肝微粒體孵育體系中大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物的檢測(cè)方法研究

李恩澤，袁媛，邵華

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，江蘇 南京 210009； 2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院 藥物代謝動(dòng)力學(xué)教研室，江蘇 蘇州 215123； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 藥劑科，江蘇 南京 210009)

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·論 著·

肝微粒體孵育體系中大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物的檢測(cè)方法研究

李恩澤1，袁媛2，邵華3

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，江蘇 南京 210009； 2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院 藥物代謝動(dòng)力學(xué)教研室，江蘇 蘇州 215123； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 藥劑科，江蘇 南京 210009)

目的:優(yōu)化和建立大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物檢測(cè)方法，并應(yīng)用于大黃酸肝微粒體代謝活化研究。方法：肝微粒體孵育樣品以含3%甲酸的甲醇酸化并沉淀蛋白后，用API 4000LC- MS/MS對(duì)大黃酸和其活性代謝物大黃酸乙酰葡糖醛酸進(jìn)行定性、定量分析。使用Agela Venusil XBP C18column(50×2.1 mm，3 μm)色譜柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水- 乙腈梯度洗脫。ESI離子源在負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)定，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，用于定量分析的離子對(duì)為m/z 283.0→239.5(大黃酸)和459.0→283.0(大黃酸葡糖醛酸)。結(jié)果：大黃酸乙酰葡糖醛酸在PBS、甲醇中都不穩(wěn)定，以含3%甲酸的甲醇處理后，大黃酸乙酰葡糖醛酸在樣品溶液中穩(wěn)定性良好。大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸的線性范圍分別為100～25 000 nmol·L-1和10～5 000 nmol·L-1，日內(nèi)和日間RSD均<10.7%，準(zhǔn)確度在95.8%～112%之間。最適宜孵育時(shí)間優(yōu)化為40 min。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所建立的肝微粒體體系中大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物大黃酸乙酰葡糖醛酸的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、可行，為進(jìn)一步研究大黃酸的代謝活化提供了基礎(chǔ)。

大黃酸； 大黃酸乙酰葡糖醛酸； 代謝活化； 高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用

大黃酸是中藥大黃的主成分之一，而大黃是我國(guó)四大最常用中藥之一，被廣泛運(yùn)用于多種疾病治療[1]。大黃酸同時(shí)也廣泛地分布在其它中草藥中，比如何首烏、番瀉葉、虎杖等。大黃酸也是口服雙醋瑞因的主要入血成分，雙醋瑞因是歐洲批準(zhǔn)上市被用于治療骨關(guān)節(jié)炎的常用藥物[2]。大黃酸具有多種藥理活性，包括抗菌、保肝、抗腫瘤、防治糖尿病等[3- 5]。

葡糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是人體內(nèi)最為重要、也最為普遍的肝臟生物轉(zhuǎn)化。對(duì)于含有羧基的有機(jī)酸藥物而言，與葡糖醛酸結(jié)合生成乙酰葡糖醛酸也是其消除的主要途徑。但是，近年來(lái)的體內(nèi)、體外研究表明乙酰葡糖醛酸具有反應(yīng)活性，可以通過(guò)與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合而引起不良反應(yīng)[6]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大黃酸在肝臟中會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的二相代謝反應(yīng)，主要代謝途徑為葡糖醛酸化[7]。大黃酸的葡糖醛酸化會(huì)生成3種葡糖醛酸代謝產(chǎn)物，兩個(gè)為大黃酸的羥基葡糖醛酸，一個(gè)為大黃酸乙酰葡糖醛酸，該大黃酸乙酰葡糖醛酸也有一定反應(yīng)活性[8]。由于大黃酸乙酰葡糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得，并且因其反應(yīng)活性并不穩(wěn)定，建立大黃酸代謝活化研究的檢測(cè)方法較為困難。目前尚無(wú)大黃酸乙酰葡糖醛酸的定性與定量研究方法報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬優(yōu)化并建立大黃酸及其乙酰葡糖醛酸代謝物檢測(cè)方法，并應(yīng)用于大黃酸體外肝臟代謝活化研究，為大黃酸的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

