NASS唾液卡在唾液核酸采集中的應(yīng)用研究

石云杰，孫溢華，周如華，馬 靜

（1.蘇州市公安局刑警支隊(duì)，江蘇蘇州 215131；2.蘇州新海生物科技有限公司，江蘇蘇州 215124）

NASS唾液卡在唾液核酸采集中的應(yīng)用研究

石云杰1，孫溢華1，周如華1，馬 靜2

（1.蘇州市公安局刑警支隊(duì)，江蘇蘇州 215131；2.蘇州新海生物科技有限公司，江蘇蘇州 215124）

目的 探討NASS唾液卡在唾液核酸采集中的應(yīng)用效果。方法 對(duì)NASS唾液卡與FTA唾液卡進(jìn)行抗菌能力測(cè)試和防霉能力測(cè)試；使用兩種唾液卡分別采集21份人員口腔拭子，通過(guò)Identifiler Plus試劑盒進(jìn)行PCR直接擴(kuò)增，對(duì)STR基因座峰面積進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)；使用兩種唾液卡各采集1000份人員口腔拭子，通過(guò)Identifiler Plus試劑盒復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)STR分型。結(jié)果 抗菌能力測(cè)試中NASS唾液卡對(duì)大腸桿菌的抑菌率大于99.9 %，F(xiàn)TA唾液卡對(duì)大腸桿菌的抑菌率大于94.4 %，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌兩種唾液卡抑菌率均大于99.9 %；防霉能力測(cè)試中，21天時(shí)NASS唾液卡的長(zhǎng)霉級(jí)別為2級(jí)，F(xiàn)TA唾液卡為3級(jí)，其他條件下二者無(wú)差別；NASS唾液卡和FTA唾液卡對(duì)PCR均存在一定程度的抑制，NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座峰面積大于FTA唾液卡（0.01＜P＜0.05），在CSF1PO、D2S1338、D18S51基因座峰面積顯著大于FTA唾液卡(P＜0.01)，其余基因座無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；批量檢測(cè)中，NASS唾液卡檢出率為98.3 %，F(xiàn)TA唾液卡檢出率為97.9 %。結(jié)論 NASS唾液卡在抗菌、防霉能力以及對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制程度方面優(yōu)于FTA唾液卡，適合在唾液核酸采集中應(yīng)用。

法醫(yī)物證學(xué)；唾液核酸采集；FTA唾液卡

脫氧核糖核酸（DNA）已廣泛用于法醫(yī)鑒定、疾病基因診斷及監(jiān)測(cè)等項(xiàng)目。目前，最安全、損傷最小的DNA保存方法是采集口腔唾液樣品保存至進(jìn)口FTA唾液卡上，該方法可在室溫條件下長(zhǎng)期穩(wěn)定保存DNA[1]。然而FTA唾液卡價(jià)格昂貴，限制了其對(duì)大規(guī)模人員樣本采集的應(yīng)用。本研究通過(guò)比較國(guó)產(chǎn)NASS唾液卡與FTA唾液卡在抗菌與防霉能力以及對(duì)PCR擴(kuò)增抑制程度等方面的表現(xiàn)，探討NASS唾液卡在唾液核酸采集中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采集1000份刑嫌人員左右兩頰粘膜擦拭物，分別轉(zhuǎn)移至NASS唾液卡（蘇州新海生物科技有限公司）與FTA唾液卡（美國(guó) GE-Whatman公司）。

1.2 主要儀器與材料

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒公司）、Titer Plate shaker恒溫振蕩搖床（德國(guó) ThermoFisher公司）、ZF-258凝膠成像儀（上海嘉鵬公司）、BSD600-Duet 打孔儀（澳大利亞 BSD公司）、3500XL遺傳分析儀（美國(guó) ABI）、9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó) ABI）、Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒（美國(guó) ABI）、測(cè)試菌種：大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、白色念珠菌ATCC 10231、黑曲霉ATCC 9642、繩狀青霉ATCC11797、球毛殼霉ATCC 6205、出芽短梗霉ATCC 15233、綠色黏帚霉ATCC 9645。

1.3 方法

1.3.1 抗菌能力測(cè)試

取100 μL測(cè)試菌懸液（大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、白色念珠菌ATCC 10231，回收菌數(shù)為1×104～9×104cfu），分別涂布在大小為2.0 cm×3.0 cm的NASS唾液卡和FTA唾液卡上，同時(shí)使用空白濾紙卡作為對(duì)照；作用5 min后，置于5 mL PBS的試管內(nèi)；充分混勻，梯度稀釋后，吸取0.5 mL置于平皿；用15 mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）傾注培養(yǎng)48 h 、沙氏瓊脂培養(yǎng)基（白色念珠菌）傾注培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)溫度35 ℃ 士 2 ℃；抑菌率計(jì)算：（對(duì)照卡片上的菌落數(shù)-測(cè)試唾液卡上的菌落數(shù)）/ 對(duì)照卡片上的菌落數(shù)×100 %；評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：抑菌率≥90 %（具有強(qiáng)抑菌作用）。

