• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TLR9、MyD88及NF-κB在過敏性紫癜中的表達(dá)及意義

    2016-12-22 02:52:01王子威楊麗君
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年29期
    關(guān)鍵詞:白介素信號研究

    王子威 楊麗君

    首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科,北京100050

    TLR9、MyD88及NF-κB在過敏性紫癜中的表達(dá)及意義

    王子威楊麗君

    首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科,北京100050

    目的探討免疫上游因子TLR9、MyD88、NF-κB及免疫下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α在HSP組與正常對照組間的差異及相關(guān)性。方法采用實時熒光定量PCR檢測HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)量,ELISA法檢測血漿IL-6、TNF-α水平。結(jié)果①HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)均顯著高于正常對照組;②HSP組血漿IL-6、TNF-α水平較對照組水平顯著增高;③HSP組中TLR9與MyD88、TLR9與NF-κB、MyD88與NF-κB、NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α均存在線性正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論HSP患兒TLR9、MyD88、NF-κB、IL-6、TNF-α水平均較正常兒童顯著升高。TLR9-MyD88-NF-κB信號通路參與HSP發(fā)病,并在其中起重要作用。

    過敏性紫癜;Toll樣受體9;髓樣分化因子88;核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B;白介素6;腫瘤壞死因子α

    過敏性紫癜(henoch-schonlein purpura,HSP)是兒童時期最常見的免疫系統(tǒng)疾病,本病以小血管炎癥為主要病變,好發(fā)于3~10歲兒童,常累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)、腎臟等多個系統(tǒng),其發(fā)病率呈逐年增多趨勢,臨床上無有效的治療措施及控制其進(jìn)展的有力手段,近年來,人們努力尋找HSP發(fā)生的上游機制,隨著Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)等模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)深入研究,人們發(fā)現(xiàn)這種形式讓機體不但可以發(fā)現(xiàn)入侵的病原體,而且能夠識別其類型,并通過一系列信號途徑活化效應(yīng)分子,從而控制并清除病原體。目前研究發(fā)現(xiàn)由Toll樣受體9(Toll like receptor 9,TLR9)-髓系分化因子(myeloid differentiation factors 88,MyD88)-核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通道介導(dǎo)下游細(xì)胞因子如血清白介素6(Interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)釋放發(fā)揮免疫應(yīng)答,因此信號通道TLR9-MyD88-NF-κB在免疫識別、激活、效應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    1 資料與方法

    1.1一般資料

    選取2015年3月~2016年3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院門診及住院急性期HSP患兒40例作為研究對象,另選取我院兒童保健科健康體檢兒童35例作為正常對照組。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡<14歲;②均為初診初次發(fā)病,病程在3 d內(nèi)且未接受治療者;③HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照諸福棠《實用兒科學(xué)》第7版[1];④近1個月內(nèi)無感染及過敏性疾病史,未使用過激素及免疫抑制劑。對照組:選取同期在本院體檢的正常健康兒童。本研究取得入選對象監(jiān)護(hù)人知情同意并獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。HSP組男21例,女19例,年齡3~12歲,平均(7.4±2.9)歲,對照組男18例,女17例,年齡3~11歲,平均(7.6±2.7)歲。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2方法

    實時熒光定量(real-time quantitative RT-PCR)檢測:采集研究對象的組織,采用Trizol抽提法提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)說明書合成cDNA。引物的設(shè)計使用Oligo 6.0設(shè)計軟件設(shè)計,由上海生物工程有限公司合成,引物序列及擴增長度詳見下圖。RT-PCR使用TAKARA公司的SybergreenIMix試劑盒,反應(yīng)條件為:94℃5 min,94℃15 s,58℃15 s,72℃15 s,共35個循環(huán),擴增反應(yīng)完成后又進(jìn)行了溶解曲線的制作,確保擴增的特異性。

    引物序列如下:

    TRL9引物序列:

    上游:5’-GGGACCTCGAGTGTGAAGCA-3’199

    下游:5’-CTGGAGCTCACAGGGTAGGAA-3’

    MyD88引物序列:

    上游:5’-GCACATGGGCACATACAGAC-3’239

    下游:5’-TGGGTCCTTTCCAGAGTTTG-3’

    NF-κB引物序列:

    上游:5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’197

    下游:5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’

    β-actin引物序列:

    上游:5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’111

    下游:5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’