島津20A高效液相色譜儀，包括DGU- 20A在線脫氣機(jī)、LC- 20AD雙泵、SIL- 20A自動(dòng)進(jìn)樣器和CBM- 20A控制器。API 4000型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)ABI公司)，配備電噴霧離子化源(ESI)。

大黃酸、大黃酸乙酰葡糖醛酸、金絲桃苷(純度>97.0%)購(gòu)于成都普瑞科技有限公司，乙腈、甲酸(色譜純)購(gòu)于美國(guó)默克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜檢測(cè)方法

色譜柱：AgelaVenusil XBP C18柱，(50×2.1 mm，3 μm)，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)- 乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.5 min，10% B;0.5～1.5 min，10%～30% B;1.5～6.0 min，30%～70% B;6.0～7.0 min 70%～100% B;7.0～8.0 min 100%～10% B;8～10 min，10% B);流速:0.3 ml·min-1;進(jìn)樣量:5 μl。質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(MRM)進(jìn)行定量分析。電噴霧電壓(IS):4 500 V;離子源溫度(TEM):450 ℃;輔助氣1(GS1):55，輔助氣2(GS2):55;氣簾氣壓力(CUR):30；大黃酸、大黃酸乙酰葡糖醛酸和金絲桃苷的定量分析離子對(duì)分別為m/z 283.0→239.5，459.0→283.0和463.1→300.0。

1.2.2 方法專(zhuān)屬性考察

在高溫滅活微粒體配置的溫孵體系中同時(shí)加入大黃酸、大黃酸乙酰葡糖醛酸、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品，用3倍體積含有3%甲酸的甲醇沉淀蛋白后離心取上清后進(jìn)樣?？疾煲合嗌V- 串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC- MS/MS)法是否能夠分別將3種藥物從樣品中檢測(cè)到，以及在該方法下能否將3種藥物完全分離。

1.2.3 線性關(guān)系考察

在高溫滅活微粒體配置的溫孵體系中，稀釋系列濃度大黃酸(100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 nmol·L-1)以及大黃酸乙酰葡糖醛酸(10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 nmol·L-1)樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液后，用3倍體積含有3%甲酸的甲醇沉淀蛋白并離心取上清后進(jìn)樣。以化合物理論濃度為橫坐標(biāo)，化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(Weight=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度與準(zhǔn)確度考察

在高溫滅活微粒體配置的溫孵體系中，分別稀釋高、中、低3個(gè)濃度大黃酸樣品溶液(500、5 000、10 000 nmol·L-1)和大黃酸乙酰葡糖醛酸樣品溶液(50、500、1 000 nmol·L-1)，每個(gè)濃度樣品3份。加入內(nèi)標(biāo)溶液后，用3倍體積含有3%甲酸的甲醇沉淀蛋白并離心取上清，于同日內(nèi)和連續(xù)3天分別測(cè)定。記錄色譜圖，計(jì)算藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。

用已知含大黃酸(200 nmol·L-1)或大黃酸乙酰葡糖醛酸(20 nmol·L-1)的樣品溶液作為基質(zhì)溶液，加入大黃酸(終濃度500、5 000、10 000 nmol·L-1)和大黃酸乙酰葡糖醛酸儲(chǔ)備液(終濃度50、500、1 000 nmol·L-1)制成樣品溶液，分別測(cè)定基質(zhì)溶液和所配樣品溶液中大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸的量，以測(cè)得樣品溶液和基質(zhì)溶液的差值與加入量的百分比計(jì)算精密度。

1.2.5 大鼠肝微粒體溫孵體系反應(yīng)條件優(yōu)化

1.2.5.1 溫孵反應(yīng)條件 分別取凍存大鼠肝微粒體(RLM)、人肝微粒體(HLM)融化后，以新鮮配制的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(含5 mmol·L-1MgCl2，20 μg·ml-1丙甲菌素，5 mmol·L-1D- 葡萄糖二酸- 1，4- 內(nèi)酯)稀釋?zhuān)⒓尤氲孜锎簏S酸，置37 ℃恒溫水浴預(yù)孵育10 min后加入2 mmol·L-1尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)啟動(dòng)反應(yīng)。

