番石榴葉多酚分離純化工藝研究

陳智理，楊昌鵬，*，趙永鋒，郭靜婕

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530007；2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣西南寧530021）

番石榴葉多酚分離純化工藝研究

陳智理1，楊昌鵬1，*，趙永鋒2，郭靜婕1

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530007；2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣西南寧530021）

采用AB-8、S-8、D151、X-54種樹(shù)脂，探討對(duì)番石榴葉中多酚的吸附和解吸條件。結(jié)果表明，各種樹(shù)脂對(duì)該多酚的靜態(tài)吸附效果順序?yàn)镾-8>AB-8>X-5>D151，解吸效果為AB-8>X-5>D151>S-8。AB-8樹(shù)脂是番石榴葉多酚分離純化的適宜的吸附劑。最佳柱層析條件為上柱液濃度為濃縮2倍原提取液，上柱流速為3BV/h，上柱pH4.5，洗脫劑為80%乙醇，洗脫流速為2BV/h。

番石榴葉；多酚；樹(shù)脂；分離；純化

多酚是多羥基酚類化合物的總稱，廣泛存在于各種植物中。Habrorne發(fā)現(xiàn)，番石榴葉子中含有大量的懈皮素、萹蓄苷和番石榴苷，正是這些酚類物質(zhì)賦予了番石榴葉抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化等多種功效[1-3]。番石榴在我國(guó)廣東、廣西、福建等地區(qū)普遍種植，其葉片中含有大量的多酚物質(zhì)。在番石榴的栽培管理過(guò)程中常進(jìn)行枝葉修剪，留下大量廢棄番石榴葉。如能利用其廢棄葉片進(jìn)行多酚的提取分離，變廢為寶，將會(huì)推動(dòng)番石榴深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

大孔樹(shù)脂純化技術(shù)是中藥制藥和食品工業(yè)中頗具發(fā)展前景的應(yīng)用新技術(shù)之一，具有應(yīng)用范圍廣、理化性質(zhì)穩(wěn)定、分離性能優(yōu)良、使用方便，溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)。目前，大孔樹(shù)脂在蘋(píng)果多酚[4]、茶多酚[5]、香蕉多酚[6]、石榴皮多酚[7]的分離研究應(yīng)用上已有大量的報(bào)道，但用樹(shù)脂法分離純化番石榴多酚的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本論文擬用AB-8、S-8、D151、X-5等大孔吸附樹(shù)脂對(duì)番石榴葉中的多酚進(jìn)行靜態(tài)吸附和柱層析工藝研究，探討最佳的番石榴葉多酚的分離純化工藝，為番石榴葉中多酚物質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

番石榴葉采自廣西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)展示中心，洗凈、晾干后備用。

1.2 試劑

Folin&CiocaltecusPhenol：美國(guó)Sigma公司；AB-8、X-5、S-8、D101等大孔樹(shù)脂：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；焦性沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；UV755B紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ-82恒溫振蕩器：國(guó)華企業(yè)；DHL-ADL電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器：上海青浦瀘西分析儀器廠；1.6 cm×30 cm層析柱：上海錦華層析設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 番石榴葉多酚的提取

按照陳智理等[8]報(bào)道的方法，將番石榴葉清洗、晾干、切碎，與80%乙醇按1∶3（質(zhì)量比）料液比打漿，在50℃水浴浸提2.5 h，離心過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后后即得番石榴葉多酚提取液，裝瓶置于陰涼處保藏備用。

1.4.2 番石榴葉多酚含量的測(cè)定方法

參照Hanmmerschmidt等[9]報(bào)道的福林酚改良法進(jìn)行測(cè)定：取樣液0.2mL，加入2%NaCO34mL，準(zhǔn)確放置2min，再添加稀釋成2倍后的福林酚試劑0.2mL，放置30min，在765 nm下測(cè)定其吸光度值A(chǔ)765，求得線性回歸方程為：