    血清IL-6、TNF-α由第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供ELISA試劑盒測定。敏感度為100μg/L,酶標(biāo)儀MicroplateReader為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品,在450 nm處讀出吸光度(A)值,操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗后,滿足正態(tài)分布的計量資料以(±s)表示,計量資料組間比較采用t檢驗,直線相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1HSP組與正常對照組血漿IL-6與TNF-α表達(dá)水平比較

    HSP組血漿IL-6、TNF-α水平較對照組水平顯著增高,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.11、9.26,P<0.01)。見表1。

    表1 HSP組與正常對照組血漿IL-6與TNF-α水平比較(±s)

    表1 HSP組與正常對照組血漿IL-6與TNF-α水平比較(±s)

    組別n IL-6(ng/mL)TNF-α(pg/mL)HSP組正常對照組t值P值40 35 41.85±7.59 33.90±5.53 5.11 0.00 0.83±0.16 0.49±0.15 9.26 0.00

    2.2HSP組與正常對照組人外周血單個核細(xì)胞(peripheralblood mononuclearcell,PBMC)TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較

    HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)均顯著高于正常對照組,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.68、5.42、112.95,P<0.01)。見表2。

    表2 HSP組與正常對照組PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較(s)

    表2 HSP組與正常對照組PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較(s)

    ?

    2.3HSP組中TLR9與MyD88,TLR9與NF-κB,MyD88與NF-κB,NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α的相關(guān)關(guān)系

    HSP組中TLR9與MyD88,TLR9與NF-κB,MyD88與NF-κB,NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α均存在線性正相關(guān)關(guān)系。TLR9與MyD88呈正相關(guān)(r=1.00,P<0.01);TLR9與NF-κB呈正相關(guān)(r= 0.98,P<0.01);MyD88與NF-κB呈正相關(guān)(r=0.98,P<0.01);NF-κB與IL-6呈正相關(guān)(r=0.98,P<0.01);NF-κB與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.97,P<0.01)。

    3 討論

    過敏性紫癜是兒童好發(fā)的自身免疫系統(tǒng)疾病,目前發(fā)病率逐年上升,發(fā)病率約為萬分之一[2]。臨床上以非血小板減少性皮疹、腹痛、關(guān)節(jié)痛、血尿和蛋白尿為主要表現(xiàn),可分為單純皮膚型、關(guān)節(jié)型、腹型、腎型、混合型[3]。

    Toll樣受體是目前研究較多的一種模式識別受體,至少包括13個成員(TRL1-13),其中TRL1-9在人類及小鼠中均有表達(dá),在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著重要的作用,實現(xiàn)對入侵病原體的早期識別,激活天然免疫,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[4,5]。TLR9是TLRs家族中的一員,能識別細(xì)菌和病毒DNA中非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤基序(CpG-DNA),在微生物、空氣傳播的細(xì)菌、真菌、病毒病原菌感染的先天免疫中起作用。啟動炎性應(yīng)答信號通路,成為近兩年HSP研究的熱點[6]。TLR9信號通道是MyD88依賴通道[7]。

    MyD88通過一系列信號分子如:Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptorhomologous region,TIR)、白介素1受體相關(guān)蛋白激酶(IL-1 Rassociated kinase,IRAK)4、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNFR-associatedfactor 6,TRAF6)、TGF-β激酶(TGF-βactivated kinase 1,TAK1)和TAK1結(jié)合蛋白(TAK1 binding protein,TAB),最終激活NF-κB[8],促進(jìn)下游炎性因子如白介素1(Interleukin 1,IL-1)、白介素6(Interlenkin 6,IL-6)、白介素8(Interleukin 8,IL-8)、白介素12(Interleukin 12,IL-12)和TNF-α等表達(dá)。

