SynGAP(1- 700aa)中670- 685aa缺失突變質(zhì)粒的構(gòu)建及表達

張清秀，魏秀娥，高紅，榮良群

(徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 221006)

?

·論 著·

SynGAP(1- 700aa)中670- 685aa缺失突變質(zhì)粒的構(gòu)建及表達

張清秀，魏秀娥，高紅，榮良群

(徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 221006)

目的:缺失突變SynGAP(1- 700aa)- Flag中的670- 685aa片段，為后續(xù)實驗中新的藥物靶點的鑒定提供可靠理論依據(jù)。方法:以前期構(gòu)建好的pCMV- SynGAP(1- 700aa)- Flag 質(zhì)粒為模板，重疊延伸PCR技術(shù)缺失突變670- 685aa片段，擴增出目的片段；限制性內(nèi)切酶將載體線性化，然后分別純化目的片段與線性化載體；利用同源重組技術(shù)連接目的片段與線性化載體，獲取重組質(zhì)粒；PCR技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，測序進一步驗證質(zhì)粒堿基正確；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞，免疫印跡鑒定能否成功表達。結(jié)果:重疊PCR成功缺失突變670- 685aa片段，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，且測序正確。免疫印跡結(jié)果表明，SynGAP(1- 700aa)缺失突變670- 685aa片段后仍可成功表達。結(jié)論:成功缺失突變SynGAP(1- 700aa)中的670- 685aa片段，并且在細胞株中穩(wěn)定表達。該質(zhì)粒的成功構(gòu)建，為我們的后續(xù)研究奠定實驗基礎。

SynGAP； 重疊延伸聚合酶鏈式反應； 缺失突變

突觸GTP酶活化蛋白(SynGAP)是神經(jīng)元Ras GTP酶活化蛋白(RasGAP)，在大腦內(nèi)選擇性表達，在興奮性突觸中高度表達，受CaMKⅡ磷酸化調(diào)控，自身負調(diào)控Ras的活性及其下游的信號通路。SynGAP不僅在神經(jīng)元發(fā)育及突觸可塑性中具有重要作用，在缺血性腦損傷中也發(fā)揮調(diào)控作用。Rong 等[1]發(fā)現(xiàn)腦缺血后SynGAP表達受抑制。Song等[2]發(fā)現(xiàn)腦缺血后SynGAP絲氨酸磷酸化水平顯著增加，導致MAPK信號通路的激活，保護腦缺血神經(jīng)元損傷。SynGAP可通過與PSD- 95、NMDAR受體形成復合物，調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號通路、突觸可塑性以及學習記憶[3]。我們前期實驗已經(jīng)證實PSD- 93可以與SynGAP結(jié)合，且結(jié)合位點位于SynGAP的670- 685aa片段，因此我們擬構(gòu)建SynGAP的突變體，期望為后續(xù)研究及臨床應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

質(zhì)粒抽提試劑盒(Promega，A1460)；In- FusionTMPCR Cloning Kit(美國clontech，639626)；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、KpnⅠ(New England Biolabs，R0136V)；Taqpolymerase(SinoBio，E001- 02B)；dNTPs(Takara，D4030A)；5kb DNA ladder Marker[富酶泰斯生物技術(shù)(深圳)有限公司，SM0311]；瓊脂糖(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，GA4- 100)；Primer(上海捷瑞生物工程有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，10- 013- CV)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物技術(shù)有限公司)；10×PEI(Sigma- Aldrich，40，872- 7)；FLAG antibody(Sigma- Aldrich，#F1804)[4]；Goat- anti- mouse IgG(H+L)- HRP(南京巴傲得生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司，ABI2720)，positive clone測序儀(美季生物技術(shù)公司，ABI3730)，凝膠成像儀(廣州譽維生物科技儀器有限公司，Tanon 1600R)，細菌搖床(太倉華利達實驗設備有限公司，HI- 9211K)，細菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司，LRH- 500F)，高速離心機[日立(中國)有限公司，TGL- 16G- A]，電泳儀(美國Bio- Rad)，電轉(zhuǎn)儀(美國Bio- Rad)。

