DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21的構(gòu)建及其預(yù)防HSK的動物實驗初步研究

董莉莉，胡凱，湯明霞

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 眼科學(xué)系，江蘇 南京 210009； 2.江蘇省泰州市人民醫(yī)院 眼科，江蘇 泰州 225300；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 眼科，南京寧益眼科中心，江蘇 南京 210008)

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·論 著·

DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21的構(gòu)建及其預(yù)防HSK的動物實驗初步研究

董莉莉1，2，胡凱1，3，湯明霞1

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 眼科學(xué)系，江蘇 南京 210009； 2.江蘇省泰州市人民醫(yī)院 眼科，江蘇 泰州 225300；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 眼科，南京寧益眼科中心，江蘇 南京 210008)

目的:構(gòu)建DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21，探討其是否能誘導(dǎo)動物免疫應(yīng)答及抵抗眼角膜單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV- 1)的感染。方法：提取HSV- 1基因組DNA，PCR擴增獲得gC基因。以pRSC- gD- IL- 21質(zhì)粒為模板(本實驗室2011年構(gòu)建)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21，用納米材料殼聚糖(chitosan)包裹，采用黏膜接種的方式分別以pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan、pRSC- gD- IL- 21+chitosan、pRSC+chitosan及chitosan免疫小鼠3次，間隔2周，末次免疫2周后檢測各項免疫學(xué)指標(biāo)，同時評價小鼠對病毒攻擊角膜的免疫保護作用。結(jié)果：經(jīng)測序、酶切及Western blot鑒定，重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21構(gòu)建成功，chitosan包裹率高。與對照鼠相比，該疫苗在鼠體內(nèi)產(chǎn)生了更強的特異性中和抗體、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)及自然殺傷細(xì)胞(NK)殺傷活性增強、淚液中特異性sIgA水平增高，同時使小鼠產(chǎn)生了較強的針對眼角膜HSV- 1感染的免疫保護作用。結(jié)論：DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21構(gòu)建成功，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答及針對HSV- 1眼部感染的免疫保護作用，能夠預(yù)防單純皰疹病毒性角膜炎(HSK)的發(fā)生、發(fā)展。

單純皰疹病毒1型； DNA疫苗； 糖蛋白C； 殼聚糖； 單純皰疹病毒性角膜炎； 小鼠

單純皰疹病毒性角膜炎(HSK)是一種嚴(yán)重的世界性致盲性眼病，主要由單純皰疹病毒I型(HSV- 1)感染引起，它病情遷延、易復(fù)發(fā)，終身不愈，居角膜盲的首位[1]。鑒于目前尚無針對HSV- 1感染的有效藥物，因此，HSV DNA疫苗的研制及使用，使HSK的預(yù)防和根治成為可能。

HSV- 1包膜糖蛋白定位于病毒囊膜上，其中病毒糖蛋白D(gD)是HSV主要的免疫原，能誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫，產(chǎn)生高滴度中和抗體。而病毒糖蛋白C(gC)可以干擾機體的免疫反應(yīng)，是造成現(xiàn)有疫苗效果不佳的主要原因之一。2011年，我們研制了DNA疫苗pRSC- gD- IL- 21，已證明該疫苗對小鼠原發(fā)性HSK有明顯預(yù)防作用[2]。但我們認(rèn)為先前疫苗所誘發(fā)的特異性主動免疫還不足以強到能有效清除或殺傷復(fù)發(fā)感染病毒。因此，需要在此基礎(chǔ)上進行改進，研制新型的DNA疫苗，誘導(dǎo)更強有力的特異性主動免疫應(yīng)答，以治療復(fù)發(fā)性HSK。所以，本次實驗在原有基礎(chǔ)上，將gC與gD進行基因融合，構(gòu)建了新的疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21，采用納米材料殼聚糖(chitosan)包裹，對BALB/c小鼠免疫后，觀察其免疫效應(yīng)，評價其預(yù)防HSK發(fā)生、發(fā)展的效果，取得了一定成績，并為下一步最終應(yīng)用于復(fù)發(fā)性HSK鼠眼模型打下基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5a、重組質(zhì)粒pRSC- gD- IL- 21由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)系實驗室保存。

1.1.2 細(xì)胞與病毒

SP2/0細(xì)胞、293T細(xì)胞、YAG- 1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所；綠猴腎傳代細(xì)胞(Vero細(xì)胞)及HSV- 1 F株由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)系實驗室常規(guī)培養(yǎng)及保存。

