甲狀腺功能亢進(jìn)對大鼠肝脾鐵含量及血紅素加氧酶1表達(dá)的影響*

彭丁晉，李艷偉，黃作良，黃澤智，馬新華，趙晉英

(邵陽市分子生物學(xué)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗(yàn)系，湖南邵陽 422000)

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甲狀腺功能亢進(jìn)對大鼠肝脾鐵含量及血紅素加氧酶1表達(dá)的影響*

彭丁晉，李艷偉，黃作良，黃澤智，馬新華，趙晉英△

(邵陽市分子生物學(xué)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗(yàn)系，湖南邵陽 422000)

目的 通過檢測甲狀腺功能亢進(jìn)(簡稱甲亢)時(shí)大鼠肝、脾組織鐵含量和血紅素加氧酶1(HO-1)的表達(dá)，探討甲亢對大鼠機(jī)體鐵代謝的影響。方法 將18只雌性SD大鼠分為甲亢4周組、甲亢8周組和對照組，每組6只。甲亢組灌胃給藥優(yōu)甲樂，對照組灌胃生理鹽水。造模結(jié)束分別取各組大鼠肝、脾臟，用二氨基聯(lián)苯胺增強(qiáng)的Perl′s鐵染色法檢測肝、脾組織鐵含量，用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測大鼠肝、脾組織HO-1mRNA的表達(dá)；利用Westernblot和免疫組織化學(xué)染色法對大鼠肝、脾臟HO-1表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果 甲亢模型4周、8周組大鼠的肝、脾組織鐵染色均明顯強(qiáng)于對照組，且甲亢8周組強(qiáng)于甲亢4組(P<0.01)； 甲亢4周、8周組大鼠的肝、脾臟的HO-1mRNA、蛋白表達(dá)均高于對照組，且甲亢8周組明顯高于4周組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 甲亢可引起肝、脾組織鐵含量增加，HO-1表達(dá)增強(qiáng)。

甲狀腺素；血紅素加氧酶-1；肝；甲狀腺功能亢進(jìn)；脾臟；鐵含量

甲狀腺功能亢進(jìn)(后簡稱甲亢) 是甲狀腺激素分泌增多導(dǎo)致的一種常見內(nèi)分泌疾病。臨床上，甲亢患者易發(fā)生貧血[1-2]。研究資料顯示缺鐵、鐵利用障礙與甲亢性貧血的發(fā)生有關(guān)[3]。肝、脾臟是機(jī)體最主要的儲(chǔ)鐵器官，而且是衰老紅細(xì)胞內(nèi)鐵再循環(huán)利用的主要場所，而血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)作為血紅素鐵再利用的限速酶，在肝脾鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著非常重要的作用[4-5]。然而，目前甲亢對肝脾鐵代謝及HO-1影響相關(guān)的研究鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測甲亢模型大鼠肝脾鐵含量及HO-1的表達(dá)，進(jìn)一步探討甲亢對肝脾鐵代謝的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 優(yōu)甲樂片即左旋甲狀腺素鈉購自德國默克公司(批號(hào)：169818)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌性SD大鼠18只，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(200±10)g，在室溫18～25 ℃，50%～70%相對濕度條件飼養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 Trizol、 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒購自碧云天生物公司；辣根酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、羊抗小鼠IgG、兔抗大鼠HO-1抗體、羊抗兔鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)檢測試劑盒均購自武漢博士德生物公司；β-actin抗體購自Abcam公司；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和HO-1引物購于上海生物工程公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)甲亢模型分組、造模及取材 18只雌性SD大鼠分為甲亢4周組、甲亢8周組和對照組，每組6只。參照張彬等[6]的方法造模：研磨優(yōu)甲樂片，用生理鹽水混懸，灌胃給藥(60 μg/100 g，1次/天)；對照組灌服生理鹽水。兩個(gè)甲亢組大鼠分別于第4周和第8周末處死，對照組于實(shí)驗(yàn)?zāi)┨幩?。取大鼠肝脾組織，部分石蠟包埋切片(4 μm厚)，其余新鮮肝脾組織經(jīng)提取總RNA，行RT-PCR實(shí)驗(yàn)；經(jīng)提取總蛋白，行Western blot 實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)增強(qiáng)的Perl′s鐵染色 肝、脾組織切片脫蠟復(fù)水，置于現(xiàn)配的5%氯化氫(HCl)-5%亞鐵氰化鉀1∶1混合液中30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶；DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核以利于鏡下觀察，封片鏡檢。同行做陰性對照染色，除了不加HCl-亞鐵氰化鉀混合液外，其余步驟相同。組織鐵陽性染色呈棕黃色顆粒狀。

