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    TLR9、MyD88及NF-κB在過敏性紫癜中的表達(dá)及意義

    2016-12-22 02:52:01王子威楊麗君
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年29期
    關(guān)鍵詞:白介素信號研究

    王子威 楊麗君

    首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科,北京100050

    TLR9、MyD88及NF-κB在過敏性紫癜中的表達(dá)及意義

    王子威楊麗君

    首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科,北京100050

    目的探討免疫上游因子TLR9、MyD88、NF-κB及免疫下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α在HSP組與正常對照組間的差異及相關(guān)性。方法采用實時熒光定量PCR檢測HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)量,ELISA法檢測血漿IL-6、TNF-α水平。結(jié)果①HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)均顯著高于正常對照組;②HSP組血漿IL-6、TNF-α水平較對照組水平顯著增高;③HSP組中TLR9與MyD88、TLR9與NF-κB、MyD88與NF-κB、NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α均存在線性正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論HSP患兒TLR9、MyD88、NF-κB、IL-6、TNF-α水平均較正常兒童顯著升高。TLR9-MyD88-NF-κB信號通路參與HSP發(fā)病,并在其中起重要作用。

    過敏性紫癜;Toll樣受體9;髓樣分化因子88;核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B;白介素6;腫瘤壞死因子α

    過敏性紫癜(henoch-schonlein purpura,HSP)是兒童時期最常見的免疫系統(tǒng)疾病,本病以小血管炎癥為主要病變,好發(fā)于3~10歲兒童,常累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)、腎臟等多個系統(tǒng),其發(fā)病率呈逐年增多趨勢,臨床上無有效的治療措施及控制其進(jìn)展的有力手段,近年來,人們努力尋找HSP發(fā)生的上游機制,隨著Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)等模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)深入研究,人們發(fā)現(xiàn)這種形式讓機體不但可以發(fā)現(xiàn)入侵的病原體,而且能夠識別其類型,并通過一系列信號途徑活化效應(yīng)分子,從而控制并清除病原體。目前研究發(fā)現(xiàn)由Toll樣受體9(Toll like receptor 9,TLR9)-髓系分化因子(myeloid differentiation factors 88,MyD88)-核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通道介導(dǎo)下游細(xì)胞因子如血清白介素6(Interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)釋放發(fā)揮免疫應(yīng)答,因此信號通道TLR9-MyD88-NF-κB在免疫識別、激活、效應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    1 資料與方法

    1.1一般資料

    選取2015年3月~2016年3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院門診及住院急性期HSP患兒40例作為研究對象,另選取我院兒童保健科健康體檢兒童35例作為正常對照組。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡<14歲;②均為初診初次發(fā)病,病程在3 d內(nèi)且未接受治療者;③HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照諸福棠《實用兒科學(xué)》第7版[1];④近1個月內(nèi)無感染及過敏性疾病史,未使用過激素及免疫抑制劑。對照組:選取同期在本院體檢的正常健康兒童。本研究取得入選對象監(jiān)護(hù)人知情同意并獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。HSP組男21例,女19例,年齡3~12歲,平均(7.4±2.9)歲,對照組男18例,女17例,年齡3~11歲,平均(7.6±2.7)歲。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2方法

    實時熒光定量(real-time quantitative RT-PCR)檢測:采集研究對象的組織,采用Trizol抽提法提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)說明書合成cDNA。引物的設(shè)計使用Oligo 6.0設(shè)計軟件設(shè)計,由上海生物工程有限公司合成,引物序列及擴增長度詳見下圖。RT-PCR使用TAKARA公司的SybergreenIMix試劑盒,反應(yīng)條件為:94℃5 min,94℃15 s,58℃15 s,72℃15 s,共35個循環(huán),擴增反應(yīng)完成后又進(jìn)行了溶解曲線的制作,確保擴增的特異性。

    引物序列如下:

    TRL9引物序列:

    上游:5’-GGGACCTCGAGTGTGAAGCA-3’199

    下游:5’-CTGGAGCTCACAGGGTAGGAA-3’

    MyD88引物序列:

    上游:5’-GCACATGGGCACATACAGAC-3’239

    下游:5’-TGGGTCCTTTCCAGAGTTTG-3’

    NF-κB引物序列:

    上游:5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’197

    下游:5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’

    β-actin引物序列:

    上游:5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’111

    下游:5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’

