生物敏感MRI造影劑的研究新進展

劉云，張蕾磊，胡海宇，姚慶強

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生物敏感MRI造影劑的研究新進展

劉云，張蕾磊，胡海宇，姚慶強

磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以其非侵入性，無輻射損傷，無骨質偽影，安全性好，空間分辨率和對比度高，可向任意方位斷層掃描等技術靈活性，成為了臨床醫(yī)學診斷的重要手段。但是，某些不同組織或腫瘤組織的弛豫時間差別較小，成像時很難獲得足夠的信號差，造成 MRI 診斷困難，不能進行動態(tài)掃描和測定器官的功能等缺陷，因此需在被檢測對象中加入一類能改變氫質子弛豫時間的物質來提高磁共振成像的敏感性和分辨率，這種物質被稱為磁共振成像造影劑。臨床上 50% 以上的磁共振掃描需要用造影劑來增強成像對比度。

MRI 造影劑主要是一些順磁性或超順磁性物質，通過縮短體內局部質子弛豫時間（加快弛豫速率），提高正常部位與患病部位的成像對比度，從而顯示體內器官的功能狀態(tài)。根據(jù)弛豫理論和 SBM（Solomon-Bloembergen-Morgan）方程[1]可知，影響造影劑弛豫速率的主要因素包括配位水分子數(shù)目（）、配位水分子交換速率（τM）和配合物旋轉相關時間（τR）。因此，提高造影劑的弛豫效率可通過增加化合物配位水分子的數(shù)目，提高配位水分子的交換速率以及延長配合物的旋轉相關時間來實現(xiàn)。

自 1988 年第一個 MRI 造影劑釓-二乙三胺五乙酸（Gd-DTPA）投入市場以來，研究者對 MRI 造影劑進行了更加深入的研究，以提高磁共振成像的靈敏度、對比度和特異性。目前應用于臨床 MRI 診斷的造影劑多數(shù)為非特異性造影劑，屬于胞外試劑，僅局限于解剖學特征的增強，無法檢測生物體內的生化過程。因此，研發(fā)一類智能型或生物敏感型 MRI 造影劑是當前的發(fā)展熱點，這類造影劑的弛豫率受生理條件或活動的調節(jié)，比如酶、金屬離子濃度、pH 值、溫度等，并對生理環(huán)境的改變做出相應的改變，因而能夠用來監(jiān)測生物體內的生理和新陳代謝過程[2-3]。研究表明，智能型 MRI 造影劑不僅能夠提高 MRI 對病變的檢測靈敏度，而且能夠針對病變的信號分子進行分子成像，從而實現(xiàn)對生物活性分子、生理變化和其他分子進行功能性檢測與成像。

1 酶激活造影劑

臨床上，多種疾病都伴隨著酶含量和活性的改變，通過設計合成一類酶激活造影劑可以檢測特定酶的活性及分布進而判斷疾病的狀態(tài)，其設計思路是：將造影劑與某些酶底物基團相連，此時造影劑處于“磁共振靜默”狀態(tài)，即弛豫效能較低，成像較弱，而當病變或者生理環(huán)境改變使特定的酶生成時，酶的裂解作用導致相關基團離去，使造影劑的弛豫效能大大增加，成像對比度增強。因此發(fā)展酶激活的 MRI 造影劑無損傷地檢測體內酶活性和分布對于疾病的診斷具有重要意義。

Meade 課題組最先合成了一類酶激活造影劑，即由β-半乳糖修飾的釓配合物-Egad Me 類化合物，在 β-半乳糖水解酶（GAL）存在時，β-半乳糖基團被水解離去，此時水分子參與配位，使得弛豫率有了較大的提高[4-5]（圖 1A）。臨床上可利用該造影劑檢測尿中 GAL 的活性，進而用于腎小管早期損傷的診斷。Chen 等[6]報道了一種對 β-葡糖苷酸酶敏感的造影劑 [Gd(DOTA-FPβGu)]（圖 1B），其結構是由 Gd 配合物和 β-葡糖苷酸酶底物（β-D-葡糖醛酸）兩部分構成。β-葡糖苷酸酶是一種關鍵的溶酶體酶，其在腫瘤壞死中過表達。在 β-葡糖苷酸酶和人血清白蛋白（HSA）存在時，其弛豫效能顯著升高，且弛豫率的改變與 β-葡糖苷酸酶的濃度有關。另外，該造影劑在動物腫瘤模型中成像較好，能被用于腫瘤組織中 β-葡糖苷酸酶活性的檢測，從而有效診斷和治療癌癥。