1.2.3 RT-PCR檢測 用Trizol提取肝、脾組織總RNA。以GAPDH為內(nèi)參，采用RT-PCR 兩步法檢測大鼠HO-1 mRNA的表達(dá)，大鼠HO-1上游引物序列為5′-CAG AAC CCA GTC TAT GCC-3′，下游序列為 5′-GCT CGG GAA GGT GAA AA-3′，擴(kuò)增長度306 bp；大鼠GAPDH上游序列為5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′，下游序列為5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′，擴(kuò)增長度 308 bp。PCR反應(yīng)條件：第1步95 ℃ 4 min，1個(gè)循環(huán)；第2步94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s (50 ℃ for GAPDH)，72 ℃ 30 s，共30 個(gè)循環(huán)；第3步72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳約1 h(電壓150 V)，經(jīng) Photoshop 軟件測定條帶亮度值，將擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物與內(nèi)參相比進(jìn)行相對定量。

1.2.4 Western blot檢測 用Western blot檢測大鼠肝、脾臟HO-1的表達(dá)情況。大鼠新鮮肝、脾組織經(jīng)勻漿裂解后， 4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液，采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)測定實(shí)驗(yàn)樣品蛋白濃度。取含有30 μg蛋白量的上樣體積進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%牛血清清蛋白(BSA)封閉2 h，加入兔抗大鼠HO-1抗體(1∶100)， 4 ℃過夜孵育后，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶1 000)37 ℃孵育2 h，最后滴加超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液孵育，X膠片曝光，每步反應(yīng)期間用磷酸鹽緩沖液(PBST)充分洗滌3次，每次5 min。以β-actin為內(nèi)參，一抗為小鼠抗大鼠β-actin抗體(1∶1 000)，二抗為辣根酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶1 000)。曝光膠片分別分析條帶灰度值，以HO-1及β-actin灰度值之比進(jìn)行相對定量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SABC法對肝、脾HO-1進(jìn)行定位。一抗為兔抗大鼠HO-1抗體(1∶100)，操作嚴(yán)格按照SABC檢測試劑盒說明書進(jìn)行，陰性對照用PBS代替一抗。結(jié)果判斷：HO-1定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，染色呈棕黃色部位。

2 結(jié) 果

2.1 甲亢對大鼠肝、脾鐵含量的影響 經(jīng)DAB增強(qiáng)的Perl′s染色法，組織鐵鏡下呈棕黃色染色，分布于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞間質(zhì)。對照組大鼠肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞鐵染色明顯，在中央靜脈周圍染色更甚(圖1A)，而門管區(qū)染色較淺。對照組脾組織鐵染色顆粒主要位于紅髓，白髓無明顯鐵染色顆粒(圖1D)。而甲亢4周組和8周組大鼠肝、脾組織鐵染色均明顯強(qiáng)于對照組，且甲亢8周組肝、脾組織鐵染色強(qiáng)于甲亢4周組，見圖1B、C、E、F。

圖1 大鼠肝臟和脾臟DAB增強(qiáng)的Perl′s鐵染色(×100)

2.2 甲亢對肝、脾HO-1mRNA表達(dá)的影響RT-PCR顯示，大鼠肝、脾組織均表達(dá)HO-1mRNA。甲亢4周組和8周組肝、脾組織的HO-1mRNA表達(dá)均高于對照組，且甲亢8周組肝、脾組織的HO-1mRNA表達(dá)又明顯高于甲亢4周組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2～3。