    血清IL-6、TNF-α由第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供ELISA試劑盒測定。敏感度為100μg/L,酶標(biāo)儀MicroplateReader為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品,在450 nm處讀出吸光度(A)值,操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗后,滿足正態(tài)分布的計量資料以(±s)表示,計量資料組間比較采用t檢驗,直線相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1HSP組與正常對照組血漿IL-6與TNF-α表達(dá)水平比較

    HSP組血漿IL-6、TNF-α水平較對照組水平顯著增高,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.11、9.26,P<0.01)。見表1。

    表1 HSP組與正常對照組血漿IL-6與TNF-α水平比較(±s)

    表1 HSP組與正常對照組血漿IL-6與TNF-α水平比較(±s)

    組別n IL-6(ng/mL)TNF-α(pg/mL)HSP組正常對照組t值P值40 35 41.85±7.59 33.90±5.53 5.11 0.00 0.83±0.16 0.49±0.15 9.26 0.00

    2.2HSP組與正常對照組人外周血單個核細(xì)胞(peripheralblood mononuclearcell,PBMC)TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較

    HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)均顯著高于正常對照組,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.68、5.42、112.95,P<0.01)。見表2。

    表2 HSP組與正常對照組PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較(s)

    表2 HSP組與正常對照組PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較(s)

    ?

    2.3HSP組中TLR9與MyD88,TLR9與NF-κB,MyD88與NF-κB,NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α的相關(guān)關(guān)系

    HSP組中TLR9與MyD88,TLR9與NF-κB,MyD88與NF-κB,NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α均存在線性正相關(guān)關(guān)系。TLR9與MyD88呈正相關(guān)(r=1.00,P<0.01);TLR9與NF-κB呈正相關(guān)(r= 0.98,P<0.01);MyD88與NF-κB呈正相關(guān)(r=0.98,P<0.01);NF-κB與IL-6呈正相關(guān)(r=0.98,P<0.01);NF-κB與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.97,P<0.01)。

    3 討論

    過敏性紫癜是兒童好發(fā)的自身免疫系統(tǒng)疾病,目前發(fā)病率逐年上升,發(fā)病率約為萬分之一[2]。臨床上以非血小板減少性皮疹、腹痛、關(guān)節(jié)痛、血尿和蛋白尿為主要表現(xiàn),可分為單純皮膚型、關(guān)節(jié)型、腹型、腎型、混合型[3]。

    Toll樣受體是目前研究較多的一種模式識別受體,至少包括13個成員(TRL1-13),其中TRL1-9在人類及小鼠中均有表達(dá),在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著重要的作用,實現(xiàn)對入侵病原體的早期識別,激活天然免疫,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[4,5]。TLR9是TLRs家族中的一員,能識別細(xì)菌和病毒DNA中非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤基序(CpG-DNA),在微生物、空氣傳播的細(xì)菌、真菌、病毒病原菌感染的先天免疫中起作用。啟動炎性應(yīng)答信號通路,成為近兩年HSP研究的熱點[6]。TLR9信號通道是MyD88依賴通道[7]。

    MyD88通過一系列信號分子如:Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptorhomologous region,TIR)、白介素1受體相關(guān)蛋白激酶(IL-1 Rassociated kinase,IRAK)4、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNFR-associatedfactor 6,TRAF6)、TGF-β激酶(TGF-βactivated kinase 1,TAK1)和TAK1結(jié)合蛋白(TAK1 binding protein,TAB),最終激活NF-κB[8],促進(jìn)下游炎性因子如白介素1(Interleukin 1,IL-1)、白介素6(Interlenkin 6,IL-6)、白介素8(Interleukin 8,IL-8)、白介素12(Interleukin 12,IL-12)和TNF-α等表達(dá)。

