慢性疼痛對(duì)孕鼠及其子代抑郁行為的影響

李麗，陳翠，黃悅，譚迎春，周芳

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 ICU，江蘇 徐州 221002)

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·論 著·

慢性疼痛對(duì)孕鼠及其子代抑郁行為的影響

李麗1，陳翠2，黃悅1，譚迎春1，周芳1

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 ICU，江蘇 徐州 221002)

目的:構(gòu)建孕鼠慢性疼痛動(dòng)物模型，觀測(cè)慢性疼痛對(duì)孕鼠及其子代抑郁行為的影響。方法：將交配成功的母鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)對(duì)照組和慢性疼痛組(n=10)。慢性疼痛組母鼠足跖關(guān)節(jié)皮內(nèi)注射無(wú)菌完全弗氏佐劑100 μl[500μg·(100μl)-1] 誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎痛，疼痛可覆蓋母鼠整個(gè)孕期(22d左右)及產(chǎn)后1周。用糖水消耗實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)母鼠及子鼠的抑郁行為表現(xiàn)。結(jié)果:(1) 母鼠：在造模后第12、18天及產(chǎn)后第6天，糖水實(shí)驗(yàn)中慢性疼痛組小鼠糖水偏好度與假手術(shù)對(duì)照組比較均顯著降低(P<0.01)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中慢性疼痛組小鼠直立次數(shù)和中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離與假手術(shù)對(duì)照組比較均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，余時(shí)間點(diǎn)3組各指標(biāo)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2) 子鼠：慢性疼痛組子鼠在出生后3周時(shí)其糖水偏好度、直立次數(shù)、中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離均低于假手術(shù)對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，在出生后6周時(shí)其糖水偏好度及直立次數(shù)低于假手術(shù)對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，余時(shí)間點(diǎn)3組各指標(biāo)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：慢性疼痛對(duì)孕鼠及其子代的抑郁行為有促發(fā)作用。

慢性疼痛； 孕鼠； 子鼠； 抑郁

疼痛是危害人類健康和嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量的常見臨床病癥。持續(xù)或間歇性地持續(xù)3個(gè)月以上的疼痛被稱為慢性疼痛[1]，其在普通人群中的發(fā)生率為20%～45%[2]。抑郁癥是另一個(gè)嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的常見疾病，目前我國(guó)抑郁癥的發(fā)生率在5%～15%，且呈迅速上升趨勢(shì)[3- 5]，在美國(guó)等西方發(fā)達(dá)國(guó)家抑郁癥的發(fā)生率高達(dá)17.1%[6]。流行病學(xué)研究顯示，抑郁人群的疼痛發(fā)生率和疼痛人群中抑郁的發(fā)生率均高于各自單純疾病。慢性疼痛病人中抑郁癥的發(fā)生率高達(dá)30%～54%[7]。抑郁癥病人中慢性疼痛患病率為15%～92%[8]，大多數(shù)就診的抑郁癥患者都訴有長(zhǎng)期存在的頭痛、肌肉關(guān)節(jié)痛、腹痛等癥狀[9]。在成年雄性小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型及慢性炎癥性疼痛模型中，小鼠顯示出明顯的抑郁樣行為[10]。而有抑郁癥狀的小鼠，其痛閾值有顯著下降現(xiàn)象[11]。這些研究結(jié)果均提示，疼痛和抑郁是密切聯(lián)系、相互影響的。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，社會(huì)生活中的特殊群體妊娠期婦女如罹患慢性疼痛會(huì)出現(xiàn)焦慮、抑郁等不良情緒[12]。長(zhǎng)期處于慢性疼痛與負(fù)性情緒的狀態(tài)下，其子代健康也恐遭受不利影響。而目前學(xué)術(shù)界對(duì)此部分的研究少見報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建孕期小鼠慢性炎癥性疼痛模型，觀測(cè)慢性疼痛對(duì)孕鼠及其子鼠抑郁行為的影響，以揭示孕期慢性疼痛的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