B

Giardiello 等[7]開發(fā)了一類 Gd-大環(huán)多胺造影劑，該造影劑能被酯酶激活，其結構中帶有 3 個乙酰氧甲基，理論內層配位水分子數(shù)目為 2，但由于體內血清中含有豐富的 HCO3-等陰離子，與配合物有高度的親和力，阻止了水分子和 Gd 的配位。當造影劑進入細胞內，結構中的乙酰氧甲酯被細胞內酯酶裂解成帶有 3 個負電荷的配合物，抑制碳酸鹽的配位，從而使內部水分子能與 Gd 配位，配位水分子數(shù)目從 0 增加到 2，且弛豫率增加 84%（圖 2），可作為潛在的細胞 MRI 造影劑。

q = 0 q = 2

Aswendt 等[8]報道了一種對神經元中的谷氨酸脫羧酶（GAD）敏感的 MRI 造影劑Gd-DO3A-GAD（圖 3）。當 GAD 存在時，結構中已配位的谷氨酸基團被裂解，使得 Gd 中心能與水分子發(fā)生配位，其弛豫率增加。此外，被裂解的谷氨酸基團能生成一種帶正電荷的化合物，與帶負電荷的大分子發(fā)生靜電相互作用，從而使弛豫率進一步增加。因此，該造影劑能夠用于診斷和治療腦疾病，如中風或亨廷頓舞蹈癥。

Ye 等[9]設計合成了一類半胱天冬酶（細胞凋亡蛋白酶）激活的 Gd-造影劑 C-SNAM（圖 4），用于成像藥物誘發(fā)的細胞凋亡。該結構由一個 2-氰基-6-羥基喹啉（CHQ）、一個 D-半胱氨酸殘基、DEVD 肽、去掉二硫鍵的細胞內谷胱甘肽（GSH）和 Gd-DOTA 單酰胺螯合物組成。半胱天冬酶存在時，造影劑發(fā)生生物相容性分子內環(huán)合，隨后自我組裝成 Gd-納米顆粒（GdNPs），其弛豫率從 10.2 L/(mmol·s) 增加到19.0 L/(mmol·s)，增加了 86%，且保留時間延長，能被用于體內腫瘤細胞凋亡的高分辨成像。

圖 3 谷氨酸脫羧酶激活的 MRI 造影劑Gd-DO3A-GAD

圖 4 半胱天冬酶激活的 Gd-造影劑 C-SNAM

Rolla 等[10]設計合成了一種對酪氨酸酶敏感的 Mn 類造影劑，在氨基羧酸位置引入 L-酪氨酸殘基，其配體分別為 L1、L2和 L3（圖 5）。酪氨酸酶是在黑素瘤癌細胞中過表達的一種氧化還原酶。在酪氨酸酶的作用下，MnL1和 MnL2不斷釋放 Mn2+離子，MnL3生成一種低聚物，使其弛豫速率大大提高。另外，Mn2+還可與蛋白質產生相互作用，使弛豫率進一步得到提高。結果顯示，MnL1、MnL2和MnL3的弛豫率分別提高了 50%、200%、250%。因此，這類造影劑可作為診斷探針用于檢測黑色素瘤。

L1 L2 L3

近年來，一種新型的化學交換飽和轉移（CEST）MRI 造影劑逐漸發(fā)展起來。此類造影劑帶有不穩(wěn)定的質子，能夠選擇性飽和，使得 MRI 信號快速消失，這種質子能夠與水分子交換，將飽和的質子轉移到水分子中，從而降低水分子的信號（T1 和 T2）產生陰性對比[11]。

