四種提取諾如病毒和副溶血性弧菌總RNA方法的比較

白頡　郭慈浩　羅智強(qiáng)　陳棟

1.浙江省舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山316000；2.浙江省溫州市疾病預(yù)防控制中心，浙江溫州325000

四種提取諾如病毒和副溶血性弧菌總RNA方法的比較

白頡1郭慈浩1羅智強(qiáng)1陳棟2

1.浙江省舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山316000；2.浙江省溫州市疾病預(yù)防控制中心，浙江溫州325000

目的比較四種聯(lián)合提取諾如病毒和副溶血性弧菌總RNA的方法。方法使用Trizol法、磁珠法、QiagenTMRNA Mini Kit和柱式RNA抽提試劑盒分別提取諾如病毒和副溶血性弧菌的總RNA，經(jīng)核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量，并用RT-PCR法對(duì)四種提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果QiagenTMRNA Mini Kit的提取效率最佳，對(duì)PCR的反應(yīng)影響最小。磁珠法其次，但是磁珠法提取出的總RNA純度也較高。Trizol法和柱式法總RNA抽提試劑盒所獲得的總RNA比上述兩者低，且存在不同程度的污染。經(jīng)隨機(jī)區(qū)組方差分析顯示，四種提取方法之間存在顯著性差異，F(xiàn)濃度=11.313；F（A260/A280）=15.093；F（A260/A230）=11.155，P均＜0.05。結(jié)論四種試劑的實(shí)際提取效率存在差異，應(yīng)根據(jù)不同的樣本情況選擇合適的試劑。

諾如病毒；副溶血性弧菌；總RNA；逆轉(zhuǎn)錄PCR；提取

RNA是微生物中重要的遺傳分子，獲取高品質(zhì)的RNA是樣本前處理的基本要求，是后續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供優(yōu)質(zhì)模板的前提。雖然國(guó)內(nèi)已經(jīng)建立了相對(duì)成熟的RNA提取方法，但是缺乏聯(lián)合提取病毒和細(xì)菌兩種不同病原微生物RNA的相關(guān)報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上常見的RNA提取試劑有Qiagen的RNA MiniKit，PROGEMA的SV TotalRNA Isolation System，上海生工的柱式Trizol總RNA抽提試劑盒以及上海之江的磁珠柱RNA抽提試劑盒。除此之外，張倩等[1]用改良SDS/酚法提取總RNA，提取得到的產(chǎn)物完整性強(qiáng)、質(zhì)量好、產(chǎn)率高，適合進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。但是不同的提取原理以及不同的品牌對(duì)RNA的提取濃度和純度有著巨大的差異。而提取高質(zhì)量的RNA用以研究病原微生物的毒力基因表達(dá)、致病性和環(huán)境適應(yīng)性變得尤為重要。本研究嘗試以諾如病毒和副溶血性弧菌的總RNA提取為例，使用Trizol法、磁珠法核酸提取試劑盒、QiagenTMRNA Mini Kit和柱式總RNA抽提試劑盒四種方法提取總RNA，經(jīng)核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量，并用RT-PCR法對(duì)四種提取方法進(jìn)行比較，尋找出更適合用于兩種病原體總RNA的提取。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)樣本副溶血型弧菌菌株2株，由舟山檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院贈(zèng)送。諾如病毒Ⅰ型和Ⅱ樣本各2株，均分離自臨床確證樣本。

1.1.2試劑和試劑盒Trizol采購(gòu)于Invitrogen公司；磁珠法核酸提取試劑盒采購(gòu)于A公司；柱式總RNA抽提試劑盒采購(gòu)于B公司；QiagenTMRNA Mini Kit采購(gòu)于Qiagen公司；DNaseⅠ采購(gòu)于fermentas；β-巰基乙醇、氯仿、異丙醇、Tris飽和酚均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS、PVP均購(gòu)于sigma。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Trizol法提取副溶血性弧菌和諾如病毒的總RNA取0.5 mL副溶血性弧菌菌液（諾如病毒保存液）于1.5 mL滅菌離心管中，再加入Trizol 1 mL，充分混勻，室溫放置10 min，保證病毒外殼充分裂解；加入200μL氯仿，震蕩混勻使溶液充分乳化；12000 rpm離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入500μL異丙醇，充分混勻后室溫放置10 min；再以4℃，10000 rpm離心10 min，去除上清液；加入700μL，75%乙醇洗滌，讓RNA沉淀懸起來，12000 rpm 4℃離心5 min，用槍小心吸去所有上清，干燥5 min；加入40μL ddH2O溶解，-70℃保存。