1.3 工具載體

GV143(4.8kb)，pCMV- SynGAP(1- 700aa)- Flag質(zhì)粒，293T細胞。

1.4 載體酶切

在總體積為10μl酶切體系中，工具載體GV143(4.8kb) 1μl，XhoⅠ和KpnⅠ各0.5μl，10×buffer 1μl， 100×BSA 0.5μl，不足ddH2O補足，37℃雙酶切2h獲得線性化載體。然后膠回收試劑盒純化線性化載體。

1.5 重疊PCR獲取缺失突變質(zhì)粒

以構(gòu)建好的SynGAP(1- 700aa)質(zhì)粒為模板，引物P1:5′- TACCGGACTCAGATCTCGAGATGAGCAGGTCTCGAGCCTCCATC- 3′，P2:5′- GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCAGCACCTCCCAGAGTAGGGCATGCAGTGTGGAGAG- 3′，P3:5′- GTAGGGCATGCAGTGTGGAGAGCTCTCGGCCATTGGAGATCTCATACAAAAACTGC- 3′，其中P1、P2分別為目的基因片段的上下游引物，P3為中間缺失基因序列的上下游堿基構(gòu)成，按照Promega試劑盒說明書，通過重疊PCR缺失突變670- 685aa序列。首先以P1和P3引物缺失670- 685aa序列，獲得2058bp片段a，然后以P1和P3為引物，序列a為模板，獲取2094bp 片段b，那么序列b則為最終的目的片段，瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定其擴增大小與目的基因片段大小相近。膠回收試劑盒純化目的片段，然后與載體相連，PCR驗證，測序。

1.6 重組質(zhì)粒構(gòu)建

將純化好的線性化載體GV143以及目的基因片段以一定比例加入到10μl反應體系中，10×buffer 1μl，DNA連接酶1μl，DNA∶pCMV- C- Flag=9∶1，16℃，4h，瓊脂糖凝膠初步鑒定重組質(zhì)粒大小[5]。

1.7 PCR鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功

以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒為模板，根據(jù)目的片段序列設計上下游引物P1:5′- GTGCCCTGTTGAAGGACC- 3′，P2:5′- CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG- 3′，通過PCR鑒定目的片段與載體是否成功連接。然后抽提質(zhì)粒，測序。

1.8 免疫印跡檢測重組質(zhì)粒表達情況

PEI轉(zhuǎn)染法將純化好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞。根據(jù)前期實驗條件，分別用無血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒與10×PEI。2 μg質(zhì)粒與2μl PEI混勻后，靜置15 min，期間將細胞全培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)液，然后將質(zhì)粒加入細胞培養(yǎng)液中，2～3h換為正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集細胞，超聲破碎細胞，BCA法測蛋白，SDS- PAGE凝膠電泳檢測融合蛋白表達情況。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因片段的獲取

前期實驗已經(jīng)構(gòu)建SynGAP(1- 700aa)片段質(zhì)粒，免疫印跡證明其可在細胞內(nèi)過表達。實驗需要將SynGAP(1- 700aa)質(zhì)粒的(670- 685aa)氨基酸缺失掉，因此，我們采用缺失突變重疊PCR技術(shù)獲得最終目的基因。結(jié)果見圖1。

1.缺失掉670- 685aa片段的SynGAP(1- 700aa)線性化DNA片段； 2.5kb DNA Marker

圖1 重疊延伸PCR技術(shù)獲取目的基因
Fig 1 Obtain targeted gene by overlap extension PCR technology

2.2 載體酶切

工具載體GV143(4.8kb)經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，37℃酶切2h獲得線性化載體。酶切結(jié)果見圖2。

2.3 PCR驗證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功

將PCR獲得的目的基因以及酶切獲得的線性化載體回收純化(膠回收試劑盒)，PCR產(chǎn)物交換入線性化表達載體，然后PCR鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。鑒定結(jié)果見圖3。

2.4 重組質(zhì)粒表達檢測

將構(gòu)建好的質(zhì)粒PEI法轉(zhuǎn)入293T細胞，轉(zhuǎn)染24 h，觀察轉(zhuǎn)染率，并收集細胞，檢測目的蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率大于80%(圖4A)，與對照組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的人胚腎293T細胞)相比，目的蛋白在細胞內(nèi)表達量顯著增加，表明目的基因構(gòu)建成功(圖4B)。

1.10kb Marker； 2.載體酶切產(chǎn)物；3.未酶切載體

圖2 載體及載體線性化酶切結(jié)果
Fig 2 GV143 vector and its linearized vector digested by endonuclease

