生物膜中活性菌株的鑒定及抑菌活性研究

李志生，叢巍巍，張華慶，王 科，于雪艷，桂泰江

（1.海軍91421部隊(duì)，山東青島 266071；

2.海洋涂料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海洋化工研究院有限公司，山東青島 266071）

生物膜中活性菌株的鑒定及抑菌活性研究

李志生1，叢巍巍2，張華慶2，王 科2，于雪艷2，桂泰江2

（1.海軍91421部隊(duì)，山東青島 266071；

2.海洋涂料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海洋化工研究院有限公司，山東青島 266071）

對(duì)采集于青島港六號(hào)碼頭浮筏的防污涂料樣板上的生物膜進(jìn)行分離和純化，共獲得細(xì)菌26株，酵母菌23株，并對(duì)其進(jìn)行活性菌株的篩選，最終獲得具有抑菌活性的細(xì)菌7株，酵母菌1株，通過(guò)基因測(cè)序確定不同菌株的種屬，為環(huán)境友好型防污劑的獲得提供基礎(chǔ)。

生物膜；活性菌株；抑菌活性；防污劑

0 引言

任何浸入海水中的設(shè)施都難以擺脫海洋生物的污損，有機(jī)物（如多糖、蛋白、糖蛋白等）或顆粒（如無(wú)機(jī)物）數(shù)秒內(nèi)在基體表面聚集，形成富含蛋白的基膜（conditioning film）［1］。隨后細(xì)菌與單細(xì)胞硅藻等微生物迅速在基膜上沉積，分泌胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）［2］，依靠EPS的包覆保護(hù)，細(xì)菌以及硅藻最終粘附在基膜上，形成生物膜，其形成過(guò)程如圖1所示。

圖1 生物膜形成過(guò)程Figure 1 The formation process of biofilm

生物膜的形成是海洋污損生物群落形成的初級(jí)階段，它與隨之而來(lái)的大型污損生物附著有著復(fù)雜的關(guān)系。生物膜中細(xì)菌等微生物之間，以及它們與無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲、藻類孢子之間相互作用，相互影響。細(xì)菌等微生物通過(guò)物理作用調(diào)節(jié)生物膜，影響無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲以及藻類孢子與基材之間的吸引作用，或是產(chǎn)生并釋放一些化學(xué)物質(zhì)（如硫化氫、有機(jī)酸、有機(jī)酮、有機(jī)醛等），抑制接觸到生物膜的污損生物的粘附［2］。

行之有效的商品化防污涂料大多依靠向周圍海水中緩慢釋放防污劑［3］，盡管具有較好的防污效果，但對(duì)非目標(biāo)生物產(chǎn)生許多負(fù)面影響，例如防污劑和它們的代謝物在生物體內(nèi)累積［4］以及破壞其內(nèi)分泌系統(tǒng)等［5］。國(guó)際海事組織（IMO）和海洋環(huán)境保護(hù)組織（MEPC）禁止使用某些毒性防污涂料，各國(guó)紛紛提高防污涂料的市場(chǎng)準(zhǔn)入門檻，因此環(huán)境友好型防污劑的開發(fā)與使用凸顯其重要性。近年來(lái)，從天然產(chǎn)物提取次級(jí)代謝物等活性物質(zhì)作為有毒防污劑替代產(chǎn)品的探索一直沒(méi)有停住腳步。本研究通過(guò)對(duì)青島海域生物膜中的微生物進(jìn)行分離純化，考察提取菌株的抑菌活性，為環(huán)境友好型防污劑的探索研究提供基礎(chǔ)指導(dǎo)。

1 生物膜的培養(yǎng)

試驗(yàn)過(guò)程中，依照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制得防污涂料樣板［6］，并將其置于青島港六號(hào)碼頭浮筏浸海深1 m。兩周之后，樣板表面生物膜已基本趨于成熟，如圖2所示。

2 菌株提取分離

將采集的生物膜進(jìn)行初步處理，清洗其中的淤泥，在2216E和YPD培養(yǎng)基（酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）［7］中培養(yǎng)。首先進(jìn)行搖菌，在28℃，200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)發(fā)酵2 d，其次用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)萃取液進(jìn)行濃縮，將濃縮液用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋105、106、107倍，涂布于2216E液體培養(yǎng)基和YPD固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)2 d。從涂布培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基上挑取單菌落在新的培養(yǎng)基上劃線純化（三線法），往復(fù)幾次，以得到純的菌株。經(jīng)過(guò)篩選，共分離提取酵母菌23株，細(xì)菌26株。圖3為分離純化的具有代表性的酵母菌以及細(xì)菌的圖片。

圖3 分離純化具有代表性的菌株圖片F(xiàn)igure 3 The pictures of separated and purified representative bacterial strain

3 已篩選菌株的抑菌試驗(yàn)