圖2 RT-PCR檢測肝臟HO-1 mRNA的表達(dá)

圖3 RT-PCR檢測脾臟HO-1 mRNA的表達(dá)

2.3 甲亢對肝、脾HO-1蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)Westernblot結(jié)果顯示，大鼠肝、脾組織均表達(dá)HO-1蛋白。甲亢4周組和8周組肝、脾組織HO-1蛋白表達(dá)均高于對照組，且甲亢8周組明顯高于甲亢4周組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4～5。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組大鼠肝組織HO-1蛋白主要定位于肝巨噬細(xì)胞，肝細(xì)胞無明顯染色，脾組織HO-1蛋白主要定位紅髓，白髓無明顯染色。甲亢4周組和8周組肝、脾組織HO-1染色均強(qiáng)于對照組，且甲亢8周組明顯強(qiáng)于甲亢4周組，見圖6。

圖4 Western Blot檢測肝臟HO-1蛋白的表達(dá)

圖5 Western Blot檢測脾臟HO-1蛋白的表達(dá)

圖6 大鼠肝臟和脾臟HO-1免疫組織化學(xué)染色(×100)

3 討 論

臨床研究顯示甲亢患者發(fā)生貧血的發(fā)病率國外約為8%～57%，國內(nèi)10～44%，甲亢性貧血與機(jī)體鐵代謝異常有關(guān)[3]。人體所需鐵除了部分來源于食物，大部分則來源于衰老紅細(xì)胞中血紅素鐵的再循環(huán)。肝、脾不僅是機(jī)體最主要的儲(chǔ)鐵器官，而且是衰老紅細(xì)胞內(nèi)鐵再循環(huán)利用的主要場所，因此肝、脾在機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中處于重要的地位。本研究采用DAB增強(qiáng)的Perl′s鐵染色檢測了甲亢時(shí)肝、脾鐵染色的變化[7]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織鐵主要位于肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞，在近中央靜脈處染色明顯，而門管區(qū)染色較弱。脾組織鐵染色顆粒主要位于紅髓。而甲亢模型大鼠的肝、脾組織鐵染色均明顯強(qiáng)于對照組，且隨時(shí)間延長逐漸增強(qiáng)，提示機(jī)體在甲亢時(shí)肝、脾組織鐵儲(chǔ)量明顯高于正常狀態(tài)。

鐵在機(jī)體發(fā)揮重要的作用，但過多的鐵可誘導(dǎo)自由基的生成，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損害組織器官[8]。臨床報(bào)道甲亢伴有肝損害的并不少見[9]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的甲亢大鼠肝組織鐵含量升高可能參與了甲亢性肝損害。當(dāng)胞內(nèi)鐵含量過多時(shí)，細(xì)胞一般通過增加鐵儲(chǔ)存蛋白，即鐵蛋白(Feritin，F(xiàn)n)的表達(dá)來結(jié)合過多的鐵。有臨床資料顯示甲亢患者血清中Fn水平升高，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)甲亢可引起肝組織Fn表達(dá)升高[10]。可以這樣認(rèn)為，甲亢引起了肝脾的鐵含量升高，同時(shí)誘導(dǎo)肝脾Fn表達(dá)結(jié)合過多的鐵，F(xiàn)n的升高對器官起保護(hù)作用，而過多的Fn從細(xì)胞溢出血液引起了血液中Fn水平的升高。