1.陰性對照(ddH2O)；2.陰性對照(空載自連對照組)；3.陽性對照(GAPDH)；4.Marker，自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；5～7.SynGAP1 1～3號轉(zhuǎn)化子

圖3 PCR鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功
Fig 3 Identify the recombinant plasmid was successfully constructed using PCR

3 討 論

神經(jīng)元特異性RasGTP酶活化蛋白SynGAP，在哺乳動物前腦的突觸后致密部高度表達。SynGAP是一個復雜的基因，具有多個結(jié)構(gòu)域。其可通過剪切形成不同的異構(gòu)體，SynGAP mRNA的可變剪切形成C- 末端的多種異構(gòu)體，包括α、β、γ。SynGAP的N- 末端具有ras- GAP結(jié)構(gòu)域，而其C2結(jié)構(gòu)域則主要與Ca2+以及脂筏結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，SynGAP C- 末端的QTRV是與PSD- 95/SAP90的第3個PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合必需的，并使其串集于NMDAR形成多蛋白復合物，參與腦損傷[6]。

圖4 免疫印跡檢測質(zhì)粒表達情況 ×200

Fig 4 Western blotting isused to detect the plasmid expression ×200

SynGAP作為信號通路中的關(guān)鍵蛋白之一，其上游受NMDAR及CAMKⅡ、CDK5調(diào)控，下游負調(diào)控小G蛋白，如ras、rap等，同時也負調(diào)控AMPA受體向興奮性突觸后膜運輸[7]，參與調(diào)控各種病理生理機制，在腦缺血、智力低下、兒童自閉癥、突觸可塑性中都發(fā)揮重要作用。SynGAP1基因突變可導致一些疾病，典型的就是兒童智力低下和兒童自閉癥。研究發(fā)現(xiàn)，SynGAP1從頭截短突變導致非綜合征性智力障礙(NSID)[8]。SynGAP1- /+雜合子具有與精神分裂癥類似的行為表征。Guo等[9]發(fā)現(xiàn)，SynGAP1的表達減少將會導致異常的行為。前期研究顯示，SynGAP在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及突觸可塑性中具有重要作用。SynGAP1與NMDAR受體及PSD95結(jié)合，調(diào)節(jié)骨架蛋白Actin及AMPAR受體上膜，進而影響突觸可塑性以及長時程增強效應(LTP)[10]。synGAP與 PSD- 95相互作用決定樹突棘的生成及成熟樹突棘大小[11- 12]。此外，SynGAP- /- 導致小鼠出生后1周內(nèi)死亡[13]。Knuesel等[14]發(fā)現(xiàn)SYNGAP1蛋白減少會促進凋亡，這與我們的前期研究結(jié)果一致。腦缺血后synGAP與 PSD- 93結(jié)合，激活下游的Ras信號通路，介導細胞凋亡。

SynGAP突變會導致一系列神經(jīng)疾病，作為信號網(wǎng)絡中的關(guān)鍵成員之一，研究其結(jié)構(gòu)及功能具有重要作用。因此，我們在前期研究基礎上，成功構(gòu)建了SynGAP突變體，為后續(xù)研究提供新的靶向。

[1] RONG R，YANG H，RONG L，et al.Proteomic analysis of PSD- 93 knockout mice following the induction of ischemic cerebral injury[J].Neurotoxicology，2016，53：1- 11．

[2] SONG B，MENG F，YAN X，et al.Cerebral ischemia immediately increases serine phosphorylation of the synaptic RAS- GTPase activating protein SynGAP by calcium/calmodulin- dependent protein kinase II alpha in hippocampus of rats[J].Neurosci Lett，2003，349(3):183- 186．

[3] KOMIYAMA N H，WATABE A M，CARLISLE H J，et al.SynGAP regulates ERK/MAPK signaling，synaptic plasticity，and learning in the complex with postsynaptic density 95 and NMDA receptor[J].J Neurosci，2002，22(22):9721- 9732．

[4] 齊斌，任威，李春江,等.NLRP3基因真核表達載體的構(gòu)建和定位[J].現(xiàn)代醫(yī)學，2014,42(4):363- 366．

[5] 沈濤，楊禮慶，李妍，等.hPlk2基因真核表達載體的構(gòu)建及蛋白的表達和定位[J].東南大學學報:醫(yī)學版，2012,31(2):162- 165．