在研究過(guò)程中，采用鰻弧菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌和惡臭假單胞菌作為受試菌株，選取分離純化的各菌株接種于2216E液體培養(yǎng)基，搖床28℃搖瓶培養(yǎng)24 h；而產(chǎn)鐵載體的酵母菌則接種于產(chǎn)鐵載體液體培養(yǎng)基（蔗糖2.5%，NH4NO30.3%，K2HPO40.3%，檸檬酸0.1%，MgSO40.008%，ZnSO40.000 2%，pH=6.8）中，搖床28℃搖瓶培養(yǎng)48 h。用移液槍吸取100 μL上述菌液于1 mL無(wú)菌海水中混勻。用棉棒蘸取少量菌液在2216E液體培養(yǎng)基或YPD固體培養(yǎng)基上均勻涂布；將牛津杯輕放于固體培養(yǎng)基上，取100 μL各純化發(fā)酵液、離心液和過(guò)濾液注入牛津杯中；28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈，對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)抑菌圈測(cè)定3次，取平均值。

3.1 海洋細(xì)菌抑菌性能研究

以Blank1菌株為例，研究發(fā)現(xiàn)Blank1菌株發(fā)酵上清液對(duì)蠟狀芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用（見(jiàn)圖4），而將其發(fā)酵上清液煮沸則發(fā)現(xiàn)失去抑制作用。由此可知，Blank1菌株發(fā)酵上清液中活性成分不耐高溫，在煮沸條件下失活。將菌株發(fā)酵上清液溶于二甲基亞砜（DMSO）后發(fā)現(xiàn)，較單純的上清液抑菌活性降低，而DMSO本身對(duì)蠟狀芽孢桿菌沒(méi)有抑制作用，這說(shuō)明DMSO對(duì)上清液中的活性成分有一定的殺滅作用。

圖4 Blank1菌株發(fā)酵上清液對(duì)蠟狀芽孢桿菌的抑制作用Figure 4 The inhibition to Bacillus cereus of fermentation supernation of Blank1 strain

3.2 海洋酵母菌抑菌性能研究

以菌株6為例，從新鮮培養(yǎng)48 h的YPD上挑取兩環(huán)菌苔接入裝有50 mL產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28℃且轉(zhuǎn)速為200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液，測(cè)定種子液外徑為600 nm。每次試驗(yàn)以相同的接種量（初始pH為0.36）接種于裝有50 mL產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28℃以及200 r/min下振蕩培養(yǎng)120 h。抑菌試驗(yàn)過(guò)程中，上述菌株6培養(yǎng)菌液在4℃和10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，然后進(jìn)行不同處理：A組培養(yǎng)液加熱煮沸10 min；B組培養(yǎng)液不加熱；C組培養(yǎng)液加入3 μmol/L的FeCl3溶液，分別用一次性過(guò)濾器對(duì)這3組樣品進(jìn)行過(guò)濾除菌，待用。向產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中加入3 μmol/L FeCl3溶液，培養(yǎng)的菌株6的菌液，在4℃和10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，即得培養(yǎng)基中含F(xiàn)e3+的D組樣品。菌株6經(jīng)過(guò)不同處理方法對(duì)海洋鰻弧菌的抑菌圈結(jié)果見(jiàn)圖5。其中E組為標(biāo)準(zhǔn)樣品；F組為空培養(yǎng)基；G組為生理鹽水，均用于與培養(yǎng)液抑菌效果作對(duì)照。

圖5 菌株6對(duì)海洋鰻弧菌的抑菌圈Figure 5 The inhibition zone of strain 6 to the Marine Vibrio anguillarum

由圖5可見(jiàn)：菌株6經(jīng)離心取上清液煮沸的A組培養(yǎng)液和未經(jīng)加熱處理的B組培養(yǎng)液抑菌圈直徑大小相當(dāng)，即抑菌效果相當(dāng)。這表明菌株6的活性成分耐高溫效果較好，不會(huì)在較高溫度下失活。樣品中加入Fe3+后（C、D組培養(yǎng)液），菌株6均失去抑菌活性。

通過(guò)對(duì)海洋生物膜中提取的26種海洋細(xì)菌和23種海洋酵母菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性的細(xì)菌7種，酵母菌1種，所得結(jié)果如表1所示。

表1 具有抑菌活性的菌株對(duì)4種受試菌株抑菌活性比較Table 1 The comparison of antibacterial activity of strains with antibacterial activity to four test strains

由表1可見(jiàn)：8種菌株對(duì)海洋鰻弧菌均具有較好的抑菌效果，而菌株VI上1和VI上3抑菌效果稍差于其他6種菌株；而對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌作用以菌株Blank-1和7219的效果最優(yōu)，菌株VI上1和VI上3效果其次，而其余4種菌株對(duì)蠟樣芽孢桿菌不具有抑菌效果；所有菌株對(duì)綠膿桿菌和惡臭假單胞菌均沒(méi)有抑菌效果。

