游離DNA異常甲基化在卵巢癌中的研究進(jìn)展

徐夢(mèng)嬌（綜述），童曉文（審校）

1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200065

游離DNA異常甲基化在卵巢癌中的研究進(jìn)展

徐夢(mèng)嬌1（綜述），童曉文2（審校）

1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200065

卵巢癌（ovarian cancer）是死亡率較高的婦科惡性腫瘤之一，初期常無癥狀，多數(shù)患者往往在晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移后才發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其發(fā)生、發(fā)展、診治與DNA異常甲基化有密切聯(lián)系。通過研究DNA甲基化機(jī)制，有助于卵巢癌的早期診斷、治療和預(yù)后判斷。游離DNA是細(xì)胞外游離存在于體液中的DNA，可在腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡等過程中產(chǎn)生，在卵巢癌的診治中有著重要的研究意義。本文就DNA異常甲基化在卵巢癌的研究進(jìn)展及甲基化研究方法做綜述。

游離循環(huán)DNA；DNA甲基化；卵巢癌；CpG島

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤之一，約占女性惡性腫瘤死亡總數(shù)的5%[1]。卵巢癌初期常無明顯癥狀，70%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已到FIGOⅡB到Ⅳ期，5年生存率僅為15%～45%。而早期診斷明顯提高患者5年生存率。臨床上，CA125作為血清標(biāo)志物，對(duì)Ⅰ期卵巢癌的檢出率仍低于50%[2]，并且，CA125的特異性并不強(qiáng)，很多良性和惡性疾病，如子宮內(nèi)膜癌、妊娠、盆腔炎癥、結(jié)腸癌、肺癌等都可能會(huì)出現(xiàn)假陽性；陰道超聲檢查、磁共振成像等傳統(tǒng)的診斷方法假陽性率高，特異性低。卵巢癌患者對(duì)化療的敏感性存在個(gè)體差異，有些患者經(jīng)手術(shù)、化療等治療后復(fù)發(fā)，其對(duì)化療藥物的耐藥增加進(jìn)一步治療的難度。缺乏用于診斷的特異性的生物標(biāo)記物和化療藥物的耐藥性成為了卵巢癌早期診斷和治療的主要問題。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后與DNA異常甲基化有著密切的關(guān)系。并且DNA甲基化比較穩(wěn)定，能在血清中檢測，未來可以作為一種微創(chuàng)檢查方法。

1　游離DNA

游離DNA（cell-free DNA）是細(xì)胞外游離存在于體液中的DNA，可由正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，目前已在血清、尿液、前列腺液、唾液等體液中檢測到。早在1947年，Mandel等[3]就發(fā)現(xiàn)在人血漿和血清中存在核酸，并提出“循環(huán)核酸”的概念。成年人每天有幾十億細(xì)胞通過死亡、凋亡等方式進(jìn)行消除，這可能就是人血漿和血清中游離DNA的來源（圖1）[4]。游離循環(huán)DNA的微創(chuàng)檢測對(duì)人類疾病的診斷、治療和預(yù)后來說，有巨大的潛能和優(yōu)勢(shì)[5]。

圖1　血漿或血清中的游離DNA的來源大致分為兩類：一是腫瘤內(nèi)游離DNA經(jīng)侵襲或轉(zhuǎn)移直接進(jìn)入血液循環(huán)中；二是血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死等釋放DNAFig.1 There are twoways for the source of cell-free DNA in serum:one is that cell-free DNA in tumor breaks into the blood circulation directly by invasion ormetastasis;the other is that DNA in tumor cellswhich are in the circulation through apop tosisand necrosis com esout to the b lood circu lation

2　DNA甲基化

DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）作用下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的過程（圖2A）。DNA甲基化通常發(fā)生在CpG位點(diǎn)的C上。CpG島（CpG island）為CpG位點(diǎn)較為密集區(qū)域，在人類全基因組中，大約60%的CpG島位于基因的啟動(dòng)子[6]，并且大多是非甲基化的，可以維持基因轉(zhuǎn)錄的活性，而島外的CpG位點(diǎn)多數(shù)是甲基化的，維護(hù)基因的穩(wěn)定[7]，所以DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)起到非常重要的調(diào)控作用。