式中：x為焦性沒(méi)食子酸含量，μg/mL；y為吸光度值（A765）。

1.4.3 番石榴葉中多酚物質(zhì)的靜態(tài)吸附

1.4.3.1 各種樹(shù)脂靜態(tài)吸附效果的比較

將AB-8、X-5、S-8、D151 4種吸附樹(shù)脂經(jīng)處理后，用濾紙吸干表面水分，分別稱取20.00 g，裝于4個(gè)干燥的燒杯中，加入稀釋50倍100mL多酚提取液，在室溫、120 r/min振蕩至吸光度值不在升高達(dá)到了吸附平衡，定時(shí)吸取上清液，顯色后測(cè)吸光度，檢測(cè)溶液中多酚含量的變化，以吸附率比較各種樹(shù)脂的吸附性能，計(jì)算吸附率S公式如下：

式中：Co為吸附前溶液濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液濃度，mg/mL。

1.4.3.2 各種樹(shù)脂靜態(tài)解吸效果的比較

準(zhǔn)確稱取AB-8、X-5、S-8、D151 4種型號(hào)樹(shù)脂5.00 g，分別加入70%的乙醇溶液50 mL，在室溫、120 r/min振蕩至吸光度值不再升高，定時(shí)吸取上清液，顯色后測(cè)吸光度，檢測(cè)溶液中多酚含量的變化，以解析率比較各種溶劑的解析效果，計(jì)算解析率D公式如下：

式中：Co為吸附前溶液濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液濃度，mg/mL；V1為溶液體積，mL；W1為吸附的樹(shù)脂干重，g；W2為解吸的樹(shù)脂干重，g；C2為解吸液濃度，%；V2為解吸液體積，mL。

1.4.4 番石榴葉中多酚物質(zhì)的柱層析分離

1.4.4.1 不同上柱濃度對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚效果影響

將預(yù)處理好的AB-8樹(shù)脂，裝入（1.6 cm×30 cm）玻璃層吸柱中，填充體積為3/5柱床體積（高度約10 cm（15 g），柱床體積約為20 cm3）。再分別用番石榴葉提取液以原液、稀釋1倍、稀釋2倍、濃縮2倍和濃縮3倍的5種不同濃度，在pH為4.5的條件下，采用2倍柱體積/小時(shí)（BV/h）的速度上柱。當(dāng)流出液中的番石榴葉多酚吸光度達(dá)到上柱前番石榴多酚的吸光度1/10時(shí)，達(dá)到泄露點(diǎn)。停止進(jìn)樣，于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，計(jì)算吸附量并繪制曲線。計(jì)算吸附量公式如下：

式中：C為進(jìn)樣液濃度，mg/mL；V為進(jìn)樣液體積，mL；W為吸附的樹(shù)脂干重，g。

1.4.4.2 不同上柱流速對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果影響

采用番石榴葉原提取液上柱，填充體積為3/5柱床體積、pH為4.5的條件下，選用1、2、3、4 BV/h 4種不同的上柱速度，到達(dá)泄露點(diǎn)時(shí)停止進(jìn)樣，于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，計(jì)算吸附量并繪制曲線。

1.4.4.3 不同上柱pH對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果影響

采用番石榴葉原提取液，填充體積為3/5柱床體積、選用2BV/h上柱速度，在pH值為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5的條件下上柱，到達(dá)泄露點(diǎn)時(shí)停止進(jìn)樣，于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，計(jì)算吸附量并繪制曲線。

1.4.4.4 不同濃度乙醇對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)洗脫番石榴葉多酚的效果

取多酚提取液50mL，在2BV/h的流速下吸附，然后分別用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集各部分洗脫液，于765 nm處測(cè)定多酚的含量，繪制洗脫曲線，計(jì)算回收率公式如下：

式中：C1為上柱時(shí)樣液濃度，μg/mL；V1為上柱時(shí)樣液體積，mL；C2為純化后收集混合液多酚的濃度，μg/mL；V2為純化后收集混合液多酚的體積，mL。

1.4.4.5 不同洗脫流速對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)洗脫番石榴葉多酚的效果影響

取多酚提取液15mL，選用1、2、3、4倍柱體積/小時(shí)（BV/h）4種不同的上柱速度，收集各部分洗脫液，于765 nm處測(cè)定吸光度，并繪制洗脫曲線，同時(shí)計(jì)算回收率。

1.4.4.6 多酚純度計(jì)算

式中：C2為純化后收集混合液多酚的濃度，μg/ mL；V2為純化后收集混合液多酚的體積，mL；W為多酚物干重，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸效果的比較