3.3 活性菌株16srRNA或26SrRNA測(cè)序以及種屬確定

VI下4-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：GTGGTTGAGGGG GGGGGCGGCTATCATGCAGTCGAGCGATGGATTAA GAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGA；

VI上3-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：TATACGCAGCGG CGCTCCTATCTGCAGTCGAGCGCAGGAACTGACGG AACTCTTCGGAGGGAAGGCAGTGGAATGA；

VI上1-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：ATAAACCATCCTG CGGTCCTATCATGCAGTCGAGCGCAGGAACTGACG GAACTCTTCGGAGGGAAGGCAGTGGAAT；

Blank-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：TGCAGTCGAGCGG TAACATTTCTAGCT TGCTAGAAGATGACGAGCGGC GGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGC；

7219-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：GTCGCGCTAAATTC AGTGACGGGAACTTGTGCTTGCCTCGTGGATCAGTG GCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACC；

1-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：TGGCTCCATAAAGGTT ACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA；

2-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：GGCTCCATAAAGGTTA CCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTG TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAA；

6-16SrRNA測(cè)序結(jié)果：AGGAAAAGAAACCAAC AGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAC AGCTCAAA。

通過(guò)活性菌株基因測(cè)序最后確定其種屬，如表2所示。其中一種出芽短梗霉為海洋酵母菌，其他均為海洋細(xì)菌。

表2 具有抑菌活性的菌株名稱以及種屬Table 2 The name and species of strains with antibacterial activity

4 結(jié)語(yǔ)

青島六號(hào)碼頭海域生物膜中活性菌株以海洋細(xì)菌數(shù)量占優(yōu)，且以桿狀菌屬居多。本研究通過(guò)對(duì)生物膜中活性成分提取分離，共獲得具有抑菌活性的海洋細(xì)菌7株，海洋酵母菌1株，為環(huán)境友好型防污劑的研究提供了理論指導(dǎo)。

1 Callow M E，F(xiàn)letcher R L. The Influence of Low Surface Energy Materials on Bioadhesion-a Review［J］. International Biodeterioration and Biodegradation，1994，34（3-4）：333-348.

2 Wingender J，Neu T R，F(xiàn)lemming H C. Microbial Extracellular Polymeric Substances：Characterization，Structure and Function［M］. Germany：Springer Verlag，2012.

3 黃宗國(guó)，蔡如星. 海洋污損生物及其防除［M］. 北京：海洋出版社，1984.

4 Horiguchi T. The Endocrine-Disrupting Effect of Organotin Compounds for Aquatic Organisms［J］. Ecotoxicology of Antifouling Biocides，2009（3）：125-146.

5 Chambers L D，Stokes K R，Walsh F C，et al. Modern Approaches to Marine Antifouling Coatings［J］. Surf. Coat. Technol.，2006（201）：3 642-3 652.

6 Thomas K，Brooks S. The Environmental Fate and Effects of Antifouling Paint Biocides［J］. Biofouling，2010（26）：73-88.

7 GB/T 5370—2007防污漆樣板淺海浸泡試驗(yàn)方法［S］.

8 何培青，田黎，李光友，等. 海洋細(xì)菌B-9987發(fā)酵條件的優(yōu)化及胞外抑菌物質(zhì)的理化特性［J］. 中國(guó)海洋藥物，2001（2）：8-12.

The Identification of Bioactive Strains from Biofilm and Research of Their Antibacterial Activity

Li Zhisheng1，Cong Weiwei2，Zhang Huaqing2，Wang Ke2，Yu Xueyan2，Gui Taijiang2
（1.No.91421 Navy，Qingdao Shandong，266071，China；2.State Key Laboratory of Marine Coatings，Marine Chemical Research Institute Co.，Ltd.，Qingdao Shandong，266071，China）

The biofilm was collected from test panels with antifouling coatings which were hung at No.6 dock in Qingdao Harbour. 26 strains of bacteria and 23 strains of yeasts were obtained from isolation and purification of the collected biofilm. After the sifting through bioactive strains，active substances of 7 strains of bacteria and 1 strain of yeast with antibacterial activity were obtained. The species of active strains were identified by DNA sequencing，providing theoretical basis for the acquisition of environment-friendly antifoulant.

biofilm；bioactive strain；antibacterial activity；antifoulant

O 658.9

A

1009-1696（2016）05-0006-04

2016-03-17

青島市市南區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2015-6-024-ZH）。

李志生，男，大學(xué)本科，高級(jí)工程師，主要從事艦船防腐蝕及防污涂料的研發(fā)工作。

叢巍巍，女，博士，高級(jí)工程師，主要從事環(huán)境友好型海洋防污涂料的研發(fā)工作。