選用未受孕過的雌性小鼠，65～80日齡，33～35g，同批交配，交配用成年雄性小鼠，25～45g，實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均為SPF級(jí)昆明小鼠，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)[SYXK(Jiangsu) 2002- 0038]，10～12h后發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道涂片發(fā)現(xiàn)精蟲者定為妊娠第 0天。選取30只成功受孕小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)對(duì)照組、慢性疼痛組3組，每組10只。子鼠出生后剔除死胎、發(fā)育畸形、先天殘疾小鼠后對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)表法分別選出正常組子鼠、假手術(shù)組子鼠和慢性疼痛組子鼠各10只。所有小鼠均按常規(guī)方式飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠慢性疼痛模型的制備

慢性關(guān)節(jié)炎疼痛模型:母鼠交配成功后當(dāng)日(妊娠第0天)，在異氟醚麻醉下，圍繞左后足足跖關(guān)節(jié)部選擇兩點(diǎn)皮內(nèi)注射無(wú)菌完全弗氏佐劑[complete Freund’s adjuvant，CFA，500μg·(100μl)-1]100μl，誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。在注射后的24 h(妊娠第1天，即疼痛造模第1天)即出現(xiàn)熱和機(jī)械痛覺閾值的降低并可維持4周以上，覆蓋母鼠整個(gè)孕期(22d左右)及產(chǎn)后1周。

假手術(shù)對(duì)照組母鼠用同樣麻醉方式、同樣注射方法、同樣注射部位注入同體積無(wú)菌PBS。

1.2.2 孕鼠及其子鼠抑郁行為監(jiān)測(cè)

孕鼠在造模后6、12、18d(如當(dāng)日母鼠出現(xiàn)早產(chǎn)征兆則不測(cè))及產(chǎn)后6d監(jiān)測(cè)其抑郁行為狀況。子鼠分別于出生后3周(幼年期，可離乳獨(dú)立生活)、6周(青春期)、9周(成熟期)監(jiān)測(cè)其抑郁行為狀況。因本研究所用動(dòng)物為孕鼠，為避免抑郁行為監(jiān)測(cè)方法對(duì)其機(jī)體造成較大刺激而誘發(fā)早產(chǎn)、流產(chǎn)、難產(chǎn)、死胎等傷害，故選擇對(duì)動(dòng)物生理影響較小的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和糖水實(shí)驗(yàn)來監(jiān)測(cè)。

1.2.2.1 糖水實(shí)驗(yàn) 糖水實(shí)驗(yàn)正式開始前先進(jìn)行適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)1周:小鼠單只單籠飼養(yǎng)，每籠配有自來水和1%糖水的飲水瓶各一，兩水瓶擺放位置、高度均一致，每隔12h將兩飲水瓶的位置互換1次。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)1周 后，分別向每瓶加入足量的糖水或自來水并稱量各瓶質(zhì)量做好記錄，24h后再次稱量糖水和自來水質(zhì)量，計(jì)算每只小鼠糖水偏好度，即小鼠24h消耗的糖水量占總水量(糖水量+自來水量)的百分比。

1.2.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將小鼠置于高50cm、邊長(zhǎng)100cm、底面平均分成25個(gè)小格(20 cm×20cm)、周邊和底面均為黑色的方形曠場(chǎng)分析箱中，自然光照，室內(nèi)隔音。沿墻格為外周區(qū)域，其余為中央?yún)^(qū)域。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)捏住小鼠尾巴距根部2/3處輕放入分析箱正中格中，顯示器中觀察其5 min內(nèi)活動(dòng)情況，每次觀測(cè)結(jié)束后將小鼠排泄物清理干凈，每只僅測(cè)定1次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束錄像分析，軟件統(tǒng)計(jì)。選取中央活動(dòng)路程和直立次數(shù)(兩前肢離地1cm以上)2個(gè)指標(biāo)來判斷動(dòng)物是否出現(xiàn)抑郁樣行為。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0軟件(GraphPad Software，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并生成統(tǒng)計(jì)圖表。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用百分比表示。各組行為學(xué)結(jié)果采用雙因素方差分析(two- way ANOVA，時(shí)間為組內(nèi)因素，處理為組間因素)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢性疼痛對(duì)母鼠抑郁行為的影響