    TLR9-MyD88-NF-κB信號通道激活后能啟動下游多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和合成[9]。大量研究發(fā)現(xiàn),包括細(xì)菌、病毒以及其他病原體的感染與HSP的發(fā)病最為密切,機體受到病原微生物感染后,激活上游TLR9-MyD88-NF-κB信號通道后,活化的NF-κB誘導(dǎo)下游多種炎癥因子和酶等基因的表達(dá),介導(dǎo)瀑鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)的形成、發(fā)展及惡化。國外Maria E等[10]通過研究63例HSP患兒與50例正常兒童外周血單核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在HSP患兒外周血中TLR9 mRNA表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組。Coppo R等[11]研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒中TLR9基因和蛋白表達(dá)較正常組均顯著升高,故推測TLR9信號通路介導(dǎo)HAP異常免疫反應(yīng)。Alper S等[12]發(fā)現(xiàn)TLRs通過IL-1和NF-κB途徑引起炎癥反應(yīng)。TLR信號通路的上調(diào)還與腎臟疾病有關(guān),在國外一項HSP研究中,野生型C57BL/6實驗鼠和TLR缺失型實驗鼠同時接種同等劑量的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),野生型C57BL/6實驗鼠發(fā)生嚴(yán)重過敏性紫癜腎炎,表現(xiàn)為腎小球血栓,新月體形成和腎小球巨噬細(xì)胞浸潤,而TLR缺失型實驗鼠卻未發(fā)生過敏性紫癜腎炎,研究表明TLR信號通路在過敏性紫癜腎炎發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要作用[13]。Hong C等[14]2011~2013年將105名HSP患兒按照24 h尿蛋白量分成3組,A組診斷為HSP,但未見腎臟損傷,B組HSP伴有腎臟損傷,但無大量蛋白尿,C組HSP伴有腎臟損傷,合并大量蛋白尿,同時以35例健康兒童作為健康組,研究發(fā)現(xiàn)C組患兒TLR9 mRNA和蛋白表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組,同時比A、B組均高,研究還發(fā)現(xiàn)TLR9表達(dá)與24 h尿蛋白定量呈線性相關(guān)關(guān)系。這個結(jié)論與Maria E[10]得出在成人中,TLRs表達(dá)與蛋白尿的量有很明顯的相關(guān)性的結(jié)論,高度一致。故本研究推測TLR4異常激活與HSPN發(fā)生有密切相關(guān)。目前越來越多的研究表明TLR信號通路參與了HSP發(fā)病的過程[15-18]。因此HSP的發(fā)病與TLR9-MyD88-NF-κB信號通道密切相關(guān)。TNF-α和IL-6均屬于免疫下游細(xì)胞因子,研究表明NF-κB是其上游的調(diào)控點。

    本實驗發(fā)現(xiàn)HSP組患兒TLR9、MyD88、NF-κB均比正常對照組患兒明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,三者間經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析具有線性正相關(guān)關(guān)系,說明HSP患兒因內(nèi)源性或外源性因素機體免疫上游的TLR9、MyD88、NF-κB被激活,同時我們也檢測到免疫下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α在HSP組比正常對照組明顯升高,且與上游的TLR9、MyD88、NF-κB存在線性正相關(guān)關(guān)系。因此在HSP發(fā)病過程中,TLR9-MyD88-NF-κB信號通道作為上游信號受到外界刺激被活化后,繼而引起下游炎癥介質(zhì),包括自由基,細(xì)胞因子,前列腺素類和補體級聯(lián)反應(yīng),打破機體的免疫耐受,導(dǎo)致HSP的發(fā)病。

    因此如果對免疫反應(yīng)上游的TLR9或MyD88進(jìn)行干預(yù),是否可減輕HSP癥狀或進(jìn)行早期預(yù)防,這將是我們下一步研究的重點。

    [1]胡亞美,江載芳.諸福棠實用兒科學(xué)[M].第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:689-690.

    [2]趙辨.臨床皮膚病學(xué)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2010:872-873.

    [3]方湘鈴,易顯文,黨西強,等.兒童過敏性紫癜236例臨床分析[J].臨床兒科雜志,2006,24(1):46-49.

    [4]金伯泉.固有免疫中模式識別受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)—當(dāng)代免疫學(xué)中最偉大的發(fā)現(xiàn)之一[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22(6):1-3.

    [5]Takeda K,Akira S.Toll-like receptors in innate immunity[J]. Int Immunol,2005,17(4):1-14.

    [6]Kawai T,Akira S.TLR signaling[J].Cell Death Differ,2006,13(5):816-825.

    [7]Lucas K,Maes M.Role of the Toll like receptor(TLR)radical cycle in chronic inflammation:Possible treatments targeting the TLR4 pathway[J].Mol Neurobiol,2013,48(12):190-204.