1.1.3 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP混合液購自美國Promega公司；T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、KpnⅠ、NheⅠ購自MBI公司；鼠抗HSV- 1gD Ab、羊抗鼠IgG- HRP、殼聚糖購自Sigma公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自江蘇省弗泰生物科技有限公司。

1.1.4 實驗動物

6周齡BALB/c小鼠，雌性，購自揚州大學(xué)動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21的構(gòu)建

1.2.1.1 細(xì)胞和病毒的培養(yǎng) 復(fù)蘇并培養(yǎng)Vero細(xì)胞，單層細(xì)胞飽和至90%時接種HSV- 1病毒懸液，待細(xì)胞病理改變達到60%左右時收獲細(xì)胞，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 gC基因的獲得 常規(guī)酚抽提法提取HSV- 1感染的Vero細(xì)胞基因組DNA。設(shè)計引物，以HSV- 1基因組DNA為模板，PCR擴增gC胞外區(qū)基因。上游引物：5′- AAGCTTGGCTCGGAAACTGCCTCCAC- 3′;下游引物：5′- GCTAGCTCATTGCCCCCACCCACTCGATCGCCTCGA- 3′。

1.2.1.3 pRSC- gD- Linker- IL- 21質(zhì)粒的構(gòu)建 (1) 設(shè)計引物，采用(GGGS)3柔性肽作為連接物(Linker)，以pRSC- gD- IL- 21質(zhì)粒為模板，經(jīng)兩輪PCR擴增后獲得gD- Linker基因片段。上游引物：5′- GGTACCGCCGC CACCATGGGGGGGGCTGCCGCCA- 3′；第一輪擴增下游引物:5′- CCACCCGAACCTCCACCTTHCCATGTTGTTCGG GGTGGCCGGGGGAT- 3′;第二輪擴增下游引物：5′- AAGCTTAGAACCTCCACCTGAACCTCCACCCGAACCTCC ACCCATG- 3′。(2) 從質(zhì)粒PRSC- gD- IL- 21中切下gD片段獲得PRSC- IL- 21，將gD- Linker基因片段和pRSC- IL- 21進行KpnⅠ/HindⅢ雙酶切及連接反應(yīng)，獲得pRSC- gD- Linker- IL- 21質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌中。

1.2.1.4 pRSC- gD.gC- IL- 21重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將純化的gC基因片段和質(zhì)粒pRSC- gD- Linker- IL- 21進行NheⅠ/HindⅢ雙酶切及連接反應(yīng)，獲得質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL21，轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌中。

1.2.2 重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21的鑒定

對重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21進行PCR鑒定及雙酶切鑒定，陽性克隆寄送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞進行Western blot鑒定。

1.2.3 DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan納米顆粒的制備

1.2.3.1 緩沖液的配制 配制pH值為5.5的NaAc緩沖液，將殼聚糖溶于其中，濃度為0.02%(w/v)，將質(zhì)粒DNA用Na2SO4溶液稀釋為100 μg·ml-1，將殼聚糖溶液和質(zhì)粒溶液55 ℃水浴10 min后以等體積混合，振蕩混勻制成pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan溶液。

1.2.3.2 質(zhì)粒DNA包封率的檢測 取適量pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan溶液，離心，設(shè)pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan顆粒溶液為陽性對照，pRSC- gD.gC- IL- 21為陰性對照，對沉淀和上清中質(zhì)粒的量比進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。取pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan溶液(含1 μg質(zhì)粒DNA)，離心，上清液用無水乙醇沉淀溶于20 μl去離子水中，檢測上清液中質(zhì)粒DNA的濃度及含量(紫外分光光度計)，計算包裹效率的公式：包裹效率(%)=100%×(質(zhì)粒DNA加入的總量-質(zhì)粒DNA未被包裹的量)/質(zhì)粒DNA加入的總量。

1.2.3.3 包裹質(zhì)粒DNA的DpnⅠ保護試驗 分別取pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan溶液及pRSC- gD.gC- IL- 21溶液定量，加入定量水，反應(yīng)緩沖液和DpnⅠ構(gòu)成50 μl反應(yīng)體系。37 ℃孵育1 h后加入加樣緩沖液終止反應(yīng)，兩種溶液均設(shè)酶消化前的陰性對照，進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定DpnⅠ消化結(jié)果。

1.2.4 納米質(zhì)粒的大量制備

用質(zhì)粒大量抽提QIAGENTM試劑盒分別抽提和純化pRSC- gD.gC- IL- 21、pRSC- gD- IL- 21、pRSC 3組質(zhì)粒，用殼聚糖包裹好備用。