1.3.2 防霉能力測(cè)試

依據(jù)ASTM G21-200合成聚合材料防霉性的測(cè)定方法：在無(wú)菌平皿中注入營(yíng)養(yǎng)鹽瓊脂培養(yǎng)基；凝固后分別將NASS唾液卡、FTA唾液卡、空白濾紙卡，鋪在平板培養(yǎng)基上，均勻噴灑混合真菌孢子懸液（黑曲霉ATCC 9642、繩狀青霉ATCC11797、球毛殼霉ATCC 6205、出芽短梗霉ATCC 15233、綠色黏帚霉ATCC 9645）；將接種后的平板培養(yǎng)基置于28～30 ℃，相對(duì)濕度85 %以上的條件下培養(yǎng)28 d；觀察可見(jiàn)效果，記錄相應(yīng)級(jí)別。

1.3.3 PCR 抑制性測(cè)試

使用BSD打孔儀，分別在NASS唾液卡和FTA唾液卡上取21個(gè)直徑為0.5 mm的小孔。使用ID Plus擴(kuò)增試劑盒復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為9 mL擴(kuò)增液 + 6 mL 9947A，擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)條件：94 ℃變性11 min；（95 ℃，20 s、59 ℃，3 min)×26循環(huán)；60 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物使用3500XL型基因分型儀檢測(cè)。GraphPad Prism軟件，配對(duì)t檢驗(yàn)，分析不同唾液卡擴(kuò)增后，STR基因座峰面積是否有顯著差異。

1.3.4 批量測(cè)試

采集1000人份左右兩頰粘膜擦拭物，分別轉(zhuǎn)移至NASS唾液卡與FTA唾液卡。使用BSD打孔儀，打孔直徑為0.5 mm。加入15 mL ID Plus擴(kuò)增試劑復(fù)合擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物使用3500XL型基因分型儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 抗菌能力測(cè)試

FTA唾液卡與NASS唾液卡對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均具有較強(qiáng)的抗菌能力，抑菌率均大于99.9 %；但對(duì)大腸桿菌，NASS唾液卡的抑菌率大于99.9 %，而FTA唾液卡大于94.4 %。

2.2 防霉能力測(cè)試

FTA唾液卡與NASS唾液卡具有較強(qiáng)的防霉能力，在高溫高濕條件下，14天長(zhǎng)霉級(jí)別均為0級(jí)；21天NASS唾液卡長(zhǎng)霉級(jí)別2級(jí)，F(xiàn)TA唾液卡長(zhǎng)霉級(jí)別3級(jí)；28天長(zhǎng)霉級(jí)別均為4級(jí)（見(jiàn)表1）。

2.3 PCR抑制性測(cè)試

與陽(yáng)性對(duì)照組相比，ID Plus擴(kuò)增體系中分別加入取自NASS唾液卡、FTA唾液卡的樣品，電泳結(jié)果均有抑制現(xiàn)象(P＜0.01)；NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座峰面積大于FTA唾液卡（0.01＜P＜0.05），在CSF1PO、D2S1338、D18S51基因座峰面積顯著大于FTA唾液卡(P＜0.01)（見(jiàn)表2、圖1），其余基因座無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩種唾液卡防霉能力檢測(cè)結(jié)果Table 1 Mildew-proof capability of two cards

表2 兩種唾液卡3個(gè)STR基因座峰面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical data of 3 STR loci peak areas of DNA products from two cards

圖1 兩種唾液卡3個(gè)STR基因座峰面積柱狀圖a為陽(yáng)性對(duì)照；b為NASS唾液卡；c為FTA唾液卡Fig.1 Bar graph of 3 STR loci peak areas of DNA products from two cards. (a: positive control; b: NASS card; c: FTA card)

2.4 批量檢測(cè)

批量使用NASS唾液卡、FTA唾液卡采集1000人份樣品，使用ID Plus試劑盒擴(kuò)增，3500XL遺傳分析儀電泳。結(jié)果表明，NASS唾液卡檢出983份樣本，檢出率98.3 %，F(xiàn)TA唾液卡檢出979份樣本，檢出率97.9 %。

3 討論

采集生物樣品并提取其中的DNA，主要面臨三個(gè)問(wèn)題：一是如何滅活樣品中可能攜帶的病原微生物以確保操作者和被檢測(cè)者的安全；二是如何有效保存待檢生物樣品中的DNA，使之不會(huì)破壞；三是降低使用成本，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。GE-Whatman公司生產(chǎn)的FTA唾液卡經(jīng)過(guò)強(qiáng)力變性劑和螯合劑浸泡，纖維基質(zhì)上含有特殊的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)捕捉到細(xì)胞后會(huì)自動(dòng)將其裂解，并與釋放出的核酸結(jié)合，從而維持樣品中DNA的完整性，保護(hù)核酸免于降解，不受核酸酶、氧化劑和紫外線影響，能夠阻止細(xì)菌和其他微生物的生長(zhǎng)，符合生物樣本DNA的采集、保存要求[2-3]。然而進(jìn)口產(chǎn)品價(jià)格貴，不利于基層單位大規(guī)模使用。