Li 等[12]報道了一類能檢測酯酶活性的 PARACEST 造影劑 Yb-(DO3A-oAA-TML-ester)，該配合物結構中的內酯基團被酯酶水解，后觸發(fā)分子發(fā)生內酯化，導致酰胺鍵斷裂變?yōu)榘被?，進而產生 CEST 效應（圖 6A）。最近，F(xiàn)ernández-Cuervo 等[13]開發(fā)出一類能同時檢測兩種酶（硫酸酯酶和酯酶）活性的抗磁性化學交換飽和轉移（DIACEST）造影劑（圖 6B），來提高疾病診斷的特異性。該造影劑能被硫酸酯酶和酯酶裂解，釋放出能被 CEST MRI 探測到的水楊酸，且該造影劑必須被這兩種酶激活才能產生響應，缺乏任何一種酶都很穩(wěn)定。這些結果證實開發(fā)這類造影劑可以作為一種平臺技術用于設計能檢測酶活性的造影劑。

2 金屬離子敏感造影劑

在生命活動中，許多金屬離子如 Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+/Fe3+等在生物體內發(fā)揮著重要作用和功能。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)金屬離子與各種疾病狀態(tài)密切相關，因此研究對生物體內某些金屬離子敏感的造影劑成為一個新的研究領域，逐漸應用于多種疾病的診斷。

Li 等[14]報道了第一個鈣敏感造影劑 Gd-DOPTA。當 Ca2+存在時，Ca2+取代Gd3+與 BAPTA 中的羧基發(fā)生配位，使得水分子能與 Gd3+配位，從而提高配合物的弛豫效能（圖 7）。最近，Tanwar 等[15]設計合成了一種對 Ca2+有高度選擇性的造影劑Gd-DO3A-AME-NPHE（圖 7），其結構由一個 Gd-DO3A 中心與亞氨基醋酸酯結合組成。在 Ca2+存在時，其內層配位水分子數(shù)由 0.2 增加到 1.05，弛豫率增加了 60%。結果表明，該結構對 Ca2+具有高度選擇性，而對其他金屬離子（K+、Na+、Mg2+、Zn2+）不敏感。為實現(xiàn)體內中樞神經系統(tǒng) Ca2+通量的可視化，MacRenaris 等[16]報道了一類細胞酯酶激活的 Ca2+敏感造影劑 DOPTA-Ethyl-Gd（圖 7）。結構中 BAPTA 的羧基通過酯化被保護起來，既增加了親脂性和細胞滲透性，同時避免了與細胞外 Ca2+的結合。當造影劑進入細胞后，其內源性酯酶裂解酯基，暴露羧基與細胞內 Ca2+結合，使水分子與 Gd3+配位，增加造影劑的弛豫率。該類造影劑能夠區(qū)別細胞內外的 Ca2+，可用于診斷癲癇或缺血的 Ca2+成像。Gündüz 等[17]研發(fā)了一種新型樹枝狀 Ca2+敏感造影劑 DSCA（圖 7）。該造影劑由單體類似物制備而成，延緩了其在體內中樞神經系統(tǒng)的擴散速率，增強弛豫效能，同時保持了活性和生物敏感性，在大鼠大腦皮層中樹枝狀造影劑的擴散性能比其單體類似物更好，成像對比度更高。因此，在生物功能動態(tài) MRI 應用中，體內緩慢擴散的造影劑具有更大的優(yōu)勢，實現(xiàn)神經元活動的鈣信號可視化，有助于深入了解大腦功能。

最近，Pope 和Laye[18]合成了一種 Eu-DO3A鋅敏感造影劑，將二吡啶甲基氨基甲基-吡啶基團連接到 DO3A 上，并與水化狀態(tài)= 0.2 的金屬中心結合。Zn2+存在時，二吡啶甲基氨基甲基-吡啶基團會與 Zn2+結合，使水分子能以= 2 的水化狀態(tài)與 Eu 配位。在生理 pH 條件下的水環(huán)境中，該復合物對 Zn2+有選擇性，且弛豫效能會發(fā)生明顯的變化。Regueiro-figueroa 等[19]研發(fā)了一類對 Zn2+有選擇性的 MRI 造影劑，其配體為 DO3A-NO2A（圖 8），將 Gd-DO3A 配合物通過 N-丙基乙酰胺與 NO2A 部分相連。當 1:1 加入 Zn2+時，N-丙基乙酰胺部分能與 Zn2+結合，引發(fā)水分子與 Gd3+配位，弛豫率從 3 L/(mmol·s) 增加到 7.5 L/(mmol·s)，增加了 150%。另外，Ca2+和 Mg2+有非常微弱的弛豫改變，證明該造影劑對 Zn2+敏感性強。為增強 MRI 檢測靈敏度，Yu 等[20]設計出一種新型的對 Zn2+敏感的造影劑 GdDOTA-diBPEN（圖 8），該造影劑具有完善的水交換性能，通過提高內外層水分子的交換率，顯著增強其縱向弛豫效能，從而提高 MRI 的檢測靈敏度。在 Zn2+與人血清白蛋白（HSA）存在時，結合表現(xiàn)出非常高的縱向弛豫率。且體內實驗證明，在小鼠體內的葡萄糖刺激胰腺分泌胰島素時，Zn2+釋放，這種新型的高弛豫造影劑能成功用于體內 Zn2+成像。