1.2.5 動物免疫

取6周齡BALB/c小鼠48只，隨機分為pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組、pRSC- gD- IL- 21+chitosan組、pRSC+chitosan組、chitosan組4組，每組12只，每只鼠雙眼結(jié)膜囊滴相應(yīng)質(zhì)粒5 μl(含25 μg DNA)。免疫3次，每次間隔2周。于末次加強免疫后2周，上述各組免疫小鼠12只中的6只用于免疫學(xué)指標(biāo)檢測，6只用于病毒角膜攻擊實驗。

1.2.6 免疫學(xué)指標(biāo)檢測

1.2.6.1 免疫鼠血清中和抗體檢測 小鼠眼眶靜脈取血，分離血清，將其置于56 ℃水浴中滅活30 min后進行倍比稀釋，加入相同體積的病毒懸液(滴度為7.1×106TCID50·ml-1)于37 ℃孵育1 h，然后接種于Vero細(xì)胞中孵育3 d，顯微鏡下觀察，以能導(dǎo)致50%的細(xì)胞產(chǎn)生病變的血清稀釋度的倒數(shù)計算中和抗體的效價。

1.2.6.2 脾淋巴細(xì)胞特異性靶細(xì)胞殺傷以及NK細(xì)胞殺傷活性檢測 處死小鼠，取脾，制成細(xì)胞濃度為1×106ml-1的脾細(xì)胞懸液，作為檢測脾細(xì)胞、NK細(xì)胞活性的效應(yīng)細(xì)胞。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pRSC- gD- IL- 21及空質(zhì)粒pRSC(陰性對照)的SP2/0細(xì)胞分別作為各組脾細(xì)胞特異性殺傷活性檢測的靶細(xì)胞;同樣處理的YAC- 1細(xì)胞作為檢測各組NK細(xì)胞活性的靶細(xì)胞，靶細(xì)胞濃度為1×104ml-1。檢測在96孔板中進行，各組設(shè)實驗孔(A)、靶細(xì)胞最大釋放孔(B)、靶細(xì)胞自然釋放孔(C)及背景空白對照孔(D)。效靶比為50∶1，常規(guī)LDH釋放法檢測細(xì)胞毒性。殺傷率(%)=(A OD490 nm-C OD490 nm-D OD490 nm)/(B OD490 nm-C OD490 nm-D OD490 nm)×100。

1.2.6.3 小鼠淚液中特異性分泌性IgA水平比較 每只鼠兩眼各用眼科專用棉簽完全置入眼結(jié)膜囊中，使小鼠眼瞼閉合5 min，取出被淚液浸濕的棉簽置入已加入100 μl PBS的EP管，每隔3 h取1次，共5次。采用間接ELISA方法測定淚液中抗gD IgA抗體：用HSV- 1gD抗原包被酶標(biāo)板，加1∶2稀釋度的待檢小鼠淚液，二抗為羊抗鼠IgA- HRP，DAB底物顯色后，測OD490 nm光吸收值，以正常小鼠淚液作陰性對照，陽性淚液與陰性淚液的OD值之比，即P/N≥2.1為陽性。

1.2.7 病毒攻擊實驗

用病毒HSV- 1 F株攻擊小鼠眼角膜。小鼠腹腔注射麻醉后在顯微鏡下用1 ml空針頭劃傷角膜，深度控制在上皮層，向結(jié)膜囊內(nèi)滴加5 μl病毒懸液，閉眼瞼5 min。從次日開始，每天用眼科裂隙燈顯微鏡觀察并記錄小鼠角膜病變情況。角膜病變程度積分評價標(biāo)準(zhǔn)如下。0分：上皮無病變或點狀病變，基質(zhì)無水腫、混濁；1分：上皮星狀病變或基質(zhì)輕度水腫、混濁；2分：上皮樹枝狀或地圖樣病變面積小于角膜四分之一，或者基質(zhì)水腫、混濁病變小于二分之一角膜直徑；3分：上皮樹枝狀或地圖樣病變面積小于角膜二分之一，或者基質(zhì)水腫、混濁病變大于二分之一角膜直徑；4分：上皮樹枝狀或地圖樣病變面積超過角膜面二分之一，或者基質(zhì)嚴(yán)重水腫、混濁，虹膜不可見。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21的雙酶切鑒定及PCR鑒定

