單增李斯特氏菌商品化核酸檢測試劑盒評價

陳彬，林艷，柯璐，徐珊，林杰，戴曉麗，鄭晶

（福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州350001）

單增李斯特氏菌商品化核酸檢測試劑盒評價

陳彬，林艷，柯璐，徐珊，林杰，戴曉麗，鄭晶*

（福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州350001）

通過實驗室內確認和實驗室間協(xié)同實驗對商品化單增李斯特氏菌LAMP試劑盒進行適用性評價，選擇具有代表性的5大類15個細類食品基質，對劑盒方法包括靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率、相對準確度、檢出限、耐變性以及批間變異8項定性方法性能指標進行實驗室內評估。并對10家實驗室的協(xié)同實驗結果進行評價。試劑盒檢測結果與基準方法GB 4789.30-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》檢測結果上無顯著差異，能基本滿足食品樣品的檢測要求，但蔬菜制品類的商品化核酸試劑盒法靈敏度僅為5%、假陰性率高達95%、相對準確率為68%，且與基準法檢測陽性確證比在5%的置信區(qū)間內存在統(tǒng)計學差異，因此不適用于蔬菜制品的檢測。10家實驗室對3個接種水平樣本的檢測，特異性、靈敏度以及相對準確度均為100%，因此LAMP試劑盒檢測法結果穩(wěn)定可靠。

單核細胞增生李斯特氏菌；環(huán)介導等溫擴增；商品化核酸試劑盒；評價

單核細胞增生李斯特氏菌 （Listeriamonocytogenes），廣泛分布于自然界，是人類最重要的食源性病原菌之一。國家標準采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法，檢測周期長，而以現(xiàn)代分子生物學建立的細菌核酸檢測法不僅克服了費時的缺陷，在操作上也更簡便和高效[1-2]。環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）技術是 2000年Notomi等[3]在PCR技術上發(fā)展起來的一種新型的恒溫核酸擴增技術，具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，在致病菌的篩選檢測上已經得到廣泛的應用[4-8]。應用該技術形成商品化的檢測試劑盒正日益為廣大食品檢測機構和人員所使用，單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒的質量對檢測結果具有重要影響，因此對其進行科學有效地評價是十分必要的。本實驗根據SN/T 2775-2011《商品化食品檢測試劑盒評價方法》[5]和SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認技術規(guī)范》[9]要求，參考GB 4789.30-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢驗》[10]，研究建立了單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒評價方案，并對該試劑盒進行了評價試驗，以評估其在食品微生物檢測中的適用性。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）：均購自購自上海漢尼生物技術有限公司。

單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（Listeria monocytogenes Nucleic acid Detection Kit）（批號Lmo11080101、Lmo11082902、Lmo11090501）：廣州華峰生物科技有限公司。GB 4789.30-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢驗》中所需主要培養(yǎng)基以及試劑：北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

Stomacher3500拍擊式均質器：英國SEWARD；KD-2100TBC電子天平：福建科迪技術有限公司；MODULYO-4K冷凍干燥機（配有真空泵）：美國Edword公司；BD115型恒溫培養(yǎng)箱：德國Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 添加菌樣制備

各菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面中37℃培養(yǎng)18 h～24 h。凍干菌株存儲于4℃。

1.3.2 試驗食品種類的選擇

根據SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認技術規(guī)范》[10]規(guī)定選擇本次試驗的食品基質，見表1。

表1 供試食品種類Table1 The selected food types

式中：a為LAMP試劑盒檢測確定為陽性而基準法確定為陰性的樣本數(shù)；b為LAMP試劑盒檢測確定為陰性而基準法確定為陽性的樣本數(shù)。

評價：當χ2<3.84，表示兩種方法的陽性確證比率在5%的置信區(qū)間內沒有統(tǒng)計學差異，每一類食品的每一個接種水平必須達到該標準。當χ2≥3.84，表示兩者在5%置信區(qū)間存在統(tǒng)計學差異，從而必須將該類食品從適用范圍中剔除。

1.3.5 定性評價指標與計算方式

靈敏度（P+）指LAMP方法和基準方法均確證為陽性的數(shù)量除以基準方法確證為陽性的總數(shù)；特異性（P-）指LAMP方法和基準方法均確證為陰性的總數(shù)除以基準方法確證為陰性的總數(shù)；假陰性率（pf-）指LAMP方法確證為陰性而基準方法確證為陽性的數(shù)量除以基準方法確證為陽性的總數(shù)，（pf-）=1-（P+）；假陽性率（pf+）指LAMP方法確證為陽性而基準方法確證為陰性的數(shù)量除以基準方法確證為陰性的總數(shù)，（pf+）= 1-（P-）。根據SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認技術規(guī)范》中規(guī)定待確認方法滿足檢測要求的條件是：靈敏度≥98%、特異性≥90.4%、假陰性率<2%、假陽性率<9.6%。