AB

Gd-DOPTA Gd-DO3A-AME-NPHE

DOPTA-Ethyl-Gd

DSCA

DO3A-NO2A GdDOTA-diBPEN

Que 等[21]報道了一系列 CG2 類銅敏感造影劑，結構中 DOTA 的一個側鏈被連有銅結合部位-硫醚的吡啶基所取代。在銅離子存在時，其水化狀態(tài)從 1 增加到 2，弛豫率從1.5 L/(mmol·s) 增加到 6.9 L/(mmol·s)（圖 9），且隨著銅結合部位所含硫原子的數(shù)目逐漸增加，造影劑對銅離子的選擇性越強。后來，Que 課題組[22]設計合成了一種細胞滲透性 Cu+敏感造影劑 Arg8CG2（圖 9），即在 CG2 上再加上一個聚精氨酸附屬物 Arg8（促進細胞吸收）。與上述報道的 CG2 類造影劑相比，無 Cu+時，Arg8CG2 的弛豫率就明顯高于前體復合物 CG2，這可能是由于大分子的穿膜基團 Arg8增加了其旋轉相關時間（τR），以及精氨酸殘基上多余的氫鍵基團增加了第二層水分子的配位；加入 Cu+后，1弛豫率增加了 220%，對 Cu+有高度選擇性。以 Menkes 綜合征細胞模型進行弛豫率測定和 T1 加權成像，證明 Arg8CG2 可以區(qū)分疾病模型中正常和異常的銅轉運蛋白，因此能適用于體內銅離子異常的疾病成像診斷，逐漸應用于多種動物模型影像學研究。Xiao 等[23]研發(fā)出一類對 Cu2+高度敏感的 MRI 造影劑 Gd2(DO3A)2BMPNA（圖 9），包括兩個Gd-DO3A 中心和一個 BMPNA 基團。當 Cu2+存在時，原吡唑環(huán)上與 Gd3+配位的 N 原子被內層水分子取代，Cu2+與該 N 原子結合，弛豫率從 6.40 L/(mmol·s) 增加到 11.28 L/(mmol·s)。與其他生物相關的金屬離子相比，該復合物對 Cu2+具有較高的選擇性，可用于體內分子成像。

3 pH 敏感造影劑

理想的 pH 敏感造影劑不僅能夠對病變部位進行特異性增強成像，提高 MRI 檢測疾病的靈敏度，而且可通過檢測病變組織中的 pH 變化，為疾病的診斷提供依據(jù)。這類造影劑能夠在特定的 pH 條件下產生弛豫率的變化，這種變化與金屬中心周圍水化狀態(tài)的改變有關。在體內不同細胞和組織的 pH 不同，正常細胞外介質的 pH 為 7.4，而癌細胞外的 pH 為 6.8，因此，pKa值在 7 左右的造影劑可提高腫瘤成像的對比度，進而用于體內癌細胞的成像。

Woods 等[24]報道了一類含有硝基酚側鏈的 Gd-DO3A 螯合物，其配體分別為NP-DO3A和NP-DO3AM（圖 10）。研究表明，兩者都對 pH 敏感，但作用機制不同。Gd(NP-DO3A) 由于硝基酚側鏈的解離，弛豫效能從 pH 9 時的 4.1 L/(mmol·s) 增加到 pH 5 時的 7.0 L/(mmol·s)，且不受內源性離子的影響；而以酰胺基取代醋酸的 Gd(NP-DO3AM)，其減弱的給電子能力使 Gd 缺電子難以釋放硝基酚，即在較低的 pH 下酚醛質子與水分子間的質子交換率增加。