    TLR9-MyD88-NF-κB信號通道激活后能啟動下游多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和合成[9]。大量研究發(fā)現(xiàn),包括細(xì)菌、病毒以及其他病原體的感染與HSP的發(fā)病最為密切,機體受到病原微生物感染后,激活上游TLR9-MyD88-NF-κB信號通道后,活化的NF-κB誘導(dǎo)下游多種炎癥因子和酶等基因的表達(dá),介導(dǎo)瀑鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)的形成、發(fā)展及惡化。國外Maria E等[10]通過研究63例HSP患兒與50例正常兒童外周血單核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在HSP患兒外周血中TLR9 mRNA表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組。Coppo R等[11]研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒中TLR9基因和蛋白表達(dá)較正常組均顯著升高,故推測TLR9信號通路介導(dǎo)HAP異常免疫反應(yīng)。Alper S等[12]發(fā)現(xiàn)TLRs通過IL-1和NF-κB途徑引起炎癥反應(yīng)。TLR信號通路的上調(diào)還與腎臟疾病有關(guān),在國外一項HSP研究中,野生型C57BL/6實驗鼠和TLR缺失型實驗鼠同時接種同等劑量的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),野生型C57BL/6實驗鼠發(fā)生嚴(yán)重過敏性紫癜腎炎,表現(xiàn)為腎小球血栓,新月體形成和腎小球巨噬細(xì)胞浸潤,而TLR缺失型實驗鼠卻未發(fā)生過敏性紫癜腎炎,研究表明TLR信號通路在過敏性紫癜腎炎發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要作用[13]。Hong C等[14]2011~2013年將105名HSP患兒按照24 h尿蛋白量分成3組,A組診斷為HSP,但未見腎臟損傷,B組HSP伴有腎臟損傷,但無大量蛋白尿,C組HSP伴有腎臟損傷,合并大量蛋白尿,同時以35例健康兒童作為健康組,研究發(fā)現(xiàn)C組患兒TLR9 mRNA和蛋白表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組,同時比A、B組均高,研究還發(fā)現(xiàn)TLR9表達(dá)與24 h尿蛋白定量呈線性相關(guān)關(guān)系。這個結(jié)論與Maria E[10]得出在成人中,TLRs表達(dá)與蛋白尿的量有很明顯的相關(guān)性的結(jié)論,高度一致。故本研究推測TLR4異常激活與HSPN發(fā)生有密切相關(guān)。目前越來越多的研究表明TLR信號通路參與了HSP發(fā)病的過程[15-18]。因此HSP的發(fā)病與TLR9-MyD88-NF-κB信號通道密切相關(guān)。TNF-α和IL-6均屬于免疫下游細(xì)胞因子,研究表明NF-κB是其上游的調(diào)控點。

    本實驗發(fā)現(xiàn)HSP組患兒TLR9、MyD88、NF-κB均比正常對照組患兒明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,三者間經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析具有線性正相關(guān)關(guān)系,說明HSP患兒因內(nèi)源性或外源性因素機體免疫上游的TLR9、MyD88、NF-κB被激活,同時我們也檢測到免疫下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α在HSP組比正常對照組明顯升高,且與上游的TLR9、MyD88、NF-κB存在線性正相關(guān)關(guān)系。因此在HSP發(fā)病過程中,TLR9-MyD88-NF-κB信號通道作為上游信號受到外界刺激被活化后,繼而引起下游炎癥介質(zhì),包括自由基,細(xì)胞因子,前列腺素類和補體級聯(lián)反應(yīng),打破機體的免疫耐受,導(dǎo)致HSP的發(fā)病。

    因此如果對免疫反應(yīng)上游的TLR9或MyD88進(jìn)行干預(yù),是否可減輕HSP癥狀或進(jìn)行早期預(yù)防,這將是我們下一步研究的重點。

    [1]胡亞美,江載芳.諸福棠實用兒科學(xué)[M].第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:689-690.

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    Expression and significance of TLR9,MyD88 and NF-κB in HSP

    WANG Ziwei YANG Lijun
    Department of Pediatrics,Beijing Friendship Hospital Affiliated to Beijing Capital University,Beijing 100050,China

    Objective To investigate the differences and correlations of immunological upstream factors of TLR9, MyD88,NF-κB and immunological downstream factors of IL-6 and TNF-αin the HSP group and normal control group.Methods The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of HSP were detected by real-time PCR.The levels of IL-6 and TNF-αwere measured by ELISA.Results①The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB mRNA in peripheral blood mononuclear cells of children with HSP was significantly higher than that of normalcontrols;②The levels of IL-6 and TNF-αin plasma of HSP group were significantly higher than those in the control group;③There was a positive linear correlation between TLR9 and MyD88,TLR9 and NF-κB, MyD88 and NF-κB,NF-κB and IL-6,NF-κB and TNF-αin HSP group.Conclusion The levels of TLR9,MyD88, NF-κB,IL-6 and TNF-αin children with HSP are significantly higher than those in normal children.TLR9-MyD88-NF-κB signal pathways play an important role in the pathogenesis of HSP.

    HSP;TLR9;MyD88;NF-κB;IL-6;TNF-α

    R554.6

    A

    1673-9701(2016)29-0009-04

    (2016-08-07)

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