1.2.2磁珠法提取副溶血性弧菌和諾如病毒的總RNA按試劑盒說明書操作，獲得的總RNA于-70℃保存。

1.2.3QiagenTMRNA Mini Kit法提取副溶血性弧菌和諾如病毒的總RNA按試劑盒說明書操作，獲得的總RNA于-70℃保存。

1.2.4柱式法提取副溶血性弧菌和諾如病毒的總RNA按試劑盒說明書操作，獲得的總RNA于-70℃保存。

1.3總RNA的純化和質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1總RNA的純化用40μL緩沖液、5μL 0.09 M的MnCl2和5μL的DNaseⅠ配制成DNaseⅠ混合液，加入上述提取的總RNA中，室溫保持15 min，確保降解殘留的少量DNA，得到純凈的RNA。

1.3.2純化后總RNA的質(zhì)量檢測(cè)（1）Nanodrop檢測(cè)純化后總RNA的質(zhì)量：取2μL總RNA溶液，測(cè)定并計(jì)算其濃度、A280、A260和A230等檢測(cè)值。（2）RT-PCR檢測(cè)總RNA質(zhì)量：分別設(shè)計(jì)Ⅰ型諾如病毒、Ⅱ型諾如病毒和副溶血性弧菌的特異性引物以檢測(cè)總RNA的提取質(zhì)量。引物及探針由大連寶生物工程有限公司，具體序列見表1。RT-PCR反應(yīng)體系按照Prime ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒說明書進(jìn)行。混勻后置于熒光定量PCR儀中95℃5 min預(yù)變性，95℃30 s→60℃30 s（熒光信號(hào)檢測(cè)），40個(gè)循環(huán)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組方差分析，比較總RNA的提取效果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　NV和VP熒光定量RT-PCR引物及探針

2　結(jié)果

2.1純化后總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

四種不同方法提取副溶血性弧菌和諾如病毒總RNA的結(jié)果有較大差異。從總RNA的純度來比較，QiagenTMRNA Mini Kit優(yōu)于磁珠法，Trizol法和柱式法較差。從總RNA的濃度來比較，QiagenTMRNA Mini Kit優(yōu)于Trizol法和柱式法，磁珠法較差。四種提取方法的提取效率存在顯著性差異，其中體現(xiàn)核酸濃度的F=11.313；體現(xiàn)核酸純度的F（A260/A280）=15.093；體現(xiàn)核酸污染的F（A260/A230）=11.155，P均＜0.05。見表2。

表2　四種方法提取總RNA濃度和純度

2.2 RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)總RNA質(zhì)量

為了檢測(cè)不同方法提取副溶血性弧菌和諾如病毒總RNA的提取效率，實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR對(duì)總RNA中的特異性核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增及分析[2-5]，從擴(kuò)增曲線可以看出：所有病原體的特異性核酸均能擴(kuò)增出，從Ct值的大小可以明顯看出：磁珠法和QiagenTMRNA Mini Kit提取的總RNA對(duì)定量PCR的影響最小。4種提取方法提出副溶血性弧菌的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行的定量PCR結(jié)果，從前至后分別是Qiagen試劑盒、磁珠法、Trizol法、柱式RNA提取法，其中Trizol法和柱式法基本重合（封三圖9）。4種提取方法提出諾如病毒Ⅰ型的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行的定量PCR結(jié)果，從前至后分別是Qiagen試劑盒、磁珠法、Trizol法、柱式RNA提取法，其中Qiagen試劑盒和磁珠法基本重合（封三圖10）。四種提取方法提出諾如病毒II型的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行的定量PCR結(jié)果，從前至后分別是Qiagen試劑盒、磁珠法、Trizol法、柱式RNA提取法（封三圖11）。

3　討論

Trizol法、磁珠法、柱式法RNA提取試劑均是目前實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域比較有代表性的總RNA提取試劑。從本文核酸濃度測(cè)定儀的檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：無論是諾如病毒還是副溶血性弧菌弧菌，利用QiagenTMRNA Mini Kit提取總RNA的濃度和純度均要優(yōu)于其他三種提取方法，磁珠法顯示出較高的純度，但存在濃度不高的情況。而Trizol法由于方法的原因，無論從濃度上還是純度上看，均缺乏相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。但是自Chomczynski發(fā)明Trizol方法的30多年來，Trizol法已經(jīng)成為總RNA提取的經(jīng)典方法，并得到了非常廣泛的應(yīng)用和改良，由于其試劑易于獲得，試劑比例也便于調(diào)整，因此對(duì)改良Trizol法的研究也較多。這些均與國(guó)內(nèi)多數(shù)研究提供的檢測(cè)報(bào)道相符[2-5]。同時(shí)，由于樣本間的差異，四種提取方法對(duì)于副溶血性弧菌的總RNA的提取效果要略高于諾如病毒。通過總RNA提取的后續(xù)熒光定量PCR檢測(cè)，所有樣本均擴(kuò)增出了特異性核酸片段，但由于總RNA的提取效率不同，導(dǎo)致熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果也存在差異，QiagenTMRNA Mini Kit要優(yōu)于其他提取方法的情況。

