個菌濃度水平添加到基質(zhì)中，拍擊均質(zhì)后制備成測試樣品，存于4℃，分析前保持微生物穩(wěn)定。其中L1接種條件應(yīng)保證POD（檢出概率）值在25%～75%；L2接種條件應(yīng)保證POD（檢出概率）=100%。對供試基質(zhì)分別用LAMP試劑盒和基準(zhǔn)方法進(jìn)行測試，均進(jìn)行20個平行，對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計。

1.3.4 方法的顯著性差異檢驗

用于判斷LAMP法與基準(zhǔn)方法陽性比例的差異顯著性。采用卡方檢驗（χ2）分析。結(jié)果比例大約占樣品總數(shù)的50%時，該接種水平即為方法檢測限，定性檢測方法的檢測限應(yīng)小等于3CFU/ 25 g（mL）～5CFU/25 g（mL）。

1.3.6 耐變性檢驗

取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）高濃度、低濃度菌懸液作為目標(biāo)菌，金黃色葡萄球菌（ATCC6538）作為陰性對照。兩個變量分別取兩個水平：時間：65min和55min；溫度：65℃和60℃。交叉組合后每個組合進(jìn)行10個平行，以檢出率（POD值）作為統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)[9-14]。

1.3.7 批間變異測試

取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）作為目標(biāo)菌，以金黃色葡萄球菌（ATCC6538）作為陰性對照，目標(biāo)菌的濃度須滿足檢測POD值在25%～75%的水平。分別用3個不同批號的單增李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒進(jìn)行檢測，每個批次設(shè)計10個平行，以POD值作為結(jié)果數(shù)據(jù)分析試劑盒的批間變異和穩(wěn)定性。

1.3.8 協(xié)同實驗

以脫脂牛奶和蔗糖作為保護(hù)劑，取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）作為目標(biāo)菌，分別制備未接種（L0）、低（L1）、高（L2）3個水平的凍干基質(zhì)。發(fā)送至10家實驗室，均以全脂奶粉作為供試基質(zhì)，同時開展LAMP法和基準(zhǔn)方法檢測，每個水平設(shè)計8個平行，統(tǒng)計分析結(jié)果[15-20]。

2 實驗結(jié)果及統(tǒng)計分析

2.1 方法的顯著性差異檢驗結(jié)果、定性指標(biāo)結(jié)果與評價

5種食品種類的檢測結(jié)果見表2；5類食品類型2個接種水平的卡方檢驗結(jié)果見表3。

表2 5種食品種類的檢測結(jié)果Table2 The testing resultsof fivekindsof food types

表3 5類食品類型2個接種水平的卡方檢驗結(jié)果Table3 The chi-square test resultsof two levelof vaccination for five kind of food type

續(xù)表3 5類食品類型2個接種水平的卡方檢驗結(jié)果Continue table3 The chi-square test resultsof two levelof vaccination for fivekind of food type

由表3卡方檢驗結(jié)果可知：蔬菜制品大類的3個細(xì)類即食品編號為Fo7、Fo8、Fo9在目標(biāo)菌接種水平為L1時χ2=0<3.84，LAMP法檢測與基準(zhǔn)法檢測陽性確證比在5%的置信區(qū)間內(nèi)無統(tǒng)計學(xué)差異，而接種水平為L2時χ2=0≥3.84，存在統(tǒng)計學(xué)差異。

根據(jù)1.3.4指標(biāo)項目以及計算方式統(tǒng)計表3數(shù)據(jù)，統(tǒng)計結(jié)果見表4。

表4 5類食品基質(zhì)檢測結(jié)果統(tǒng)計Table4 Result statisticsof five typesof foodm atrix testing

根據(jù)SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》[10]及表4統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知：5個食品種類的LAMP法檢測特異性（P-）均為100%≥98%、假陽性率（pf+）均＜9.6%；肉類、魚類和海產(chǎn)品、乳制品、雜品4個食品種類的靈敏度（P+）均≥90.4%、假陰性率（pf-）均＜2%，且相對準(zhǔn)確率高；而蔬菜制品的LAMP法檢測靈敏度僅有5%、假陰性高達(dá)95%，相對準(zhǔn)確率低，為68%。綜上：蔬菜制品的LAMP方法與基準(zhǔn)法具有顯著性差異，此外靈敏度低、假陰性率高，相對準(zhǔn)確率低，因此蔬菜制品在LAMP法檢測時應(yīng)從適用范圍中刪除。在本文以下各項檢測中對蔬菜制品不作統(tǒng)計分析。

2.2 檢出限

目標(biāo)菌接種水平計數(shù)結(jié)果見表5，各類食品POD計算見表6。當(dāng)檢測陽性結(jié)果比例大等于樣品總數(shù)的50%時（即POD≥50%）的接種水平即為方法檢出限。