重組質(zhì)粒pRSC-gD.gC-IL- 21經(jīng)測序，序列與GenBank符合率為97%，采用gC引物經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果亦顯示符合gC序列長度(1 393bp)，說明重組質(zhì)?；驑?gòu)建正確。重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ/NheⅠ雙酶切及HindⅢ/NheⅠ雙酶切，分別切出目的基因gD+gC(2 454bp)及gC(1 393bp)。說明插入的基因正確(圖1)。

Lane1.陽性克隆KpnⅠ/NheⅠ雙酶切驗證(gD+gC，2 454bp);

Lane2.陽性克隆HindⅢ/NheⅠ雙酶切驗證(gC，1 393bp);

Lane3.陽性克隆擴增gC基因;LaneM.DNAMarker

圖1 重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21的雙酶切鑒定及PCR鑒定

2.2 重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21 Western blot蛋白表達鑒定

有目的蛋白gD.gC表達，約為117 KD，分子量適當(dāng)，說明DNA疫苗PRSC- gD.gC- IL- 21制備成功(圖2)。

Lane 1.轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒的細(xì)胞擴增出gD+gC(48+69 KD);Lane 2.未轉(zhuǎn)染的空細(xì)胞;Lane M.Western Marker

圖2 重組質(zhì)粒pRSC- gD.gC- IL- 21 Western blot鑒定

2.3 殼聚糖包封率瓊脂糖凝膠電泳檢測

上清的OD260 nm值為1.5 ng·μl-1，包裹效率=100%×(1 000 ng-30 ng)/1 000 ng=97%。電泳檢測示裸質(zhì)粒泳道顯示出明顯的條帶，pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan納米顆粒離心上清的泳道中未見明顯條帶，而槽內(nèi)可見被染色的pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan納米顆粒，說明質(zhì)粒已被殼聚糖包裹(圖3)。

Lane 1.pRSC- gD.gC- IL- 21;Lane 2.pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan離心上清;Lane 3.pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan顆粒溶液

圖3 殼聚糖包封質(zhì)粒DNA的電泳分析

2.4 pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan DpnⅠ保護試驗

使用等量的DpnⅠ酶，可見pRSC- gD.gC- IL- 21被降解成小片段，而等量DNA的pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan顆粒仍留在槽中無變化，說明殼聚糖能保護質(zhì)粒DNA不被DpnⅠ消化(圖4)。

2.5 免疫鼠血清中和抗體檢測

pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組血清特異性中和抗體平均效價(1∶512)顯著高于pRSC- gD- IL- 21+chitosan組(1∶181)(P<0.05)、pRSC+chitosan組(1∶1.83)(P<0.001)及chitosan組(1∶2.33)(P<0.001)，見圖5。此結(jié)果表明新疫苗可誘導(dǎo)更強的體液免疫應(yīng)答。

Lane 1.pRSC- gD.gC- IL- 21;

Lane 2.pRSC- gD.gC- IL- 21+DpnⅠ;

Lane 3.pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan;Lane 4.pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan+DpnⅠ

圖4 pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan顆粒DpnⅠ保護試驗

aP<0.05；bP<0.001

圖5 各組免疫鼠血清中和抗體效價水平

2.6 脾淋巴細(xì)胞特異性靶細(xì)胞殺傷以及NK細(xì)胞殺傷活性檢測

pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組小鼠的脾淋巴細(xì)胞特異性的細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)明顯增強(78.86±9.09)%，分別高于pRSC- gD- IL- 21+chitosan組[(65.94±5.01)%，P<0.001]及pRSC+chitosan組[(5.31±4.98)%，P<0.001]、chitosan組[(5.58±5.23)%，P<0.001]。同時NK細(xì)胞殺傷活性pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組亦顯著增強[(74.63±8.62)%]，分別高于pRSC- gD- IL- 21+chitosan組[(61.86±4.28)%，P<0.001]、pRSC+chitosan組[(4.78±6.02)%，P<0.001]及chitosan組[(5.16±5.26)%，P<0.001]。見圖6。此結(jié)果說明新疫苗可誘導(dǎo)更強的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答及非特異性的固有免疫應(yīng)答。

aP<0.001

圖6 各組免疫鼠脾淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞體外靶細(xì)胞殺傷活性

2.7 小鼠淚液中特異性sIgA水平比較

pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組淚液中sIgA含量顯著高于pRSC- gD- IL- 21+chitosan組(P<0.01)、pRSC+chitosan組(P<0.001)及chitosan組(P<0.001)，提示新疫苗相對于其它對照組疫苗可誘導(dǎo)眼表黏膜產(chǎn)生更高水平sIgA分泌。