1.2.5.2 溫孵反應(yīng)后樣品處理 分別配置含大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸的溫孵樣品，停止反應(yīng)，加入內(nèi)標(biāo)溶液后分別向樣品種加入3倍體積的PBS、甲醇、含3%甲酸甲醇，離心去除蛋白取上清后在室溫下放置。分別在0、5、8、10、24、48 h后測(cè)定其中大黃酸以及大黃酸乙酰葡糖醛酸含量，選取合適樣品處理方法。

1.2.5.3 溫孵時(shí)間考察 取“1.2.5.1”項(xiàng)中RLM和HLM的溫孵體系，固定蛋白濃度分別為1.6 mg·ml-1(RLM)和1.0 mg·ml-1(HLM)，加入U(xiǎn)DPGA后開(kāi)始計(jì)時(shí)，于0 min、5 min、20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、8 h后終止反應(yīng)，加入內(nèi)標(biāo)溶液后用3倍體積含有3%甲酸的甲醇沉淀蛋白并離心取上清進(jìn)行測(cè)定。以大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸對(duì)時(shí)間做非線性回歸曲線，即得孵育時(shí)間對(duì)大黃酸代謝的影響。

2 結(jié) 果

2.1 方法專(zhuān)屬性

在以上的實(shí)驗(yàn)條件下，溫孵樣品的內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾樣品的檢測(cè)。如圖1所示，大黃酸(rhein)的保留時(shí)間為5.6 min左右，大黃酸乙酰葡糖醛酸(RAG)的保留時(shí)間為4.3 min左右，內(nèi)標(biāo)金絲桃苷(IS)的保留時(shí)間為3.3 min左右，三者完全達(dá)到了基線分離，證實(shí)該液相方法對(duì)于檢測(cè)大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸專(zhuān)屬性良好。

Rhein：大黃酸；RAG：大黃酸乙酰葡糖醛酸；IS：內(nèi)標(biāo)金絲桃苷

圖1 大黃酸和大黃酸葡糖醛酸的LC- MS/MS色譜圖

2.2 線性范圍

大黃酸(100～25 000 nmol·L-1)和大黃酸乙酰葡糖醛酸(10～5 000 nmol·L-1)在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，兩者的回歸方程如下：大黃酸：Y=0.049 7X-0.000 659，(r=0.998 5)；大黃酸乙酰葡糖醛酸：Y=0.000 195X-0.000 523，(r=0.998 4)。本實(shí)驗(yàn)所建立的LC- MS/MS法可以對(duì)大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物大黃酸乙酰葡糖醛酸進(jìn)行有效分離及定量測(cè)定。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

在所建立的LC- MS/MS檢測(cè)條件下，大黃酸與大黃酸乙酰葡糖醛酸的精密度和準(zhǔn)確度，如表1所示。其中內(nèi)日、日間的精密度都小于10.73%，加樣回收的準(zhǔn)確度在95.8%～112.0%之間，結(jié)果顯示所建立方法具有良好的精密度與準(zhǔn)確度。

表1 大黃酸與大黃酸乙酰葡糖醛酸檢測(cè)的精密度與準(zhǔn)確度

物質(zhì)濃度/nmol·L-1精密度(RSD)/%日間日內(nèi)準(zhǔn)確度/%大黃酸5001.279.29112.050004.0110.73110.2100003.846.71110.5大黃酸乙酰葡糖醛酸504.982.8795.85005.152.89101.110002.473.04106.1