隨著對(duì)DNA甲基化研究的深入，發(fā)現(xiàn)了多種檢測方法。其中最早出現(xiàn)的是甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶后PCR或者DNA印跡法，但其對(duì)假陽性產(chǎn)物同樣敏感，并且需要大量的DNA[8]。

到20世紀(jì)90年代中期，出現(xiàn)甲基化特異性PCR，該方法采用重亞硫酸鹽處理DNA后，將所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被轉(zhuǎn)換，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過特異性的引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以經(jīng)過電泳判斷甲基化情況[9]。MSP雖然特異性強(qiáng)，但仍有很多缺點(diǎn)，重亞硫酸鹽處理DNA樣本時(shí)，因?yàn)镈NA需要長時(shí)間暴露在較嚴(yán)苛的環(huán)境中，常常引起DNA的裂解[10]。而且硫化過程長達(dá)16 h，推遲了觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的時(shí)間，并且不能對(duì)甲基化程度定量[11]。

現(xiàn)在很多試劑盒的技術(shù)改進(jìn)，DNA裂解降低，胞嘧啶到尿嘧啶的轉(zhuǎn)換率提高，硫化時(shí)間也縮短至4h[12]，定量MSP也應(yīng)用于基因的甲基化檢測。但是，從DNA提取到重亞硫酸鹽處理，需要很多步驟，多次轉(zhuǎn)移樣本會(huì)增加樣本污染和損失，尤其血清游離循環(huán)DNA含量非常少，所以，仍需要改進(jìn)技術(shù)來保證樣本的質(zhì)和量。

3　DNA異常甲基化在卵巢癌中的研究

在腫瘤的異常DNA甲基化中，主要是兩種對(duì)立的表觀修飾方式，一是致癌基因的低甲基化修飾導(dǎo)致的基因異常高表達(dá)，二是抑癌基因的甲基化修飾導(dǎo)致的基因失活（圖2B）。

3.1高甲基化與卵巢癌

在腫瘤中，啟動(dòng)子DNA異常的高甲基化是除了基因缺失和突變外，可以導(dǎo)致抑癌基因功能失活的另外一種途徑[13]。在卵巢癌中，研究最多的就是經(jīng)典抑癌基因BRCA 1，該基因有一定的遺傳性和散發(fā)性，而在散發(fā)的卵巢癌中，異常高甲基化是導(dǎo)致非突變BRCA1失活的原因之一[14-15]。而研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于Ⅰ期和健康人，處于Ⅱ期和Ⅲ期的上皮性卵巢癌病例中，BRCA1啟動(dòng)子明顯呈高甲基化狀態(tài)[16]。在基因錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)基因中，有研究發(fā)現(xiàn)，hMLH1啟動(dòng)子高甲基化占卵巢癌的56%，而hMSH2啟動(dòng)子高甲基化占57%，且兩個(gè)基因表達(dá)明顯降低[17]。其他基因如RASSF1A及相關(guān)的OPCML等基因也被發(fā)現(xiàn)高甲基化[18]，細(xì)胞黏附相關(guān)基因H-cadherin和CDH1也有相似結(jié)果[19]?？梢姡呒谆瘜?dǎo)致的抑癌相關(guān)基因失活與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

3.2低甲基化與卵巢癌

二是基于產(chǎn)城布局確定校址。職業(yè)教育是與產(chǎn)業(yè)緊密結(jié)合的教育種類，“產(chǎn)教融合、校企合作”是基本要求。根據(jù)現(xiàn)代城市建設(shè)、經(jīng)濟(jì)發(fā)展、產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的先進(jìn)做法看，產(chǎn)城教融合是未來新型城市發(fā)展的典型模式，一個(gè)重要做法就是把職業(yè)學(xué)校建立在產(chǎn)城融合的“新城鎮(zhèn)”，實(shí)現(xiàn)“宜居”“宜產(chǎn)”“宜教”，這在江蘇、貴州等地得到了良好印證。云陽縣結(jié)合大數(shù)據(jù)產(chǎn)業(yè)園建設(shè)，計(jì)劃將縣職教中心整體搬遷至水口工業(yè)園區(qū)，進(jìn)行全新規(guī)劃建設(shè)，打造“產(chǎn)教融合、校企合作”的示范。