aP<0.01；bP<0.001

圖7 各組免疫鼠淚液分泌性IgA水平

2.8 小鼠角膜病毒攻擊實驗結(jié)果

pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組與pRSC- gD- IL- 21+chitosan組相比，角膜病變程度明顯減輕，其病變持續(xù)時間(5 d)也短于pRSC- gD- IL- 21+chitosan組(9 d)，而pRSC+chitosan和chitosan組角膜病變程度較重，且病變持續(xù)時間較長，于第15天才基本消失。見圖8。以上結(jié)果表明，新疫苗對角膜抗HSV- 1感染的免疫保護作用優(yōu)于其它組。

aP<0.05；bP<0.01；cP<0.001

圖8 各組免疫鼠病毒攻擊后角膜病變積分動態(tài)變化

3 討 論

HSK為人類的一種常見病、多發(fā)病，HSV- 1感染角膜后易潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)，產(chǎn)生復(fù)發(fā)性的HSK?？共《舅幬镫m能使病情得到一定控制，但要達到根治及控制傳播的目的，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，并且長期使用會導(dǎo)致病毒耐藥株[3]，因此研制抗HSV疫苗是最有效途徑。而DNA疫苗有同時可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答及黏膜免疫應(yīng)答的優(yōu)勢，已成為目前研究的焦點?，F(xiàn)在，已經(jīng)有一些DNA疫苗在人類進行測試，如瘧疾、艾滋病疫苗，并取得了比較樂觀的結(jié)果，預(yù)示HSV DNA疫苗也有著光明前景。HSV- 1包膜糖蛋白是病毒顆粒表面的抗原決定簇，是HSV感染發(fā)病的關(guān)鍵[4]，其中g(shù)D是主要的免疫原[5]。而gC不僅可與補體C3b結(jié)合，阻止補體系統(tǒng)的激活[6]，而且還能介導(dǎo)病毒結(jié)合細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素。因而HSV可以通過gC干擾機體的免疫反應(yīng)，使病毒逃避宿主的攻擊，為病毒提供生存優(yōu)勢。這種免疫逃逸行為是造成現(xiàn)有疫苗效果不佳的主要原因之一。有研究者發(fā)現(xiàn)，HSV gC免疫所產(chǎn)生的抗體可以有效阻斷機體逃避免疫，但在小鼠體內(nèi)感染產(chǎn)生的gC抗體無明顯作用。有專家指出，當(dāng)前研究HSV疫苗的一個重要思路就是從gC逃逸區(qū)域方面進行研究，如果在活體內(nèi)就可以將免疫逃逸區(qū)域中斷，那么可有效降低病毒的致病力；此外，還有研究者認(rèn)為，在gD亞單位疫苗中加入gC可有效提高疫苗保護作用。我們已經(jīng)知道，在病毒穿膜進入靶細(xì)胞的過程中，gB、gD、gH/gL彼此之間的相互作用是關(guān)鍵，而gC可以通過屏蔽中和抗體來擾亂它們之間的相互作用。所以，無論在介導(dǎo)病毒感染、參與病毒的免疫逃逸還是在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中，HSV gC的作用都是至關(guān)重要的[7]。

通常裸DNA進行眼表黏膜接種，因為黏膜吸收率低，且眼有不斷的瞬目動作，所以免疫原性相對較差，因而選擇合適的基因載體非常重要。殼聚糖作為非病毒納米載體的一種，除了具有傳遞質(zhì)粒DNA進入機體、生物可降解性好、生物相容性高和低毒性、低成本等優(yōu)點外，還可以使質(zhì)粒DNA在體內(nèi)產(chǎn)生更高的抗體效價和免疫應(yīng)答，這些國內(nèi)外已有大量研究證實[8- 10]。鑒于上述種種良好的生物特性，殼聚糖已成為藥物載體的研究熱點和重點[11]。因此，本次實驗采用殼聚糖作為基因載體。從實驗結(jié)果可以看出，殼聚糖/DNA質(zhì)粒包裹率高達97%，并且能抵抗DpnⅠ的消化作用。