經(jīng)檢測(cè)，磁珠法和QiagenTMRNA Mini Kit提取出的總RNA純度較高，與陳星等[6]報(bào)道相同。Trizol法和柱式總RNA抽提試劑盒提取的總RNA純度相比以上兩種方法較差，總RNA樣品不純，有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染。其中磁珠法在提取總RNA的過程中不如預(yù)期，雖然其體現(xiàn)了安全無毒及快速方便的優(yōu)勢(shì)[7，8]，但由于國(guó)內(nèi)部分檢測(cè)試劑的制造工藝存在一定程度的不足，導(dǎo)致了磁珠法在檢測(cè)過程中并不能高效的識(shí)別和結(jié)合核酸分子，致使其獲得的總RNA濃度偏低，雖然在常規(guī)大樣本的操作中能夠滿足檢測(cè)需求，但在諸如痕量樣本提取或盲樣考核等能力驗(yàn)證活動(dòng)中并不能取得令人滿意的結(jié)果。而Qiagen的檢測(cè)試劑雖然價(jià)格較高，操作相對(duì)繁瑣，但其提取效率較高已經(jīng)在國(guó)內(nèi)達(dá)成了共識(shí)[9-11]。而Trizol法由于對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作要求較高，因此可能在操作過程中會(huì)不同程度的產(chǎn)生污染，且不同人員之間操作產(chǎn)生的差異也較大[12，13]。柱式提取法為Trizol法的改進(jìn)方法，不可避免存在操作上的誤差，且其也存在制造工藝的問題而無法得到令人滿意的提取效率[14，15]。

RNA的提取質(zhì)量，是影響后續(xù)RT-PCR檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)。在RNA的提取步驟中如保護(hù)劑的干擾或樣本外殼的裂解不完全，DNA污染、蛋白質(zhì)或試劑殘留，均是影響總RNA提取效率，造成總RNA濃度偏低的原因[16-18]。本文研究顯示，QiagenTMRNA Mini Kit的提取效率最佳，對(duì)PCR的反應(yīng)影響最小。磁珠法雖然濃度最低，但是磁珠法提取出的總RNA純度較高，與QiagenTMRNA Mini Kit不相上下，在熒光定量PCR檢測(cè)中具有一定的優(yōu)勢(shì)。而Trizol法和柱式總RNA抽提試劑盒所獲得的總RNA純度比較低，存在不同程度的污染。QiagenTMRNA Mini Kit、磁珠法和柱式總RNA抽提試劑盒是市面上常見的RNA抽提試劑盒，便于獲取和操作。但是QiagenTMRNA Mini Kit成本偏高，在大量樣本提取時(shí)需要考慮經(jīng)費(fèi)問題。Trizol法是傳統(tǒng)的提取方法，試劑價(jià)格便宜但是操作過程復(fù)雜。因此如樣本來源寶貴，且核酸拷貝數(shù)少，則傾向于選擇QiagenTMRNA Mini Kit；如果樣本量大，且核酸拷貝數(shù)大，則考慮磁珠法RNA抽提試劑盒；如需要用最低成本獲得相對(duì)高濃度的RNA，則考慮選擇Trizol法[19-21]。

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Comparison of four methods for extraction of total RNA of norovirus and vibrio parahaemolyticus

BAI Jie1GUO Cihao1LUO Zhiqiang1CHEN Dong2
1.Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau in Zhejiang Province,Zhoushan 316000,China；2.Wenzhou Center for Disease Prevention and Control in Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China

Objective To compare the four combined methods of total RNA extraction from norovirus and vibrio parahaemolyticus.Methods Total RNA was extracted from norovirus and vibrio parahaemolyticus with Trizol method,magnetic bead method,Qiagen RNA Mini Kit and column RNA extraction kit respectively.The quality of RNA was detected by nucleic acid analyzer,and the four extraction methods were compared by RT-PCR.Results QiagenTMRNA Mini Kit showed the best extraction efficiency and the least effect on PCR reaction.The bead method was ranked the second, but the purity of total RNA extracted by magnetic bead method was also higher.The total RNA obtained from total RNA extraction kit by Trizol method and column method was lower than the above two methods,and there were different degrees of contamination.The randomized block analysis showed that there were significant differences among the four extraction methods,with F concentration=11.313；F(A260/A280)=15.093；F(A260/A230)=11.155(P＜0.05).Conclusion The actual extraction efficiency of various reagents are different,and appropriate reagents should be selected according to different samples.

Norovirus；Vibrio parahaemolyticus；Total RNA；Reverse transcription PCR；Extraction

R332；Q933

B

1673-9701（2016）29-0127-04

浙江省公益基金資助課題（2014C33111）

（2016-08-10）