DNA低甲基化最早被發(fā)現(xiàn)是與染色體不穩(wěn)定、印記缺失有關(guān)[20]。在人惡性腫瘤中，DNA低甲基化常發(fā)生在DNA重復(fù)序列和衛(wèi)星DNA，近期的研究證明，這些低甲基化的重復(fù)序列可能是轉(zhuǎn)座因子，散布在全基因，并且使基因組不穩(wěn)定[21]。然而直到現(xiàn)在，仍不能確定低甲基化是否能再激活惡性腫瘤中因高甲基化而沉默的基因。但至少在一些癌癥相關(guān)報(bào)道中，編碼區(qū)及非編碼區(qū)存在低甲基化。

有研究顯示，卵巢癌中衛(wèi)星2（Sat2）的DNA存在低甲基化，與正常卵巢組織相比，1號(hào)染色體Sat2低甲基化在卵巢癌中，與疾病分期和腫瘤級(jí)別顯著相關(guān)[22]。

圖2　 A：在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNM T）作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶；B：甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系，甲基基團(tuán)為甲基結(jié)合蛋白提供靶向位點(diǎn)，使其通過募集組蛋白去乙酰氨基酶等協(xié)阻抑物實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制Fig.2 A：show s reactionsusing S-adenosyl-m ethionine (SAM)asam ethyldonor and catalyzed by enzymes called DNAmethyltransferases(DNMT)add amethylgroup to the cytosine ring to form m ethyl cytosine;B：show s the relationship between themethylation of promoter and the gene expression.M ethylation of promoters inhibits their recognition by transcrip tion factorsand RNA polym erase, asm ethylated cytosine binding protein,or M eCP.W hen a promoter region normally recognized by an activating transcrip tion factor,ism ethylated,its transcrip tion is inhibited

4　游離DNA異常甲基化在卵巢癌中的研究

4.1卵巢癌診斷相關(guān)

現(xiàn)在卵巢癌的診斷仍依賴于CA125等腫瘤標(biāo)志物的檢測，確診仍需活體組織病理學(xué)檢查，但確診時(shí)往往已經(jīng)到了晚期。最新研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌形成初期常出現(xiàn)DNA甲基化異常，較其表達(dá)產(chǎn)物早，且早于其他標(biāo)志物出現(xiàn)，并可在血清、腹腔液體等體液中檢測到。雖然很多研究報(bào)道是關(guān)于卵巢癌異常甲基化的，但很少有報(bào)道是關(guān)于卵巢癌血清中的DNA異常甲基化。Caceres等[23]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌血清DNA樣本中，RASSF1A和BRCA1啟動(dòng)子甲基化的陽性率分別為25/50（50%）和9/50（18%），陰性對(duì)照為20例，由于陰性對(duì)照數(shù)量較少，所以不能得出精確的特異性。但Liggett等[24]收集30位卵巢癌患者、30位卵巢良性疾病患者及30位健康人的病例，聯(lián)合檢測血清DNA中RASSF1A、CACLA、EP300的高甲基化情況，與健康人相比，卵巢癌患者的敏感性為90%，特異性為87%；與卵巢良性疾病患者，卵巢癌患者RASSF1A和PGR聯(lián)合檢測的敏感性為80%，特異性為73.3%。越來越多的研究展示游離DNA異常甲基化作為卵巢癌檢測的巨大潛能，但從實(shí)驗(yàn)應(yīng)用到臨床還有很長的路，因?yàn)槿狈珳?zhǔn)又經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)和檢測標(biāo)準(zhǔn)。

4.2卵巢癌治療相關(guān)