2.4 溫孵樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸在溫孵的樣品溶液中用不同的溶劑處理后，其穩(wěn)定性差異較大。如圖2所示，大黃酸在經(jīng)PBS溶液、甲醇溶液以及含3%甲酸的甲醇溶液處理后，穩(wěn)定性都較好，含量在48 h之內(nèi)保持穩(wěn)定。但是大黃酸乙酰葡糖醛酸在甲醇以及PBS溶液處理的樣品中穩(wěn)定性較差，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)含量迅速下降。但在含3%甲酸的甲醇溶液處理的樣品中，大黃酸乙酰葡糖醛酸含量穩(wěn)定，48 h后仍有95%以上保留在樣品中。結(jié)果顯示，大黃酸的肝微粒體代謝反應(yīng)樣品應(yīng)該用3%甲酸的甲醇溶液處理，保證活化代謝物的穩(wěn)定性。

圖2 大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸在PBS、甲醇和含3%甲酸的甲醇溶液中的穩(wěn)定性

2.5 溫孵時(shí)間優(yōu)化

大黃酸在大鼠及人肝微粒體代謝體系中孵育不同時(shí)間后，其原型藥物大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物乙酰葡糖醛酸的含量隨時(shí)間變化如圖3所示。在0～40 min內(nèi)大黃酸原藥的減少以及乙酰葡糖醛酸的增加都呈線性關(guān)系，40 min后反應(yīng)速度增加變慢。結(jié)果顯示40 min內(nèi)的大黃酸代謝反應(yīng)呈線性，可選擇40 min作為孵育時(shí)間。

A.人肝微粒體孵育體系(HLM)； B.大鼠肝微粒體孵育體系(RLM)

圖3 不同孵育時(shí)間后大黃酸和大黃酸乙酰葡糖醛酸的含量變化

2.6 大黃酸在人以及大鼠肝微粒體中的代謝

將大黃酸分別與大鼠與人肝微粒孵育40 min后，除大黃酸乙酰葡糖醛酸外，還生成兩個(gè)m/z 459.0→283.0的代謝產(chǎn)物，如圖4所示，提示這兩個(gè)代謝產(chǎn)物為大黃酸的羥基葡糖醛酸代謝產(chǎn)物。并且在人和大鼠肝微粒體中，產(chǎn)生活化代謝產(chǎn)物乙酰葡糖醛酸的比例存在明顯的種屬差異。在人肝微粒體中，大黃酸主要代謝路徑為活化代謝產(chǎn)物乙酰葡糖醛酸，而在大鼠肝微粒體中，大黃酸主要被代謝成沒(méi)有反應(yīng)活性的羥基葡糖醛酸代謝產(chǎn)物。

3 討 論

有機(jī)酸類(lèi)藥物可以經(jīng)過(guò)葡糖醛酸化轉(zhuǎn)化為乙酰葡糖醛酸代謝產(chǎn)物，許多有機(jī)酸藥物的乙酰葡糖醛酸代謝產(chǎn)物具有反應(yīng)活性[9]。乙酰葡糖醛酸可以進(jìn)一步發(fā)生分子內(nèi)遷移、糖醛酸開(kāi)環(huán)、烷基化等反應(yīng)，因此乙酰葡糖醛酸的反應(yīng)活性。經(jīng)過(guò)對(duì)樣品處理方法的優(yōu)化，大黃酸乙酰葡糖醛酸在含3%甲酸的甲醇溶液處理過(guò)的樣品溶液中穩(wěn)定性良好，可以用來(lái)進(jìn)行代謝活化研究。

A.大黃酸與人肝微粒體孵育40 min樣品溶液； B.大黃酸與大鼠肝微粒體孵育40 min樣品溶液

圖4 大黃酸和大黃酸葡糖醛酸的LC- MS/MS色譜圖

大黃酸被證實(shí)在人肝微粒體中有較強(qiáng)的代謝活化，會(huì)生成大黃酸乙酰葡糖醛酸。臨床上許多有機(jī)酸類(lèi)藥物的不良反應(yīng)與其代謝活化相關(guān)，例如因不良反應(yīng)被退市的阿氯芬酸、芐達(dá)酸、苯惡洛芬、芬氯酸[11]等。乙酰葡糖醛酸醛酸引起不良反應(yīng)的機(jī)制是因其反應(yīng)活性，與人體內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，破壞生物大分子的功能等。臨床上有關(guān)于服用富含大黃酸的大黃、何首烏引起肝毒性的報(bào)道[12- 13]，這可能與大黃酸的代謝活化相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提供了檢測(cè)大黃酸代謝活化的方法，為今后研究大黃酸的代謝活化與臨床不良反應(yīng)的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。