本次實驗在原有DNA疫苗pRSC- gD- IL- 21的基礎(chǔ)上，將與HSV- 1病毒免疫逃避分子相關(guān)的gC與HSV- 1的主要免疫原gD進行基因融合[采用柔性肽(GGGS)3連接[12]]，插入到質(zhì)粒pRSC中，保留原有免疫佐劑IL- 21，構(gòu)建了新的疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21，經(jīng)酶切、測序以及Western blot目的蛋白表達鑒定，證明新疫苗構(gòu)建成功。在小鼠動物模型實驗中，本研究結(jié)果表明，DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan接種組與pRSC- gD- IL- 21+chitosan組、pRSC+chitosan及chitosan組相比，在細(xì)胞免疫、體液免疫、局部黏膜免疫應(yīng)答上，都有明顯優(yōu)勢。首先，在細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，我們檢測了體外脾淋巴細(xì)胞特異性靶細(xì)胞殺傷以及NK細(xì)胞殺傷活性，pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組明顯高于其它組，它們之間存在統(tǒng)計學(xué)差異。其次，在體液免疫方面，我們檢測了血清中和抗體，pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組血清特異性中和抗體分泌水平亦顯著高于其它組。再有，pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組淚液中sIgA含量與其它組相比亦有顯著差異，提示新疫苗可誘導(dǎo)更強的眼表黏膜免疫。更主要的是，pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan組抵抗HSV- 1眼部感染的效應(yīng)大大強于其它各組，該組小鼠發(fā)生HSK的嚴(yán)重程度明顯減輕，持續(xù)時間也明顯縮短。DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan的研制成功為復(fù)發(fā)性HSK防治的動物實驗打下了堅實的基礎(chǔ)。

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Construction of DNA vaccine pRSC- gD.gC- IL- 21 and preliminary research on its immunoprotection against HSK in mice model

DONG Li- li1，2，HU Kai1，3，TANG Ming- xia1

(1.DepartmentofOphthalmology，MedicineCollegeofSoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.DepartmentofOphthalmology，TaizhouPeople’sHospital，Taizhou225300，China； 3.DepartmentofOphthalmology，NanjingDrumTowerHospital，MedicalCollegeofNanjingUniversity,Nanjing210008,China)

Objective： To construct DNA vaccine pRSC- gD.gC- IL- 21 and to investigate its ability to induce immune response and resist the herpes simplex virus type 1(HSV- 1)infection of cornea in mice. Methods: HSV- 1 genomic DNA was extracted and the gene of gC was amplified by PCR. As a template with pRSC- gD- IL- 21 plasmid(in 2011， our laboratory has been building successful)， DNA vaccine pRSC- gD.gC- IL- 21 was constructed. After being identifed by molecular methods， we packaged them with nanometer materials chitosan. With the method of mucosal immunization， the vaccine pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan， the pRSC- gD- IL- 21+chitosan， the blank pRSC+chitosan and the chitosan were respectively inoculated into BALB/c mice for 3 times with 2 weeks interval. A number of immunological indexes were detected 2 weeks after the last immunization. At the same time， the immunoprotective against HSV- 1 challenging on cornea in mice was also evaluated. Results: By DNA sequencing， the restricted endonuclease analysis， and Western blot expression， the construction of DNA vaccine pRSC- gD.gC- IL- 21 was proved to be constructed successful， and chitosan package rate was high. Compared with the control mice， the DNA vaccine induced the mice to generate higher levels of antibody， enhanced the splenic cell proliferation response as well as the activities of cytotoxic T lymphocyte(CTL)cell and natural killer(NK)cell， and increased the specificity sIgA levels in tears. Meanwhile， the pRSC- gD.gC- IL- 21+chitosan could elicit a stronger immunoprotective effect against the corneal infection of HSV- 1 in mice. Conclusion: The construction of DNA vaccine pRSC- gD.gC- IL- 21 is successful. The DNA vaccine pRSC- gD.gC- IL- 21 may induce an effective immune response in immunized mice. More importantly， the efficacy against the HSV- 1 challenge in mouse cornea is enhanced markedly. It can prevent the occurrence and development of the herpes simplex keratitis(HSK)．

herpes simplex virus type 1; DNA vaccine; glycoprotein C; chitosan; herpes simplex keratitis; mice

2016- 06- 05

2016- 08- 24

董莉莉(1978-)，女，江蘇泰州人，副主任醫(yī)師，在讀碩士研究生。E- mail:13615190290@163.com

胡凱 E- mail:hukai70@163.com

董莉莉，胡凱，湯明霞.DNA疫苗pRSC- gD.gC- IL- 21的構(gòu)建及其預(yù)防HSK的動物實驗初步研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：932- 938.

R392.11

A

1671- 6264(2016)06- 0932- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.021