本研究比較了國(guó)產(chǎn)NASS唾液卡與FTA唾液卡的抗菌能力，發(fā)現(xiàn)兩種唾液卡對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌均有很好的抑制作用，NASS唾液卡對(duì)大腸桿菌的抑菌率大于FTA唾液卡，使用中也能確保人員的安全；先前的研究證實(shí)FTA唾液卡在室溫下能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存DNA，極少發(fā)生霉變現(xiàn)象[2-3]。因此，在防霉能力測(cè)試中，實(shí)驗(yàn)采用28～30 ℃，相對(duì)濕度85 %以上的極端條件進(jìn)行加速測(cè)試，結(jié)果顯示14 d時(shí)，兩種唾液卡均有很好的防霉效果，21 d時(shí)NASS唾液卡防霉效果好于FTA唾液卡，提示NASS唾液卡在實(shí)際使用環(huán)境中，防霉能力更好；由于兩種唾液卡均通過(guò)抑菌、防霉處理，因此對(duì)PCR擴(kuò)增都有抑制作用[4]。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座擴(kuò)增抑制性小于FTA唾液卡，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在CSF1PO、D2S1338、D18S51等更大片段基因座，抑制性差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NASS唾液卡更有利于大片段STR基因座的擴(kuò)增，更適合直擴(kuò)試劑的使用；批量檢測(cè)證實(shí)，使用兩種唾液卡采集DNA，有效檢出率均較高。

綜上所述，NASS唾液卡在抗菌、防霉能力，以及對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制程度方面優(yōu)于FTA唾液卡，適合在唾液核酸采集中應(yīng)用。

［1］ 徐飛，成述儒，羅玉柱，等. FTA 卡和普通定性濾紙?zhí)崛NA 方法研究 ［J］. 生物技術(shù)通報(bào) , 2011(11): 221-224.

［2］ 趙興春，姜伯瑋，葉健，等. FTA卡直接擴(kuò)增緩沖增強(qiáng)劑的研制［J］. 刑事技術(shù), 2012(3): 13-15.

［3］ 付素蘭，劉景武，任天紅，等. FTA卡在模板DNA制備中的應(yīng)用研究［J］. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2008(6): 1124-1125.

［4］ 匡金枝，聶同鋼，楊智，等. FTA-DNA直接提取法的研究與應(yīng)用［J］. 中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志, 2008(2): 108-110.

Applicability of NASS Card in Collection of Nucleic Acid in Saliva

SHI Yunjie1, SUN Yihua1, ZHOU Ruhua1, MA Jing2
(1. Criminal Police Detachment of Suzhou Public Security Bureau, Jiangsu, Suzhou 215131, China;
2. Suzhou NuHigh Biotechnology Limited Company, Jiangsu, Suzhou 215124, China)

Objective To investigate the applicability of NASS card in the collection of nucleic acid in saliva for DNA testing. Methods Anti-bacterial and mildew-proof tests were respectively carried out on NASS and FTA cards. 21 samples of saliva collected individually with NASS and FTA cards were directly amplified with the Identifiler plus kit to measure the peak areas of STR loci, and test was adopted in pairs to compare the corresponding data from the two cards. 1000 samples of saliva collected separately by NASS and FTA cards were directly amplified with the Identifiler plus kit to verify their STR profiles. Results For the anti-bacterial tests, the inhibitory rate of NASS card exceeded 99.9 % against Escherichia coli, and that of the FTA card was less than 94.4 %, with the two cards showing their inhibitory rates greater than 99.9 % against either the Staphylococcus aureus or Candida albicans. On the mildew-proof test, both the NASS and FTA card completely restrained mildew occurring within 14 days. Up to 21 days, the moldy occurrence of NASS card was level 2 and that of the FTA card at level 3. After 28 days passing, the moldy occurrence of the two cards both reached at level 4. The inhibitory effects of the two cards on PCR were observed by their inverse products' STR loci peak areas, with larger peak areas being obtained from NASS card than those from FTA card (0.01＜P＜0.05) at STR loci of D7S820, D13S317, TPOX and FGA. Furthermore, the peak areas at CSF1PO, D2S1338 and D18S51 from NASS card (P＜0.01) were significantly greater than those from FTA, though no differences at the other STR loci (P＞0.05). For PCR batch examination, the detection rate of the NASS card was 98.3 % and that of the FTA card was 97.9 %. Conclusion The NASS card showed better performance than the FTA card on theirantibacterial and mildew-proof ability as well as the counter-inhibition of PCR, demonstrating it applicable to saliva nucleic acid collection for forensic DNA detection and analysis.

forensic biological evidence; NASS saliva nucleic acid card; FTA saliva card

DF795.2

A

1008-3650(2016)04-0286-003

2015-07-31

格式：石云杰，孫溢華，周如華，等. NASS唾液卡在唾液核酸采集中的應(yīng)用研究[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(4):286-288.

10.16467/j.1008-3650.2016.04.007

江蘇省公安廳應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（No.201201002）

石云杰（1980—），男，陜西佳縣人，碩士，主檢法醫(yī)師，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)物證。E-mail：120549874@qq.com