    [8]Ohnishi H,Tochio H,Kato Z,et al.Structural basis for the multiple interactions of the MyD88 TIR domain in TLR4 signaling[J].Proc NatlAcad SciUSA,2009,106(25):10260-10265.

    [9]李曼麗,甘華.高糖對腎小管上皮細(xì)胞Toll樣受體4表達(dá)及其信號通路的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,35(6):857-859.

    [10]Maria E,Donadio,Elisa L,et al.Toll-like receptors,immunoproteasome and regulatory T cells in children with Henoch-Sch?nlein purpura and primary IgA nephropathy[J].Pediatr Nephrol,2014,29(10):1545-1551.

    [11]Coppo R,Camilla R,Amore A,et al.Toll-like receptor 4 expression is increased in circulating mononuclear cells of patients with immunoglobulin A nephropathy[J].Clin Exp Immunol,2010,159(30):73-81.

    [12]Alper S,Sefa K,Salih K,et al.TLR-2 Arg753Gln,TLR-4 Asp299Gly,and TLR-4 Thr399Ile polymorphisms in Henoch Schonlein purpura with and without renal involvement[J].Rheumatol Int,2010,30(12):667-670.

    [13]Brown HJ,Sacks SH,Robson MG.Toll-like receptor 2 agonists exacerbate accelerated nephrotoxic nephritis[J]. J Am Soc Nephrol,2006,17(9):1931-1939.

    [14]Hong C,Dong SY,Xiu QL,et al.Clinical significance of TLR3 and TLR4 in peripheral blood mononuclear cells from children with Henoch-Sch?nlein purpura nephritis[J]. Exp Ther Med,2014,32(7):1703-1707.

    [15]Mills KH.TLR-dependent T cell activation in autoimmunity[J].Nat Rev Immunol,2011,45(11):807-822.

    [16]Urbonaviciute V,Starke C,Pirschel W,et al.Toll-like receptor 2 is required for autoantibody production and developmentofrenal disease in pristane-induced lupus[J]. Arthritis Rheum,2013,65(10):1612-1623.

    [17]Miranda HS,Baxter AG.Role of toll-like receptors in multiple sclerosis[J].Am J Clin Exp Immunol,2013,24(2):75-93.

    [18]Kirchner M,Sonnenschein A,Schoofs S,et al.Surface expression and genotypes of Toll-like receptors 2 and 4 in patients with juvenile idiopathic arthritis and systemic lupus erythematosus[J].Pediatr Rheumatol Online J,2013,84(11):9.

    Expression and significance of TLR9,MyD88 and NF-κB in HSP

    WANG Ziwei YANG Lijun
    Department of Pediatrics,Beijing Friendship Hospital Affiliated to Beijing Capital University,Beijing 100050,China

    Objective To investigate the differences and correlations of immunological upstream factors of TLR9, MyD88,NF-κB and immunological downstream factors of IL-6 and TNF-αin the HSP group and normal control group.Methods The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of HSP were detected by real-time PCR.The levels of IL-6 and TNF-αwere measured by ELISA.Results①The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB mRNA in peripheral blood mononuclear cells of children with HSP was significantly higher than that of normalcontrols;②The levels of IL-6 and TNF-αin plasma of HSP group were significantly higher than those in the control group;③There was a positive linear correlation between TLR9 and MyD88,TLR9 and NF-κB, MyD88 and NF-κB,NF-κB and IL-6,NF-κB and TNF-αin HSP group.Conclusion The levels of TLR9,MyD88, NF-κB,IL-6 and TNF-αin children with HSP are significantly higher than those in normal children.TLR9-MyD88-NF-κB signal pathways play an important role in the pathogenesis of HSP.

    HSP;TLR9;MyD88;NF-κB;IL-6;TNF-α

    R554.6

    A

    1673-9701(2016)29-0009-04

    (2016-08-07)