甲亢大鼠肝、脾組織鐵含量升高，提示甲亢時(shí)單核巨噬細(xì)胞對衰老紅細(xì)胞的破壞有可能高于正常生理狀態(tài)，使得血紅素鐵的再循環(huán)增加。脾臟巨噬細(xì)胞吞噬衰老的紅細(xì)胞分解血紅蛋白釋放出血紅素，HO可催化血紅素降解產(chǎn)生膽綠素、CO和Fe2+。另外，10%～20%的衰老紅細(xì)胞也會(huì)在血管內(nèi)發(fā)生破裂，釋放出的血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白結(jié)合，然后被運(yùn)輸?shù)礁闻K，在肝細(xì)胞形成內(nèi)吞小體，分解出血紅素，血紅素再經(jīng)HO作用釋放出Fe2+[11]。HO是血紅素分解代謝的限速酶，血紅素鐵的再循環(huán)與肝脾HO的表達(dá)量有關(guān)。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在3種形式的HO：HO-1、HO-2和HO-3。在非應(yīng)激狀態(tài)，肝細(xì)胞主要表達(dá)HO-2，HO-1只在Kupffer細(xì)胞中分布；在應(yīng)激性傷害時(shí)，肝組織HO活性的主要成分是HO-1，不僅分布于Kupffer細(xì)胞，也可表達(dá)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中[12]。在脾中HO-1的表達(dá)量是HO-2的5倍[13]。HO-1是誘導(dǎo)型HO，諸如重金屬、血紅素、缺氧、化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞因子等均可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)增加[14]。而目前認(rèn)為只有糖皮質(zhì)激素能調(diào)節(jié)HO-2的表達(dá),HO-3的表達(dá)量極少，其分解血紅素的活性亦最低。因此，本實(shí)驗(yàn)僅檢測了甲亢模型大鼠肝、脾組織HO-1的表達(dá)。

RT-PCR和WesternBlot結(jié)果顯示，大鼠肝、脾組織均表達(dá)HO-1mRNA及蛋白。甲亢組HO-1mRNA及蛋白各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于對照組，且隨時(shí)間延長逐漸升高。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組大鼠肝臟HO-1蛋白主要定位在肝巨噬細(xì)胞，肝細(xì)胞無明顯染色。而脾臟HO-1蛋白主要定位紅髓，白髓無明顯染色。脾組織紅髓含有大量的巨噬細(xì)胞，這也提示脾臟中主要是巨噬細(xì)胞表達(dá)HO-1。本研究中甲亢模型鼠肝、脾HO-1表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果提示肝脾對血紅素的分解代謝活動(dòng)增強(qiáng)，使得衰老紅細(xì)胞血紅素鐵再循環(huán)增強(qiáng)，這可能是甲亢肝、脾鐵儲(chǔ)量增加的原因。

另外，資料顯示HO-1也是機(jī)體內(nèi)最易被誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶類，缺血再灌注等多種損害因素均可誘導(dǎo)肝組織HO-1活性增加[15]，而HO-1對由氧化應(yīng)激損害引起的細(xì)胞損傷也具有保護(hù)作用[16]。由于甲亢促進(jìn)了機(jī)體新陳代謝，產(chǎn)熱增加，耗氧量增加，這可能引起器官氧自由基增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。甲亢時(shí)肝、脾組織HO-1表達(dá)增加也可能是機(jī)體應(yīng)對高氧化應(yīng)激反應(yīng)的一種細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)。細(xì)胞中游離血紅素是一種促氧化劑，當(dāng)血紅素與分子氧反應(yīng)時(shí)，可催化產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，而HO-1可催化血紅素降解產(chǎn)生膽綠素、CO和Fe2+，避免對細(xì)胞的損傷；鐵離子亦能誘導(dǎo)Fn的表達(dá)，結(jié)合催化氧自由基形成所需要的游離鐵，從而減輕氧自由基對組織細(xì)胞的損傷；膽綠素和膽紅素不僅具有抗氧化特性，二者還能通過其他途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[17-18]。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲亢可引起肝、脾組織鐵含量增加，HO-1表達(dá)增強(qiáng)。增加的鐵含量有可能是由于衰老紅細(xì)胞血紅素鐵再循環(huán)增加所致，而HO-1表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)了血紅素鐵的釋放，增高的HO-1對肝、脾等重要臟器也可能具有保護(hù)作用。