相對準確度（Relative Accuracy）：相同的樣品用LAMP檢測法和基準法測試結果的一致程度，兩種方法均確證為陽性的樣本數(shù)與均確證為陰性的樣本數(shù)之和除以樣品總數(shù)。

檢測限：某個接種水平的一組樣本，當檢測陽性

1.3.3 檢測方法

人工污染基質：根據不同的基質物理狀態(tài)和是否經加工程序處理，添加相適應狀態(tài)的微生物。因加工食品中的微生物狀態(tài)為受損菌，未受損的微生物接種到未加工食品中，針對干粉樣或粒狀樣品可添加凍干菌種，對潮濕的食品添加菌液。

按未接種（L0）、低（L1）、高（L2）3個菌濃度水平添加到基質中，拍擊均質后制備成測試樣品，存于4℃，分析前保持微生物穩(wěn)定。其中L1接種條件應保證POD（檢出概率）值在25%～75%；L2接種條件應保證POD（檢出概率）=100%。對供試基質分別用LAMP試劑盒和基準方法進行測試，均進行20個平行，對檢測數(shù)據進行分析統(tǒng)計。

1.3.4 方法的顯著性差異檢驗

用于判斷LAMP法與基準方法陽性比例的差異顯著性。采用卡方檢驗（χ2）分析。結果比例大約占樣品總數(shù)的50%時，該接種水平即為方法檢測限，定性檢測方法的檢測限應小等于3CFU/ 25 g（mL）～5CFU/25 g（mL）。

1.3.6 耐變性檢驗

取單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）高濃度、低濃度菌懸液作為目標菌，金黃色葡萄球菌（ATCC6538）作為陰性對照。兩個變量分別取兩個水平：時間：65min和55min；溫度：65℃和60℃。交叉組合后每個組合進行10個平行，以檢出率（POD值）作為統(tǒng)計分析數(shù)據[9-14]。

1.3.7 批間變異測試

取單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）作為目標菌，以金黃色葡萄球菌（ATCC6538）作為陰性對照，目標菌的濃度須滿足檢測POD值在25%～75%的水平。分別用3個不同批號的單增李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒進行檢測，每個批次設計10個平行，以POD值作為結果數(shù)據分析試劑盒的批間變異和穩(wěn)定性。

1.3.8 協(xié)同實驗

以脫脂牛奶和蔗糖作為保護劑，取單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）作為目標菌，分別制備未接種（L0）、低（L1）、高（L2）3個水平的凍干基質。發(fā)送至10家實驗室，均以全脂奶粉作為供試基質，同時開展LAMP法和基準方法檢測，每個水平設計8個平行，統(tǒng)計分析結果[15-20]。

2 實驗結果及統(tǒng)計分析

2.1 方法的顯著性差異檢驗結果、定性指標結果與評價

5種食品種類的檢測結果見表2；5類食品類型2個接種水平的卡方檢驗結果見表3。

表2 5種食品種類的檢測結果Table2 The testing resultsof fivekindsof food types

表3 5類食品類型2個接種水平的卡方檢驗結果Table3 The chi-square test resultsof two levelof vaccination for five kind of food type

續(xù)表3 5類食品類型2個接種水平的卡方檢驗結果Continue table3 The chi-square test resultsof two levelof vaccination for fivekind of food type

由表3卡方檢驗結果可知：蔬菜制品大類的3個細類即食品編號為Fo7、Fo8、Fo9在目標菌接種水平為L1時χ2=0<3.84，LAMP法檢測與基準法檢測陽性確證比在5%的置信區(qū)間內無統(tǒng)計學差異，而接種水平為L2時χ2=0≥3.84，存在統(tǒng)計學差異。

根據1.3.4指標項目以及計算方式統(tǒng)計表3數(shù)據，統(tǒng)計結果見表4。

表4 5類食品基質檢測結果統(tǒng)計Table4 Result statisticsof five typesof foodm atrix testing

根據SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認技術規(guī)范》[10]及表4統(tǒng)計數(shù)據可知：5個食品種類的LAMP法檢測特異性（P-）均為100%≥98%、假陽性率（pf+）均＜9.6%；肉類、魚類和海產品、乳制品、雜品4個食品種類的靈敏度（P+）均≥90.4%、假陰性率（pf-）均＜2%，且相對準確率高；而蔬菜制品的LAMP法檢測靈敏度僅有5%、假陰性高達95%，相對準確率低，為68%。綜上：蔬菜制品的LAMP方法與基準法具有顯著性差異，此外靈敏度低、假陰性率高，相對準確率低，因此蔬菜制品在LAMP法檢測時應從適用范圍中刪除。在本文以下各項檢測中對蔬菜制品不作統(tǒng)計分析。

2.2 檢出限

目標菌接種水平計數(shù)結果見表5，各類食品POD計算見表6。當檢測陽性結果比例大等于樣品總數(shù)的50%時（即POD≥50%）的接種水平即為方法檢出限。