4種樹(shù)脂對(duì)番石榴葉多酚的靜態(tài)飽和吸附與解吸情況見(jiàn)表1。

表1 不同大孔吸附樹(shù)脂對(duì)番石榴多酚吸附率與解析率的影響Table1 Effectsof differentofmacroporousadsorption resin on adsorption rateand resolution rateof guava leaf polyphenol

由表1可知4種樹(shù)脂對(duì)番石榴葉多酚的吸附效果大小順序?yàn)镾-8>AB-8>X-5>D151，解析效果為AB-8>X-5>D151>S-8，綜合考慮以上樹(shù)脂的吸附能力和解析效果，生產(chǎn)上宜使用AB-8對(duì)番石榴多酚進(jìn)行分離純化。

2.2 不同上柱濃度對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果影響

不同上柱濃度對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同上柱濃度對(duì)AB-8吸附番石榴葉多酚的效果影響Fig.1 Effectsof different concentrationsof guava leaf polyphenol on adsorption capaclty by AB-8 resin

由圖1可知，隨著樣品上柱濃度的增加，吸附量逐漸增加，但是當(dāng)多酚的濃度超過(guò)濃縮2倍濃度時(shí)，吸附量隨濃度增加而下降。其原因是樣品上柱濃度過(guò)高時(shí)，在一定流速下，多酚分子和樹(shù)脂的接觸時(shí)間變短，造成吸附量的降低。因此在生產(chǎn)上應(yīng)采用濃縮2倍的樣液濃度上柱。這個(gè)結(jié)果與楊桃多酚[10]以提取液原液直接上柱有所區(qū)別。

2.3 不同上柱流速對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果影響

不同上柱流速對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同上柱流速對(duì)AB-8吸附番石榴葉多酚的效果影響Fig.2 Effectsof different flow velocitysof guava leaf polyphenol on adsorp tion capaclty by AB-8 resin

由圖2可知，上柱流速為3BV/h時(shí)樹(shù)脂對(duì)番石榴葉多酚的吸附量最大，流速過(guò)小或過(guò)大吸附量都比較低，故生產(chǎn)上宜使用3BV/h的上柱流速。這與玫瑰花多酚分離純化[11]的上柱流速相同，但與楊桃多酚[10]和紅松子種皮中多酚[12]的上柱流速（2BV/h）有所區(qū)別。

2.4 不同上柱pH值對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果影響

不同上柱pH值對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附番石榴葉多酚的效果結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同上柱pH值對(duì)AB-8吸附番石榴葉多酚的效果影響Fig.3 Effectsof different pH of guava leaf polyphenolon adsorption capaclty by AB-8 resin

由圖3可知，上柱樣液的pH值不同樹(shù)脂對(duì)番石榴葉多酚吸附量區(qū)別不大，所以，生產(chǎn)上宜使用pH4.5即番石榴葉多酚的提取原液pH值上柱較為合理，不必再調(diào)整上柱樣液的pH值。

2.5 不同濃度乙醇對(duì)番石榴葉多酚AB-8洗脫效果的影響

不同濃度乙醇對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)洗脫番石榴葉多酚的結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度乙醇對(duì)番石榴葉多酚AB-8洗脫效果的影響Fig.4 Effectsof differentethanolconcentrationson elution capaclty to guava leaf polyphenols in AB-8 resin

由圖4可知50%～60%的乙醇洗脫曲線對(duì)稱性較差，伴隨明顯的拖尾現(xiàn)象，而且洗脫時(shí)間也較長(zhǎng)；70%～80%的乙醇洗脫曲線對(duì)稱性較好，拖尾現(xiàn)象減弱；90%的乙醇洗脫時(shí)間也過(guò)長(zhǎng)。另外，用50%、60%、70%、80%、90%不同濃度的乙醇洗脫番石榴葉多酚的回收率分別是81.4%、81.4%、84.4%、88.4%、83.7%?？梢?jiàn)，80%的乙醇洗脫回收率最高，且對(duì)稱性良好，洗脫時(shí)間短且利于富集和純化，故選擇80%的乙醇作為洗脫劑，高于其他多酚物質(zhì)[7，10-13]的乙醇洗脫濃度。