在溫孵樣品的檢測(cè)中，除了大黃酸乙酰葡糖醛酸外，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到兩個(gè)與大黃酸乙酰葡糖醛酸同樣離子對(duì)的代謝產(chǎn)物。兩者的質(zhì)譜圖與大黃酸乙酰葡糖醛酸一致，這兩個(gè)代謝產(chǎn)物為兩個(gè)大黃酸的羥基葡糖醛酸(RG1，RG2)。其中RG1與內(nèi)標(biāo)并未完全分離，但是由于質(zhì)譜的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)，RG1和IS的監(jiān)測(cè)離子對(duì)并不相同，因此兩者不會(huì)影響各自的檢測(cè)。

本研究結(jié)果顯示，大黃酸的葡糖醛酸化代謝途徑在大鼠和人肝微粒體中表現(xiàn)出明顯的種屬差異。在大鼠的肝微粒中主要代謝為兩個(gè)沒(méi)有反應(yīng)活性羥基葡糖醛酸代謝產(chǎn)物，而在人肝微粒體中主要代謝為有反應(yīng)活性的乙酰葡糖醛酸代謝產(chǎn)物，即代謝活化路徑。結(jié)果提示在人體中大黃酸的代謝活化較大鼠更為嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證了肝微粒體體系中大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物大黃酸乙酰葡糖醛酸的檢測(cè)方法，并揭示了大黃酸在人肝微粒中有較強(qiáng)的代謝活化。

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Study of the analytical method of rhein and its activated metabolites in liver microsome incubations

LI En- ze1，YUAN Yuan2，SHAO Hua3

(1.DepartmentofPharmacology，MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofPharmacokinetics，CollegeofPharmaceuticalSciences，SoochowUniversity，Suzhou215123，China;3.DepartmentofPharmacy，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To optimize and establish an analytical method for determination of rhein and its activated metabolite， and further apply in the study of metabolic activation of rhein in liver microsomes. Methods: Incubation samples of liver microsomes was deproteinized by addition of methanol containing 3% formic acid. API 4000 LC- MS/MS was used to qualitatively and quantitatively determine rhein and rhein acyl glucuronide. Samples were analyzed on an Agela Venusil XBP C18column(50×2.1 mm， 3 μm)adopting a gradient elution. MRM mode in negative ionization was chosen and ion transitions were monitored as rhein， 283.0→239.5; rhein glucuronides， 459.0→283.0. Results: Rhein acyl glucuronide was not stable in PBS and methanol， but it was stable in the sample solution processed by methanol containing 3% formic acid. A good linearity of rhein and rhein acyl glucuronide was obtained in the range of 100-25 000 nmol·L-1and 10-5 000 nmol·L-1， respectively. Intra- and inter- day variations were <10.7% and great accuracies of95.8%-112% were achieved at the concentrations examined. The incubation time was optimized as 40 min. Conclusion: The established method is stable and applicable， and can be used for the determination of rhein and rhein acyl glucuronidations in human liver microsomes(HLM)and rat liver microsomes(RLM). Our study also provides experimental foundation for the further investigation of metabolic activation of rhein．

rhein; rhein acyl glucuronidations; metabolic activation; liquid chromathgraphy tandem mass spectrometry

2016- 05- 03

2016- 08- 04

李恩澤(1991-)，女，陜西咸陽(yáng)人，在讀碩士研究生。E- mail:lienze0413@126.com

邵華 E- mail:gycsh@163.com

李恩澤，袁媛，邵華.肝微粒體孵育體系中大黃酸及其代謝活化產(chǎn)物的檢測(cè)方法研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：894- 899.

R969

A

1671- 6264(2016)06- 0894- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．013