CFA造模后24h慢性疼痛組小鼠熱縮潛伏期與對(duì)照組相比顯著下降，提示造模成功。對(duì)3組動(dòng)物均進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。在糖水實(shí)驗(yàn)中，3組動(dòng)物在造模后第6天糖水偏好度無(wú)差異(P>0.05);在造模后第12天、第18天、產(chǎn)后第6天，慢性疼痛組小鼠糖水偏好度與假手術(shù)對(duì)照組比較均顯著降低(P<0.01)，見圖1A。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，3組動(dòng)物在造模后第6天直立次數(shù)和中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離均無(wú)差異(P>0.05);在造模后第12天、第18天、產(chǎn)后第6天，慢性疼痛組小鼠直立次數(shù)和中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離與假手術(shù)對(duì)照組比較均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖1B、C。

2.2 慢性疼痛對(duì)子鼠抑郁行為的影響

在糖水實(shí)驗(yàn)中，慢性疼痛組子鼠在出生后3、6周時(shí)，其糖水偏好度與假手術(shù)對(duì)照組比較明顯降低(P<0.05)，出生9周時(shí)3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2A。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，慢性疼痛組子鼠在出生后3、6周時(shí)，其直立次數(shù)與假手術(shù)對(duì)照組比較顯著減少(P<0.05或P<0.01)，至出生后9周時(shí)3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2B。慢性疼痛組子鼠在出生后3周，其中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離與假手術(shù)對(duì)照組相比明顯縮短(P<0.05)，出生6周后3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2C。

3 討 論

慢性疼痛的長(zhǎng)期折磨會(huì)導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。其機(jī)制可能是慢性疼痛引起外周和中樞的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子(pro- inflamma torycytokines，PICs)釋放，激活氧化/硝化應(yīng)激(oxidative and nitrosative stress，O&NS)通路，誘導(dǎo)下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo- pituitary- adrenocorticative and nitrosative stress，O&NS)通路，誘導(dǎo)下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo- pituitary- adrenocortical，HPA) 軸亢進(jìn)，減少5- HT的釋放，從而導(dǎo)致抑郁[13]。從外在表現(xiàn)來看，人類抑郁的表現(xiàn)主要為生活興趣丟失，動(dòng)物抑郁的表現(xiàn)為探索性活動(dòng)減少及快感缺失。快感缺失是指對(duì)獎(jiǎng)賞自身及獎(jiǎng)賞水平變化的敏感性降低[14]。甜味溶液對(duì)嚙齒類動(dòng)物是一種有效的獎(jiǎng)賞。通常采用糖水消耗量或糖水偏好系數(shù)來評(píng)價(jià)動(dòng)物快感缺失的程度。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為糖水偏好系數(shù)降低是動(dòng)物抑郁的核心癥狀[15]。本研究糖水實(shí)驗(yàn)中，慢性疼痛組孕鼠糖水偏好度與對(duì)照組相比顯著下降，提示其快感缺失，出現(xiàn)抑郁癥狀。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，中央?yún)^(qū)活動(dòng)路程和直立次數(shù)可以反映動(dòng)物的探索性行為，這也是動(dòng)物抑郁情緒的重要指標(biāo)[16]。本研究中慢性疼痛組孕鼠這兩個(gè)指標(biāo)均顯著低于假手術(shù)對(duì)照組。據(jù)此可認(rèn)為慢性疼痛導(dǎo)致了孕鼠的抑郁情緒出現(xiàn)。不管是人類還是動(dòng)物，孕產(chǎn)期母體荷爾蒙水平波動(dòng)均較大，且這種變化與抑郁的發(fā)生密切相關(guān)[17- 18]，故本實(shí)驗(yàn)選擇了母鼠孕早期(孕6d，即疼痛造模第6天)、中期(孕12d，即疼痛造模第12天)、晚期(孕18d，即疼痛造模第18天)及產(chǎn)后早期(產(chǎn)后6d)這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別對(duì)其進(jìn)行抑郁行為學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)慢性疼痛孕鼠的各抑郁行為數(shù)據(jù)之間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能跟本實(shí)驗(yàn)樣本量不夠大有關(guān)，我們將在以后的研究中予以補(bǔ)充。