    猜你喜歡
    白介素信號研究
    FMS與YBT相關(guān)性的實證研究
    遼代千人邑研究述論
    信號
    鴨綠江(2021年35期)2021-04-19 12:24:18
    完形填空二則
    視錯覺在平面設(shè)計中的應(yīng)用與研究
    科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
    EMA伺服控制系統(tǒng)研究
    基于FPGA的多功能信號發(fā)生器的設(shè)計
    電子制作(2018年11期)2018-08-04 03:25:42
    基于LabVIEW的力加載信號采集與PID控制
    銀屑病患兒血清腫瘤壞死因子α、白介素6、白介素8的檢測
    哮喘患兒血清白介素與免疫球蛋白檢測的臨床意義
    欧美精品国产亚洲| 免费观看精品视频网站| 九草在线视频观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲最大成人手机在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 内射极品少妇av片p| 国产免费一级a男人的天堂| 日本wwww免费看| 最近中文字幕高清免费大全6| 99热全是精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 性色avwww在线观看| 内地一区二区视频在线| 亚洲av二区三区四区| av在线观看视频网站免费| 久久精品综合一区二区三区| 乱系列少妇在线播放| 国产色婷婷99| ponron亚洲| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲国产色片| 国产色婷婷99| 国产爱豆传媒在线观看| 嫩草影院精品99| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美97在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | av在线播放精品| 国产成人aa在线观看| 免费人成在线观看视频色| 亚洲电影在线观看av| 日日撸夜夜添| 插阴视频在线观看视频| 久久久a久久爽久久v久久| 国产老妇女一区| 久久久成人免费电影| 久久97久久精品| 99久国产av精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩精品有码人妻一区| 精品久久久久久久末码| 国产综合懂色| av.在线天堂| 精品一区二区免费观看| 久久国内精品自在自线图片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产黄色免费在线视频| 激情 狠狠 欧美| 少妇熟女欧美另类| 亚洲最大成人中文| 美女大奶头视频| 天美传媒精品一区二区| 日本三级黄在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av一区综合| 婷婷色av中文字幕| 亚洲在久久综合| 久久99精品国语久久久| 欧美激情在线99| 亚洲av不卡在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 性插视频无遮挡在线免费观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久鲁丝午夜福利片| 精华霜和精华液先用哪个| 国产黄片视频在线免费观看| 伊人久久国产一区二区| 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品成人久久久久久| 国产成人免费观看mmmm| 国产av在哪里看| av播播在线观看一区| eeuss影院久久| 亚洲自偷自拍三级| 国产成人福利小说| 日本av手机在线免费观看| 六月丁香七月| 在线 av 中文字幕| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲av在线观看美女高潮| a级一级毛片免费在线观看| 伦精品一区二区三区| 插逼视频在线观看| 久久99精品国语久久久| 亚洲av免费在线观看| 丝袜美腿在线中文| 五月天丁香电影| 91久久精品国产一区二区成人| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 特级一级黄色大片| 婷婷色麻豆天堂久久| xxx大片免费视频| 久久综合国产亚洲精品| 国产在视频线精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| av在线亚洲专区| 男的添女的下面高潮视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 国精品久久久久久国模美| 国产乱来视频区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲三级黄色毛片| 日韩视频在线欧美| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产成人精品福利久久| 亚洲最大成人中文| 少妇丰满av| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品一二三区在线看| 国产欧美日韩精品一区二区| 成年版毛片免费区| 亚洲av中文av极速乱| 免费av毛片视频| 观看美女的网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 99久国产av精品| 赤兔流量卡办理| 高清午夜精品一区二区三区| 只有这里有精品99| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 97超碰精品成人国产| 三级国产精品欧美在线观看| 色吧在线观看| 在线观看免费高清a一片| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 天堂影院成人在线观看| 大陆偷拍与自拍| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产av国产精品国产| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 男女边摸边吃奶| 夫妻午夜视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 免费观看在线日韩| 一级毛片 在线播放| 97热精品久久久久久| 日日啪夜夜爽| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品久久久久久av不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产成人一区二区在线| 国产黄频视频在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久99热6这里只有精品| 久久99热6这里只有精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 午夜福利在线观看吧| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品影视一区二区三区av| 搡老妇女老女人老熟妇| 一个人免费在线观看电影| 能在线免费观看的黄片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 精品国产露脸久久av麻豆 | 丰满少妇做爰视频| 春色校园在线视频观看| 成人美女网站在线观看视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一级片'在线观看视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美日本视频| 国产三级在线视频| 2018国产大陆天天弄谢| 能在线免费看毛片的网站| 嘟嘟电影网在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 中文天堂在线官网| 最近最新中文字幕免费大全7| 午夜福利在线观看吧| 乱系列少妇在线播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲最大成人中文| 