雖然本實(shí)驗(yàn)未探討甲亢時(shí)是否紅細(xì)胞破壞增加，但有資料顯示甲亢時(shí)心肌收縮力增強(qiáng)，心率加快，血液循環(huán)加快。高速血流可引起血管內(nèi)紅細(xì)胞破壞增加，加快紅細(xì)胞衰老速度。另外，甲亢時(shí)骨髓紅細(xì)胞異常生成，幼紅細(xì)胞數(shù)量偏高，但由于存在某種鐵利用障礙，而形成一定程度的無效紅細(xì)胞生成。另外，亦有觀點(diǎn)認(rèn)為血紅蛋白具有甲狀腺激素的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合甲狀腺激素的多少可以反映血紅蛋白的壽命，甲亢患者高含量的甲狀腺激素也必然導(dǎo)致紅細(xì)胞的壽命縮短。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)甲亢大鼠紅細(xì)胞的滲透脆性明顯下降[19]?？傊?，這些因素均有可能增加了肝脾內(nèi)巨噬細(xì)胞對紅細(xì)胞的過濾，加快血紅素鐵在肝脾的再循環(huán)，促進(jìn)肝脾鐵儲(chǔ)量的增加。因此，本研究結(jié)果提示臨床上治療甲亢性貧血時(shí)，須慎用補(bǔ)鐵療法，以免加重機(jī)體鐵超載負(fù)擔(dān)，增加肝臟等重要器官的氧化應(yīng)激損傷。然而，由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用的甲亢造模方法與臨床上甲亢患病的機(jī)制有一定區(qū)別，本研究結(jié)果仍需在臨床上進(jìn)一步研究證實(shí)。

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《重慶醫(yī)學(xué)》對臨床研究論文醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求

凡投本刊的臨床研究論文(主體是以人為研究對象)，作者應(yīng)說明其遵循的程序是否符合負(fù)責(zé)人體試驗(yàn)的委員會(huì)(單位性的、地區(qū)性的或國家性的)所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并提供(上傳)該委員會(huì)的批準(zhǔn)文件復(fù)印件及受試對象或其親屬的知情同意書復(fù)印件。

《重慶醫(yī)學(xué)》編輯部

The effects of hyperthyroidism on Iron content and heme oxygenase 1 expression of liver and spleen of rats*

PengDingjin,LiYanwei,HuangZuoliang,HuangZezhi,MaXinhua,ZhaoJinying△

(ShaoyangKeyLaboratoryofMolecularBiologyDiagnosis/theDepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,ShaoyangMedicalCollege,Shaoyang,Hunan422000，China)

Objective To explore the effects of hyperthyroidism on Iron content and heme oxygenase 1(HO-1) expression of liver and spleen of rats.Methods A total of 18 female SD rats were divided into hyperthyroidism for 4 weeks group(n=6),hyperthyroidism for 8 weeks group(n=6) and control group(n=6).Hyperthyroidism rats were induced by intragastric administration of Euthyrox (Levothyroxine).And the control rats were given normal saline.The liver and spleen of rats were obtained after administration,respectively.Iron of liver and spleen were stained by DAB enhanced Perls′ method,and the expression of HO-1 mRNA was measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).HO-1 protein was measured by Western blot and immunohistochemistry.Results Iron staining of liver and spleen of hyperthyroidism for 4 weeks group and 8 weeks group was significantly stronger than those of control group,respectively.And Iron staining of liver and spleen of hyperthyroidism for 8 weeks group was stronger than those of hyperthyroidism for 4 weeks group.The increase of HO-1 mRNA and protein expression was shown in liver and spleen of hyperthyroidism for 4 weeks group and 8 weeks group (P<0.01).Moreover,the expression of HO-1 mRNA and protein of liver and spleen of hyperthyroidism rats for 8 weeks group were higher than those of hyperthyroidism for 4 weeks group(P<0.01).Conclusion The hyperthyroidism induced increase of Iron content，HO-1 mRNA and protein expression of liver and spleen of rats.

thyroxine；heme oxygenase-1；liver;hyperthyroidism；spleen；Iron content

2013年湖南省教育廳科學(xué)研究優(yōu)秀青年項(xiàng)目(13B157)。 作者簡介：彭丁晉(1981-)，講師，碩士，主要從事甲狀腺功能亢進(jìn)對機(jī)體鐵代謝的影響方面研究。△

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論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.010

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1671-8348(2016)23-3196-05

2016-04-24

2016-06-23)