[6] RUMBAUGH G，ADAMS J P，KIM J H，et al.SynGAP regulates synaptic strength and mitogen- activated protein kinases in cultured neurons[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(12):4344- 4351．

[7] WALKUP W G T，WASHBURN L，SWEREDOSKI M J，et al.Phosphorylation of synaptic GTPase- activating protein(synGAP) by Ca2+/calmodulin- dependent protein kinase Ⅱ(CaMKII) and cyclin- dependent kinase 5(CDK5) alters the ratio of its GAP activity toward Ras and Rap GTPases[J].J Biol Chem，2015，290(8):4908- 4927．

[8] PARKER M J，F(xiàn)RYER A E，SHEARS D J，et al.De novo，heterozygous，loss- of- function mutations in SYNGAP1 cause a syndromic form of intellectual disability[J].Am J Med Genet A，2015，167A(10):2231- 2237．

[9] GUO X，HAMILTON P J，REISH N J，et al.Reduced expression of the NMDA receptor- interacting protein SynGAP causes behavioral abnormalities that model symptoms of Schizophrenia[J].Neuropsychopharmacology，2009，34(7):1659- 1672．

[10] HUANG K.SYNGAP:bridging the gap between genetic factors and autosomal non- syndromic mental retardation[J].Clin Genet，2009，76(2):149- 151．

[11] VAZQUEZ L E，CHEN H J，SOKOLOVA I，et al.SynGAP regulates spine formation[J].J Neurosci，2004，24(40):8862- 8872．

[12] JEYABALAN N，CLEMENT J P.SYNGAP1:Mind the Gap[J].Front Cell Neurosci，2016，10：32．

[13] MUHIA M，F(xiàn)ELDON J，KNUESEL I，et al.Appetitively motivated instrumental learning in SynGAP heterozygous knockout mice[J].Behav Neurosci，2009，123(5):1114- 1128．

[14] KNUESEL I，ELLIOTT A，CHEN H J，et al.A role for synGAP in regulating neuronal apoptosis[J].Eur J Neurosci，2005，21(3):611- 621．

Construction and expression of SynGAP(1- 700aa)plasmid mutanted deletion at 670- 685aa residues

ZHANG Qing- xiu，WEI Xiu- e，GAO Hong，RONG Liang- qun

(DepartmentofNeurology，SecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221006，China)

Objective： To mutant deletion 670- 685aa fragments of SynGAP(1- 700aa)- Flag plasmid，to provide a reliable theoretical basis for subsequent experiments on identification of new drug targets. Methods： The constructed pCMV- SynGAP(1- 700aa)- Flag plasmid as template，mutanted deletion 670- 685aa and amplified fragment by overlap extension PCR(SOE PCR) ; then made vector linearized with restriction endonuclease，and purified amplified fragment and the linearized vector; connected the linearized vector and amplified fragment by homologous recombination technology to obtain recombinant plasmid; PCR technology was used to identify if recombinant plasmid was successfully constructed，sequence technology was used to further verify bases in constructed plasmid; and finally transfected the mutanted plasmid into 293T cells，collected cells after 48 hours，Western blot was used to identify whether it could express sucessfully. Results： 670- 685aa was mutanted deletion successfully by SOE PCR，and recombinant plasmid was successfully constructed，and the sequence results was correct.Western blot analysis showed that SynGAP(1- 700aa) plasmid mutanted deletion 670- 685aa could express successfully. Conclusion:SynGAP(1- 700aa) plasmid mutantes deletion 670- 685aa successfully，and it can be expressed stably in cell lines.The successfully constructed plasmid will be an experimental basis for our follow- up study．

SynGAP; gene splicing by overlap extension PCR; deletion mutation

2016- 06- 28

2016- 07- 17

國家自然科學基金青年項目(81301120)；江蘇省高校自然科學基金面上項目(13KJB320027)

張清秀(1980-)，女，江蘇徐州人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士。E- mail：zhangqingxiu@163.com

榮良群 E- mail：rongliangqun@163.com

張清秀，魏秀娥，高紅，等.SynGAP(1- 700aa)中670- 685aa缺失突變質(zhì)粒的構(gòu)建及表達[J].東南大學學報:醫(yī)學版，2016，35(6)：832- 835.

Q782

A

1671- 6264(2016)06- 0832- 04

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．002