两个人的视频大全免费| av免费在线看不卡| 69人妻影院| 国产综合精华液| 天美传媒精品一区二区| 日本一二三区视频观看| 成年免费大片在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 日韩电影二区| 欧美人与善性xxx| 国产又色又爽无遮挡免| 秋霞伦理黄片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产黄色免费在线视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 777米奇影视久久| av在线天堂中文字幕| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲va在线va天堂va国产| 毛片女人毛片| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产久久久一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国精品久久久久久国模美| 国产视频内射| 五月伊人婷婷丁香| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲精品,欧美精品| 久久精品综合一区二区三区| 美女内射精品一级片tv| 婷婷色av中文字幕| 人妻一区二区av| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一区二区三区免费毛片| 天堂影院成人在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品久久久久久精品电影| 毛片一级片免费看久久久久| 精品久久久久久成人av| 黄色日韩在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 大片免费播放器 马上看| 亚洲图色成人| 国产老妇女一区| 日日撸夜夜添| 大香蕉97超碰在线| 午夜免费观看性视频| 亚洲精品成人久久久久久| 国产人妻一区二区三区在| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产av不卡久久| 欧美 日韩 精品 国产| 永久免费av网站大全| 两个人视频免费观看高清| 中文字幕久久专区| 99热网站在线观看| 99久国产av精品| 男的添女的下面高潮视频| 天天躁日日操中文字幕| 看免费成人av毛片| 嫩草影院精品99| av在线老鸭窝| 国产精品av视频在线免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美zozozo另类| 联通29元200g的流量卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色吧在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久精品久久久久久久性| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩精品青青久久久久久| 我要看日韩黄色一级片| 日本黄色片子视频| 黄色一级大片看看| 国产黄色免费在线视频| 激情 狠狠 欧美| 水蜜桃什么品种好| 免费少妇av软件| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲国产av新网站| 中国国产av一级| 久久久色成人| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久久久国产网址| 亚洲成人精品中文字幕电影| 97在线视频观看| av卡一久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产成人a区在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产免费又黄又爽又色| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲乱码一区二区免费版| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲一区高清亚洲精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 高清日韩中文字幕在线| 久久久久九九精品影院| 美女被艹到高潮喷水动态| 午夜福利在线在线| 久久6这里有精品| 熟妇人妻不卡中文字幕| 在线天堂最新版资源| 淫秽高清视频在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| .国产精品久久| 2018国产大陆天天弄谢| 人妻系列 视频| 国产成人精品福利久久| 国产精品人妻久久久影院| 97精品久久久久久久久久精品| 不卡视频在线观看欧美| 日韩欧美三级三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 欧美最新免费一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美| 中文字幕制服av| 国产 一区 欧美 日韩| 99久久人妻综合| 一个人看的www免费观看视频| 五月伊人婷婷丁香| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美日本视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜激情福利司机影院| 成人亚洲欧美一区二区av| 激情 狠狠 欧美| 男女那种视频在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产亚洲精品久久久com| 日韩电影二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 少妇的逼好多水| 欧美丝袜亚洲另类| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av男天堂| 欧美xxxx性猛交bbbb| 九草在线视频观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 99热6这里只有精品| 不卡视频在线观看欧美| 久久99热这里只有精品18| 最近2019中文字幕mv第一页| 女人久久www免费人成看片| 色哟哟·www| 欧美极品一区二区三区四区| 全区人妻精品视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久久亚洲精品成人影院| 日本免费a在线| 天堂影院成人在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 禁无遮挡网站| 久久久久久久久久成人| 美女黄网站色视频| 好男人在线观看高清免费视频| 国产男女超爽视频在线观看| 精品久久久久久电影网| 一区二区三区免费毛片| 久久久久久久久中文| 99久久精品热视频| 韩国av在线不卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 成人性生交大片免费视频hd| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲av成人av| 国产69精品久久久久777片| 亚洲av二区三区四区| 男女国产视频网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 赤兔流量卡办理| 久久久久久伊人网av| 女人被狂操c到高潮| 夫妻性生交免费视频一级片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲图色成人| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲高清免费不卡视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲美女搞黄在线观看| 永久免费av网站大全| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 淫秽高清视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产免费又黄又爽又色| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 麻豆成人av视频| 黑人高潮一二区| 毛片女人毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| or卡值多少钱| 精品久久久噜噜| eeuss影院久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国内精品一区二区在线观看| 日韩强制内射视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品99久久久久久久久| 日韩三级伦理在线观看| 国产单亲对白刺激| 大陆偷拍与自拍| 免费观看无遮挡的男女| 久久久精品免费免费高清| 婷婷色综合大香蕉| 大香蕉97超碰在线| 色综合色国产| 少妇裸体淫交视频免费看高清| av专区在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲精品成人久久久久久| 精品一区二区三区视频在线| .