與假手術(shù)對(duì)照組比較，aP<0.01，bP<0.05

圖1 慢性疼痛對(duì)孕鼠抑郁行為的影響

與假手術(shù)對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖2 孕期慢性疼痛對(duì)子鼠抑郁行為的影響

此外，孕期有抑郁癥狀的母體，其子代的健康狀況也會(huì)受到影響。人類母親抑郁的嬰兒會(huì)體驗(yàn)更多的負(fù)性情緒而表現(xiàn)出更高的情緒性，青少年表現(xiàn)為煩躁不安，擁有較少的快樂體驗(yàn)[19]。動(dòng)物母體抑郁，子代會(huì)出現(xiàn)焦慮、抑郁和行為退縮[15]。本實(shí)驗(yàn)中慢性疼痛組的子鼠在其幼年期(出生后3周)和青春期(出生后6周)接受糖水消耗實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，也表現(xiàn)出抑郁樣行為。這說明孕期慢性疼痛對(duì)親代和子代抑郁都能起到促發(fā)作用，其危害是長(zhǎng)期而深遠(yuǎn)的。然而我們注意到，慢性疼痛組子鼠到了成年期(出生后9周)，其抑郁樣行為逐漸消失。這可能與生長(zhǎng)發(fā)育期激素水平不穩(wěn)定，以及受試子鼠按窩飼養(yǎng)，群居生活有利于抑郁情緒的改善有一定關(guān)系。但這同時(shí)也提示，慢性疼痛對(duì)親代和子代的危害或許可以通過優(yōu)裕飼養(yǎng)(富足的食物、水、良好的飼養(yǎng)環(huán)境、群居生活等)來進(jìn)行干預(yù)，有望改善甚至消除母體慢性疼痛帶來的不良影響。

綜上所述，孕期慢性疼痛對(duì)母體和子代造成的危害是巨大而長(zhǎng)遠(yuǎn)的，應(yīng)當(dāng)引起廣大科研工作者的充分重視并積極探索早期干預(yù)方案。

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Effects of chronic pain on the depression behavior of pregnant mice and their offspring

LI Li1，CHEN Cui2，HUANG Yue1，TAN Ying- chun1，ZHOU Fang1

(1.NursingSchoolofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221004，China; 2.DepartmentofICU，AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221002，China)

Objective: To construct the animal model of chronic pain in pregnant mice，observe the effects of chronic pain on the depression behavior of pregnant mice and their offspring. Methods: The pregnant mice were divided into control group，sham- operation control group and chronic pain group(n=10).In the chronic pain group，aseptic complete Freund’s adjuvant 100 μl [500μg·(100μl)-1] was injected intracutaneously in the paw joint of pregnant mice to induce arthritis pain.The pain could cover the whole pregnancy(about 22 days)and 1 week after delivery.With syrup consuming experiment and open field test，the depression behavior of pregnant mice and their offspring was tested at different time points. Results: On the 12th day，18th day after making model and the 6th day after delivery，in the syrup consuming experiment，the sucrose preference degree of the female mice in the chronic pain group was significantly lower than that of the sham- operation control group(P<0.01)，and in the open field test，the straight times and the movement distance in the central quadrant of the female mice in the chronic pain group was significantly lower than that of the sham- operation control group(P<0.05 orP<0.01).The index of three groups had no difference at other time points(P>0.05).When the child mice were 3 weeks，their sucrose preference degree，straight times and movement distance in the central quadrant of the chronic pain group was lower than those of the sham- operation control group(P<0.05 orP<0.01).When the child mice were 6 weeks，their sucrose preference degree and straight times of the chronic pain group was lower than those of the sham- operation control group(P<0.05 orP<0.01).The child mice’ index of three groups had no difference at other time points(P>0.05). Conclusion: Chronic pain could spur the depression behavior of pregnant mice and their offspring.

chronic pain; pregnant mice; offspring; depression

2016- 06- 24

2016- 09- 03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81400894)；徐州市科學(xué)技術(shù)局立項(xiàng)課題(KC14SH090)

周芳 E- mail:meadow_zh@hotmail.com

李麗，陳翠，黃悅，等.慢性疼痛對(duì)孕鼠及其子代抑郁行為的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：938- 942.

R33- 33

A

1671- 6264(2016)06- 0938- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.022