Frullano 等[25]合成了一類 MR-PET 雙模造影劑GdDOTA-4AMP-F（圖 10）。該造影劑在水溶液中以高電荷親水性的 GdDOTA-4AMP 配合物與 F 原子（18F或19F）結合，能在 MRI 中定量監(jiān)測 pH。在等滲鹽溶液中測定時，當 pH 從 8.5 降到 6.0 時，弛豫率從 3.9 L/(mmol·s) 增加到 7.4 L/(mmol·s)，增加了 90%；在兔血漿中測定時，弛豫率變化類似，說明在體內即使有蛋白質結合，該造影劑仍然有效。這種雙模式智能 MRI 探針的弛豫變化與生理環(huán)境改變成比例，在檢測 pH 值的同時可以直接量化。

Gianolio 等[26]報道了一類新的 MRI/SPECT雙模造影劑，Gd(III)-L和 Ho(III)-L螯合物（圖 10）。這兩個造影劑結構僅僅是鑭系離子不同，其中 Gd(III) 作為 MRI 活性部位，Ho(III) 作為 SPECT 活性部位。研究表明，在 pH由 8 降低到 5 時，Gd(III)-L 結構中磺酰胺基團發(fā)生質子化，與 Gd配位的 N 原子被水分子取代，弛豫率增加了 200%；而Ho(III)-L 的磁性特征使它成為位移試劑而非弛豫試劑，用來檢測造影劑的濃度。兩者在體內有相同的生物分布，其混合物即可作為一個雙模 MRI/SPECT 探針。這一研究證明基于兩個“化學等價”的鑭系（III）配合物設計合成出一種對 pH 敏感的 MRI/SPECT 雙模試劑是可行的，通過合理設計 L 配體的結構，可以滿足不同的臨床應用，如檢測酶活性或代謝產物的濃度。

最近，Bhuiyan 等[27]報道了一類基于樹枝狀聚合物的pH 敏感造影劑(GdDOTA-4AmP5-)44-G5（圖 10），在G5-PAMAM 樹狀大分子表面通過異硫氰基連接 44 個 GdDOTA-4AmP5-螯合物，這種新化合物能降低表面負電荷，具有更高的生物相容性，更易與藥物結合，從而提高其診斷潛力。當 pH 從 8.84 變?yōu)?6.35 時，配合物周圍的磷酸基團質子化，使每個 Gd3+離子的縱向弛豫率從7.91 L/(mmol·s) 增加到 9.65 L/(mmol·s)，平均縱向弛豫率（在每個分子的基礎上減慢分子轉動時間）也從348 L/(mmol·s) 增加到 425 L/(mmol·s)，且其弛豫率比值 R2/R1與 pH 值呈線性相關，因此，我們期待通過測定 R2/R1的比值來確定腫瘤的 pH 值。

NP-DO3A NP-DO3AM GdDOTA-4AMP-F

Ln = Gd(III)MRI report (GdDOTA-4AmP5-)44-G5

Ho(III)SPECT tracer

圖 10 pH 敏感造影劑

4 溫度敏感造影劑

熱敏脂質體（thermosensitive liposome，TSL）是一種常用的靶向抗腫瘤藥物載體，與熱療聯(lián)合應用時可使腫瘤藥物選擇性地蓄積在腫瘤部位，增加對腫瘤細胞的殺傷作用，降低毒副作用，實現(xiàn)局部化療，同時載入 MRI 造影劑，可用于體內溫控藥物傳遞過程的 MRI 監(jiān)測。de Smet 等[28]開發(fā)了一種新型脂質體類溫度敏感造影劑，是將一種化療藥物阿霉素與 Gd-造影劑[Gd(HPDO3A)(H2O)] 共同載入脂質體內（圖 11）。結果顯示，在體內正常溫度 37 ℃下，載有藥物的脂質體能夠穩(wěn)定存在，當溫度升高到 41 ~ 42 ℃時，脂質體內的阿霉素與[Gd(HPDO3A)(H2O)] 迅速釋放，提高了造影劑的水分子交換速率，降低 T1 弛豫時間，從而在特定靶部位發(fā)揮藥效。這種結合化療藥物與造影劑的熱敏脂質體將作為一個重要工具用于監(jiān)測和控制體內藥物釋放過程，具有良好的應用前景。