2.6 不同流速對(duì)番石榴葉多酚AB-8洗脫效果的影響

不同流速對(duì)番石榴葉多酚AB-8洗脫效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同流速對(duì)番石榴葉多酚AB-8洗脫效果的影響Fig.5 Effectsof different flow velocityson elution capaclty to guava leaf polyphenols in AB-8 resin

由圖5可知，流速不同，乙醇對(duì)番石榴葉多酚的解吸效果也不同。另外由試驗(yàn)計(jì)算得出，洗脫流速為1、2、3、4 BV/h時(shí)，分離純化番石榴葉多酚的回收率分別為83.7%、88.4%、90.7%、76.7%。回收率的大小排序?yàn)?BV/h＞2BV/h＞1BV/h＞4BV/h，雖然3BV/h流速洗脫的回收率比2BV/h流速洗脫的回收率大，但是富集和純化卻不如2BV/h，故選擇2BV/h流速進(jìn)行洗脫，這與楊桃多酚[10]的洗脫流速相同。

2.7 最佳層析條件下番石榴葉多酚分離純化效果

根據(jù)試驗(yàn)得到的最佳層析條件，使用大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)番石榴葉多酚進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與洗脫，即設(shè)定上柱液為濃縮2倍濃度的提取原液，上柱流速為3BV/h，上柱pH4.5，洗脫劑為80%乙醇，洗脫流速為2BV/h。

最佳柱層析條件下番石榴葉多酚的動(dòng)態(tài)洗脫曲線見(jiàn)圖6。

圖6 最佳柱層析條件下番石榴葉多酚的動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.6 Dynam ic elution curveof guava leaf polyphenolsunder the best colum n chromatography conditions

由圖6可以看出：通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂AB-8吸附后的番石榴葉多酚在解吸時(shí)得到了較好的富集與分離效果。經(jīng)檢測(cè)，在最佳柱層析條件下分離純化后的番石榴葉多酚的純度由原來(lái)6.2%提高到70.6%，純度提高了11倍。

3 結(jié)論

1）各種樹(shù)脂對(duì)番石榴葉多酚的靜態(tài)吸附效果順序?yàn)镾-8＞AB-8＞X-5＞D151，解吸效果為AB-8＞X-5＞D151＞S-8。故選擇AB-8樹(shù)脂作為番石榴葉多酚分離純化的適宜的吸附劑。

2）對(duì)番石榴葉中的多酚進(jìn)行提取與分離純化工藝研究。結(jié)果表明：最佳柱層析條件為上柱液濃度為濃縮2倍原提取液，上柱流速為3 BV/h，上柱pH4.5，洗脫劑為80%乙醇，洗脫流速為2BV/h。

3）在最佳柱層析條件下分離純化后的番石榴葉多酚的純度由原來(lái)的6.2%提高到70.6%，純度提高了11倍。

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Study on Separation and Purification of Guava Leaf Polyphenol

CHENZhi-li1，YANGChang-peng1，*，ZHAOYong-feng2，GUO Jing-jie1
（1.GuangxiAgriculturalVocationaland TechnicalCollege，Nanning530007，Guangxi，China；2.Technology Center，GuangxiEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanning530021，Guangxi，China）

Four types of resin（AB-8，S-8，D151，X-5）were used in the adsorption and desorption tests of guava leafpolyphenols.Theorderofdifferent resinsstatic adsorption effectof the polyphenolswas S-8>AB-8> X-5>D151，and the desorption orderwas AB-8>X-5>D151>S-8.The experimental results indicated that AB-8 resin wasa suitable adsorbent forseparation and purification ofguava leafpolyphenols.The amountof the dynamic adsorption to the guava leafpolyphenols on AB-8 colunm was reduced by the decreasion on the sample concentration and the increasion of the flow velocity.Theappropriate flow rate3 BV/h，pH4.5，and theelution peakwas found at80%ethanolby 2BV/h flow rateofelution.

guava leaf；polyphenol；resin；separation；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.013

2015-11-11

廣西教育廳高?？蒲许?xiàng)目（201106LX794）

陳智理（1979—），女（漢），副教授，碩士，主要從事食品有效成分的檢測(cè)及分離純化研究。

*通信作者：楊昌鵬（1964—），教授，博士，主要從事食品分離純化及果蔬深加工研究工作。