国产精品久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩欧美国产在线观看| 日韩伦理黄色片| 国产精品一二三区在线看| 亚洲av中文av极速乱| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 91狼人影院| 国产成人福利小说| 天堂俺去俺来也www色官网 | 午夜福利在线在线| 久久午夜福利片| 又爽又黄a免费视频| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品无大码| 97精品久久久久久久久久精品| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲国产最新在线播放| 久久久久久久久中文| 床上黄色一级片| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av免费观看日本| 亚洲精品456在线播放app| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 在线天堂最新版资源| 午夜福利视频1000在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 嫩草影院新地址| 欧美激情国产日韩精品一区| 中国国产av一级| 午夜视频国产福利| 成人特级av手机在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产成人91sexporn| 晚上一个人看的免费电影| 日本与韩国留学比较| 日韩一区二区三区影片| 亚洲av.av天堂| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美+日韩+精品| 久久精品综合一区二区三区| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 成人av在线播放网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 日本黄色片子视频| 国产黄色免费在线视频| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品.久久久| 成人午夜高清在线视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产 亚洲一区二区三区 | 免费黄色在线免费观看| 身体一侧抽搐| 午夜精品在线福利| 99视频精品全部免费 在线| 精品久久久久久久久av| 精品一区二区三卡| 美女大奶头视频| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美极品一区二区三区四区| www.色视频.com| 真实男女啪啪啪动态图| 国产成人精品婷婷| 国产成人午夜福利电影在线观看| 18禁在线播放成人免费| 国产伦理片在线播放av一区| or卡值多少钱| 久久久精品免费免费高清| 国产亚洲91精品色在线| 国产成人精品一,二区| 亚洲国产av新网站| 成年人午夜在线观看视频 | 美女黄网站色视频| 中文在线观看免费www的网站| 日韩伦理黄色片| 欧美极品一区二区三区四区| 少妇丰满av| 内地一区二区视频在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 一级毛片 在线播放| 免费少妇av软件| 国产男人的电影天堂91| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av免费在线观看| videos熟女内射| 亚洲av男天堂| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲av男天堂| 精品人妻一区二区三区麻豆| 黑人高潮一二区| 99热这里只有是精品50| 国产亚洲91精品色在线| 可以在线观看毛片的网站| 欧美另类一区| 十八禁网站网址无遮挡 | 免费人成在线观看视频色| 丰满人妻一区二区三区视频av| av黄色大香蕉| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 成年av动漫网址| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 晚上一个人看的免费电影| 日本色播在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 26uuu在线亚洲综合色| 免费黄网站久久成人精品| 久久久久久久久久黄片| 久久久精品免费免费高清| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲精品国产成人久久av| av专区在线播放| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久久久久久成人| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费无遮挡裸体视频| 国产成人a∨麻豆精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久国内精品自在自线图片| 高清午夜精品一区二区三区| 一区二区三区乱码不卡18| 在线a可以看的网站| 一区二区三区免费毛片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99热6这里只有精品| 中文欧美无线码| 欧美丝袜亚洲另类| av国产免费在线观看| 亚洲国产精品国产精品| xxx大片免费视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 街头女战士在线观看网站| 久久精品国产亚洲av天美| 国产亚洲91精品色在线| 国产伦理片在线播放av一区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 免费观看在线日韩| 亚洲四区av| ponron亚洲| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美bdsm另类| 丝袜喷水一区| 乱人视频在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产老妇女一区| 99久国产av精品国产电影| 国产免费一级a男人的天堂| 国产视频内射| 草草在线视频免费看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 精品午夜福利在线看| 波多野结衣巨乳人妻| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产精品不卡视频一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 在线天堂最新版资源| 久久国内精品自在自线图片| 午夜福利高清视频| 午夜激情福利司机影院| 91aial.com中文字幕在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 午夜福利视频精品| 高清午夜精品一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 午夜日本视频在线| av线在线观看网站| 国产精品一区二区三区四区久久|