表5 目標菌接種水平計算結果Table5 The inoculation level results for targetbacteria

續(xù)表5 目標菌接種水平計算結果Continue table5 The inoculation level results for targetbacteria

根據接種菌懸液稀釋計數(shù)結果，計算得出：接種目標菌水平L1約為0.51CFU/g（mL），其不確定度范圍為0.24CFU/g（mL）至1.10CFU/g（mL），接種水平L2為3.24CFU/g（mL），其不確定度范圍為1.96CFU/g（mL）至5.33CFU/g（mL）。

LAMP法各類食品檢出率（POD）結果見表6。

表6 LAMP法各類食品檢出率（POD）Table6 A llkindsof food detection（POD）of LAMP %

從表5、6數(shù)據可以得出：當檢測陽性結果比例大約占樣品總數(shù)的50%時，肉類食品和乳制品食品的試劑盒方法檢出限均為3.24CFU/g；魚類和海產品和雜品食品試劑盒方法檢出限均為0.51 CFU/g。4種食品類型的檢出限均小等于3CFU/25 g或mL～5CFU/25 g或mL。

2.3 耐變性

耐變性實驗結果見表7。

表7 耐變性實驗結果Table7 Reasultsof stability test %

由表7結果表明，當檢測樣品菌濃度較高時，該試劑盒檢測結果穩(wěn)定；當菌濃度較低時，四種條件下的POD值均大于50%，則滿足確認標準。在65℃，55min的條件下，反應時間低于試劑盒說明書規(guī)定的時間，出現(xiàn)假陽性結果。綜合結果表明，在60℃，55min的反應條件下檢測結果相對于其它溫度和時間最為滿意。

2.4 批間變異

批間差異實驗結果家表8。

表8 批間差異實驗結果Table8 Reasultsof inter-batch varlations

由表8結果表明，該試劑盒的批間差異較小，但個別可能會出現(xiàn)假陰性的結果，無假陽性結果。

2.5 協(xié)同實驗

共計收到10家實驗室的檢測結果，均是有效數(shù)據。結果見表9，數(shù)據形式以“陽性結果樣本數(shù)/陰性結果樣本數(shù)”，統(tǒng)計分析見表10。

表9 協(xié)同實驗結果Table9 Resultsof collaboration test

表10 協(xié)同實驗統(tǒng)計結果Table10 Statisticalanalysisof collaboration test

由表10統(tǒng)計結果表明，10家實驗室對3個接種水平樣本的檢測，特異性、靈敏度以及相對準確度均為100%，因此LAMP試劑盒檢測法結果穩(wěn)定可靠。

3 結論

評價結果單核細胞增生性李斯特氏菌核酸試劑盒方法檢測結果與國家標準方法檢測結果總體上比較無顯著差異，能滿足食品樣品的檢測要求，但不適用于蔬菜制品檢測。單核細胞增生性李斯特氏菌LAMP檢測方法具有快速、靈敏、操作簡便的特點，且無需使用大型或高價儀器，適用于實驗室快速篩查檢測，并可在基層實驗室推廣應用。

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Evaluation of Listeria monocytogenes Comm ercial Nucleic Acid Detection K it

CHENBin，LINYan，KE Lu，XUShan，LIN Jie，DAIXiao-li，ZHENG Jing*
（Centerof Technology，F(xiàn)ujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，F(xiàn)ujian ProvincialKey Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，F(xiàn)uzhou 350001，F(xiàn)ujian，China）

Based on indoor technicalparametersby validation and collaboration test.Choose five categoriesand 15 sub-types for Typical foodmatrix，indoor technical parameters include sensitivity，specificity，false negative rate and false positive rate relative accuracy，limit of detection（LOD），resistance to denaturation and batch variation.Synergy of10 laboratory to evaluate the results of the experiment.Results showed that the kitwas not significantly different from the national standard method in general，and could meet the requirements of food sample testing.However，the sensitivity just5%，false negative rate isashigh as95%，the relative accuracy is 68%，and there is statisticaldifferenceswithin the 5%confidence interval for positive confirm ratio compared with referencemethods.Thus the commercialkitwasnotsuitable for detection in vegetable products.Specificity，sensitivity and the relative accuracy is all 100%for Three level of sample detection of 10 laboratory.So the LAMPkitmethod isstable and reliable.

Listeriamonocytogenes；loop-mediated isothermalamplification；Commercialization nucleic acid detection kit；evaluation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.025

2016-03-21

福建省科技計劃項目（2011Y0002）；國家認監(jiān)委出入境檢驗檢疫行業(yè)標準制（修）訂計劃項目（2013B264K）

陳彬（1969—），女（漢），高級工程師，學士，研究方向：食品微生物檢驗。

*通信作者：鄭晶（1973—），女（漢），研究員，碩士，研究方向：食品微生物檢驗。