阿霉素 [Gd(HPDO3A)(H2O)]

劉瑞清等[29]研發(fā)了一種對溫度和 pH 敏感的多功能高分子 Gd-造影劑 TPRPP，以N-異丙基丙烯酰胺為溫度敏感單體，甲基丙烯酸為 pH 敏感單體，與三丙烯酸菲洛啉釓進行無皂乳液聚合。研究表明，TPRPP 的粒徑易受溫度或 pH 值的影響，有較好的溫度和 pH 敏感性；其橫向弛豫率約為 11.3 L/(mmol·s)，為臨床造影劑 Magnevist 的 2.6 倍，在肝和脾中具有明顯的成像增強。TPRPP 以其低細胞毒性、高穩(wěn)定性和較高的弛豫率成為一種潛在的多功能 MRI 診斷試劑，為今后合成多功能 MRI 造影劑提供了新的選擇。

5 其他生物敏感造影劑

除上述酶、金屬離子、pH、溫度敏感造影劑，其他生物小分子如氧、葡萄糖、一氧化氮等也能用來作為響應信號開發(fā)出生物敏感造影劑。缺氧發(fā)生在各種疾病狀態(tài)中，如癌癥、缺血、急性和慢性血管性疾病。Iwaki 等[30]設計合成出第一類帶有硝基苯磺酰胺基團的缺氧敏感造影劑 SAGds（圖 12），如 4NO22MeOSAGd。大鼠肝微粒體在缺氧條件下，4NO22MeOSAGd中的硝基可選擇性還原為胺，芳基磺酰胺基團 pKa 值發(fā)生變化，水的交換速率增大，弛豫率增加到原來的 1.8 倍。4NO22MeOSAGd 是第一個1H-MRI造影劑，可在生理條件下選擇性地檢測缺氧。此外，研究者還開發(fā)了與葡萄糖結合后化學交換速率會發(fā)生改變[31]，或與 N-亞硝基中間體（一氧化氮氧化態(tài)）結合后酰胺和氨基質子會發(fā)生轉變[32-33]的可逆響應順磁性化學交換飽和轉移（PARACEST）MRI 造影劑，為體內葡萄糖和一氧化氮分子的成像檢測提供了新的方向。

4NO22MeOSAGd 4NH22MeOSAGd

6 結語

近年來，隨著 MRI 新技術的迅速發(fā)展及其在臨床醫(yī)學上的廣泛應用，智能 MRI 造影劑在提高生物成像的敏感性和分辨率方面發(fā)揮著極為重要的作用，有望滿足不同的生物醫(yī)學研究和臨床需求。綜上所述，基于生物敏感的 MRI 造影劑的研究目前還是一個新興的領域，為分子影像醫(yī)學帶來了很大的突破，為疾病的診斷治療提供了更好的平臺技術，但理想的生物敏感造影劑不僅僅靠化學領域合成，還需對其進行跨學科多領域更深入系統(tǒng)的研究。此外，在對各種復雜疾病進行診斷時僅靠 MRI 難以提供更全面的信息，需要將其與其他成像技術，如 CT 成像、超聲成像等聯(lián)合運用。生物敏感 MRI 造影劑的研究仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，在醫(yī)學診斷領域仍有廣闊的應用前景。開發(fā)具有靶向性、弛豫率高、用藥量少、毒副作用小、成本低且對生理生化信號有更高敏感程度的多功能新一代 MRI 造影劑成為今后研究的主要方向。

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協(xié)和青年科研基金（3332016056）

250022 濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院（劉云）；250062 濟南，山東省醫(yī)學科學院藥物研究所（劉云、姚慶強）；100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所（張蕾磊、胡海宇）

姚慶強，Email：yao_imm@163.com；胡海宇，Email：haiyu.hu@imm.ac.cn

2016-09-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.06.011