表5 目標(biāo)菌接種水平計算結(jié)果Table5 The inoculation level results for targetbacteria

續(xù)表5 目標(biāo)菌接種水平計算結(jié)果Continue table5 The inoculation level results for targetbacteria

根據(jù)接種菌懸液稀釋計數(shù)結(jié)果，計算得出：接種目標(biāo)菌水平L1約為0.51CFU/g（mL），其不確定度范圍為0.24CFU/g（mL）至1.10CFU/g（mL），接種水平L2為3.24CFU/g（mL），其不確定度范圍為1.96CFU/g（mL）至5.33CFU/g（mL）。

LAMP法各類食品檢出率（POD）結(jié)果見表6。

表6 LAMP法各類食品檢出率（POD）Table6 A llkindsof food detection（POD）of LAMP %

從表5、6數(shù)據(jù)可以得出：當(dāng)檢測陽性結(jié)果比例大約占樣品總數(shù)的50%時，肉類食品和乳制品食品的試劑盒方法檢出限均為3.24CFU/g；魚類和海產(chǎn)品和雜品食品試劑盒方法檢出限均為0.51 CFU/g。4種食品類型的檢出限均小等于3CFU/25 g或mL～5CFU/25 g或mL。

2.3 耐變性

耐變性實驗結(jié)果見表7。

表7 耐變性實驗結(jié)果Table7 Reasultsof stability test %

由表7結(jié)果表明，當(dāng)檢測樣品菌濃度較高時，該試劑盒檢測結(jié)果穩(wěn)定；當(dāng)菌濃度較低時，四種條件下的POD值均大于50%，則滿足確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。在65℃，55min的條件下，反應(yīng)時間低于試劑盒說明書規(guī)定的時間，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。綜合結(jié)果表明，在60℃，55min的反應(yīng)條件下檢測結(jié)果相對于其它溫度和時間最為滿意。

2.4 批間變異

批間差異實驗結(jié)果家表8。

表8 批間差異實驗結(jié)果Table8 Reasultsof inter-batch varlations

由表8結(jié)果表明，該試劑盒的批間差異較小，但個別可能會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，無假陽性結(jié)果。

2.5 協(xié)同實驗

共計收到10家實驗室的檢測結(jié)果，均是有效數(shù)據(jù)。結(jié)果見表9，數(shù)據(jù)形式以“陽性結(jié)果樣本數(shù)/陰性結(jié)果樣本數(shù)”，統(tǒng)計分析見表10。

表9 協(xié)同實驗結(jié)果Table9 Resultsof collaboration test

表10 協(xié)同實驗統(tǒng)計結(jié)果Table10 Statisticalanalysisof collaboration test

由表10統(tǒng)計結(jié)果表明，10家實驗室對3個接種水平樣本的檢測，特異性、靈敏度以及相對準(zhǔn)確度均為100%，因此LAMP試劑盒檢測法結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

評價結(jié)果單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌核酸試劑盒方法檢測結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果總體上比較無顯著差異，能滿足食品樣品的檢測要求，但不適用于蔬菜制品檢測。單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌LAMP檢測方法具有快速、靈敏、操作簡便的特點，且無需使用大型或高價儀器，適用于實驗室快速篩查檢測，并可在基層實驗室推廣應(yīng)用。

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Evaluation of Listeria monocytogenes Comm ercial Nucleic Acid Detection K it

CHENBin，LINYan，KE Lu，XUShan，LIN Jie，DAIXiao-li，ZHENG Jing*
（Centerof Technology，F(xiàn)ujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，F(xiàn)ujian ProvincialKey Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，F(xiàn)uzhou 350001，F(xiàn)ujian，China）

Based on indoor technicalparametersby validation and collaboration test.Choose five categoriesand 15 sub-types for Typical foodmatrix，indoor technical parameters include sensitivity，specificity，false negative rate and false positive rate relative accuracy，limit of detection（LOD），resistance to denaturation and batch variation.Synergy of10 laboratory to evaluate the results of the experiment.Results showed that the kitwas not significantly different from the national standard method in general，and could meet the requirements of food sample testing.However，the sensitivity just5%，false negative rate isashigh as95%，the relative accuracy is 68%，and there is statisticaldifferenceswithin the 5%confidence interval for positive confirm ratio compared with referencemethods.Thus the commercialkitwasnotsuitable for detection in vegetable products.Specificity，sensitivity and the relative accuracy is all 100%for Three level of sample detection of 10 laboratory.So the LAMPkitmethod isstable and reliable.

Listeriamonocytogenes；loop-mediated isothermalamplification；Commercialization nucleic acid detection kit；evaluation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.025

2016-03-21

福建省科技計劃項目（2011Y0002）；國家認(rèn)監(jiān)委出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制（修）訂計劃項目（2013B264K）

陳彬（1969—），女（漢），高級工程師，學(xué)士，研究方向：食品微生物檢驗。

*通信作者：鄭晶（1973—），女（漢），研究員，碩士，研究方向：食品微生物檢驗。