化療藥物抵抗目前是提高卵巢癌患者生存率的主要障礙，尤其是復(fù)發(fā)性卵巢癌。多數(shù)化療藥物作用是依靠誘導(dǎo)凋亡，故腫瘤細(xì)胞常常通過下調(diào)凋亡基因，或高表達(dá)抗凋亡基因來獲得化療抵抗性。基因突變、缺失或等位基因的丟失是不可逆的，但表觀異常是可以改變的。Su等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中，高甲基化沉默Wnt通路中的SFRP5與鉑類化療藥物抵抗性有關(guān)，相似的研究里，hHMLA1、精氨酸生物合成相關(guān)基因ASS1和ESR2也與鉑類藥物抵抗相關(guān)[26]。有研究表明HSulf-1的表達(dá)可以影響化療反應(yīng)，通過使HSulf-1啟動(dòng)子高甲基化致其表達(dá)下調(diào)后，可導(dǎo)致順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用下降，在卵巢癌細(xì)胞株OV167和OV202中，HSulf-1高表達(dá)者化療反應(yīng)率能達(dá)到90%，而低表達(dá)者約63%[27]。DNA甲基化與基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的活性相關(guān)，將核酸類似物加入到快速生長的腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，其可通過抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，從而降低抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化，增加抑癌基因的表達(dá)[28]，研究顯示獲得性鉑類抵抗卵巢癌中可以觀察到DNMT上調(diào)，表明異常的甲基化與DNMT活性增長相關(guān)。

異常的DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在診斷和治療方面有一定的價(jià)值，在判斷患者預(yù)后也有潛力。單基因甲基化檢測缺乏特異性，多基因甲基化檢測可增加特異性和敏感性，Su等[30]收集卵巢癌患者血清游離DNA對(duì)SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、SOX1、PAX1和LMX1A七個(gè)基因進(jìn)行甲基化檢測，結(jié)果顯示其結(jié)果與患者的化療效果及復(fù)發(fā)、總體生存率相關(guān)。研究表明，游離DNA甲基化可以用于判斷預(yù)后，有很好的研究前景。

Pattamadilok等[31]在研究中發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中，LINE-1的重復(fù)序列的DNA低甲基化與其組織分型、腫瘤分級(jí)和病理分期（FIGO）相關(guān)，當(dāng)LINE-1甲基化水平低時(shí)，其總體生存率降低，預(yù)后較差，但暫時(shí)沒有關(guān)于游離DNA低甲基化與卵巢預(yù)后關(guān)系的研究。

5　結(jié)語

由于卵巢癌早期，患者常無特殊臨床表現(xiàn)，因此早期診斷對(duì)于治療和提高生存率尤為重要，同時(shí)，化療藥物的耐藥性依然是治療過程中的重大難題，所以尋找新的生物標(biāo)記物和增加化療藥物敏感性成為了研究熱點(diǎn)，上述各項(xiàng)研究表明游離循環(huán)DNA異常甲基化可以通過血清、腹腔積液等體液檢測到，未來可能成為卵巢癌微創(chuàng)檢測新方法。而其對(duì)治療和預(yù)后的判斷可以幫助實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化治療。雖然表觀遺傳學(xué)在卵巢癌的研究中獲得了很大的進(jìn)步，但目前仍需尋找卵巢癌相關(guān)的高特異性的異常甲基化的基因，研究更為高效、微創(chuàng)的檢測方法，使得卵巢癌的篩查和診斷更簡便、有效、準(zhǔn)確，并更加廣泛地應(yīng)用于臨床檢測。

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Research p rogressof aberrantcell-free DNAmethylation in ovarian cancer

XU Mengjiao1，TONG Xiaowen2
1.TongjiUniversity SchoolofMedicine，Shanghai200092，China；2.DepartmentofObstetricsand Gynecology，TongjiHospital，TongjiUniversity School of Medicine，Shanghai 200065，China

Ovarian cancer is one of themost common malignant tumors in gynecology.In early stage，there is usually no symptom.Most patients are diagnosed in a later stage or aftermetastasis.It has been revealed that the onset，development，diagnosis and treatment of ovarian cancer are closely related to the aberrant DNA methylation.The research on the mechanism of DNA methylation maycontribute to the early diagnosis，treatment and prognosis prediction of ovarian cancer.Cell-free DNA comes from tumor cellnecrosis and apoptosis，and plays an important role in the research of diagnosis and treatment of ovarian cancer.The research progress of aberrant DNA methylation in ovarian cancer is reviewed in this paper.

Cell-free DNA；DNAmethylation；Ovarian cancer；CpG island

R711.7

A

2095-378X（2016）02-0132-04

10.3969/j.issn.2095-378X.2016.02.017

徐夢(mèng)嬌（1990—），女，在讀碩士研究生，研究婦科腫瘤

童曉文，電子信箱：xiaowen_tong@yahoo.com

（2016-03-21）

（2016-01-22）