MicroRNA—22—3p在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

王江峰++陳晟++凌志強(qiáng)

[摘要] 目的 探討MicroRNA-22-3p（miR-22-3p）在食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）組織中的表達(dá)情況，并分析miR-22-3p與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系。 方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（qPCR）檢測miR-22-3p在77例ESCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異及其與食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 miR-22-3p不同程度高表達(dá)36.4%（28/77），正常表達(dá)20.8%（16/77），低表達(dá)42.8%（33/77）。miR-22-3p相對(duì)高表達(dá)的患者無病生存期較非高表達(dá)患者長（P<0.05），但miR-22-3p的表達(dá)水平與臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤家族史、吸煙和飲酒）之間均無相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論 miR-22-3p在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起著抑癌因子的作用，其高表達(dá)能延長食管癌患者的生存時(shí)間。

[關(guān)鍵詞] miR-22-3p；食管鱗狀細(xì)胞癌；無病生存期；抑癌因子

[中圖分類號(hào)] R735.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）27-0001-04

腫瘤是發(fā)達(dá)國家中最主要的死亡原因，在發(fā)展中國家位居第二。食管癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)位居第六[1]。鱗狀細(xì)胞癌和腺癌是食管癌的主要病理類型，鱗狀細(xì)胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分為腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鱗狀細(xì)胞癌確診往往已屬晚期，侵襲和轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后不佳。目前仍未發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌高度特異性標(biāo)記物，因此早期診斷食管鱗狀細(xì)胞癌十分困難[3]。微小RNA（microRNA）是一類22nt左右片段大小的、具有高度組織特異性的非編碼RNA，對(duì)確診腫瘤的病理類型和起源具有潛在意義[4]。Real-Time PCR可檢測食管鱗狀細(xì)胞癌患者組織中miR-22-3p的相對(duì)表達(dá)情況，分析miR-22-3p與食管鱗狀細(xì)胞癌的病理特征和患者預(yù)后之間的關(guān)系。本文主要研究miR-22-3p的相對(duì)表達(dá)情況對(duì)食管癌的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的作用及預(yù)測功能，為食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移潛能和患者預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集77例ESCC組織及癌旁正常組織，病例來自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手術(shù)后組織標(biāo)本（病理科明確診斷食管鱗癌），女7例，男70例，年齡46～81歲，平均64.4歲。術(shù)前未經(jīng)任何放化療，排除自身免疫性疾病及嚴(yán)重感染性疾病。癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5 cm外區(qū)域肉眼下正常食管組織；術(shù)后標(biāo)本立即保存于液氮中，并轉(zhuǎn)移至浙江省腫瘤研究所，提取總RNA，轉(zhuǎn)錄cDNA后保存于-80℃冰箱待實(shí)驗(yàn)用。組織標(biāo)本TNM分期和分級(jí)：高/中分化55例，低分化22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，電話隨訪患者，隨訪截止時(shí)間設(shè)定為2013年3月25日。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒為Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR 081A）real-time PCR試劑盒均購于TaKaRa公司。實(shí)驗(yàn)引物（上海捷瑞）：miR-22-3p：5-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3，U6：5-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取總RNA 腫瘤組織及對(duì)應(yīng)正常組織的總RNA按照MirNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取，總RNA的濃度和純度由紫外分光光度計(jì)檢測：A260/A 280范圍在1.8～2.1間的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄RNA 將上述提取總RNA（1 μg）按說明書提供的反應(yīng)條件設(shè)置溫度，在PCR儀上進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.3 cDNA擴(kuò)增 ABI 7500PCR儀（Applied Biosystems）分析RT-PCR的PCR擴(kuò)增及溶解曲線。反應(yīng)體系20 μL，具體操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書步驟。PCR反應(yīng)過程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。PCR溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。設(shè)復(fù)孔3個(gè)取均值計(jì)算。按2-△△CT法分析結(jié)果：△CT=Ct（miR-22-3p）- Ct（U6）；按△△CT=△CT（癌組織）-△CT（癌旁正常組織）計(jì)算miR-22-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中相對(duì)表達(dá)情況，表達(dá)下降：△△CT>1；表達(dá)正常：-1≤△△CT≤1；表達(dá)升高：△△CT<-1，設(shè)定癌旁正常組織miR-22-3p相對(duì)平均表達(dá)量為1，其余組表達(dá)量為2-△△CT計(jì)算，最終計(jì)算相對(duì)改變倍數(shù)。將所有樣本分為高表達(dá)組和非高表達(dá)組，將臨床病理特征設(shè)定為1或者0，并統(tǒng)計(jì)各組別例數(shù)，χ2檢驗(yàn)計(jì)算兩組別例數(shù)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。電話隨訪計(jì)算各例患者的生存時(shí)間（月），根據(jù)分組情況采用乘積極限法（Kaplan-Meier）進(jìn)行單因素生存分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用單因素ANOVA比較各組表達(dá)倍數(shù)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)比較各組表達(dá)情況和臨床病理特征關(guān)系；采用乘積極限法（Kaplan-Meier）進(jìn)行單因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-22-3p相對(duì)表達(dá)比較

miR-22-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌組織相對(duì)癌旁正常組織高表達(dá)28例（36.4%），相對(duì)正常表達(dá)16例（20.8%），相對(duì)低表達(dá)33例（42.8%）。設(shè)定正常組織miR-22-3p相對(duì)平均表達(dá)量為1，其中高表達(dá)組食管癌的平均表達(dá)量為（16.07±5.94），正常組為（0.92±0.36），下降組為（0.13±0.03），高表達(dá)組相對(duì)表達(dá)量與正常組和下降組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組別的樣本相對(duì)表達(dá)倍數(shù)見圖1。

2.2 miR-22-3p相對(duì)表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系

miR-22-3p相對(duì)表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系通過χ2檢驗(yàn)分析：高表達(dá)組和非高表達(dá)組中miR-22-3p表達(dá)水平與臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、腫瘤家族史、TNM分期、吸煙和飲酒）之間均無顯著相關(guān)性（P>0.05），見表1。

2.3 miR-22-3p表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

按miR-22-3p相對(duì)表達(dá)情況將77例食管鱗癌患者分為高表達(dá)組和非高表達(dá)組，兩組患者的無病生存期采用K-M法分析比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高表達(dá)組相較非高表達(dá)組更具有生存優(yōu)勢（r=0.862，P=0.016），見圖2。

3 討論

最近研究[5-8]發(fā)現(xiàn)miR-22-3p在前列腺癌中高表達(dá)，而在腎細(xì)胞癌、乳腺癌、膽管癌和多發(fā)性骨髓瘤中低表達(dá)，鮮有報(bào)道m(xù)iR-22-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況和臨床意義。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-22-3p相對(duì)表達(dá)情況，分析研究miR-22-3p的相對(duì)表達(dá)情況對(duì)食管癌的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的作用及預(yù)測功能，為食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移潛能和患者預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

本研究檢測了miR-22-3p在食管鱗癌中的表達(dá)情況和臨床病理及患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明：在77例食管鱗癌組織標(biāo)本中，miR-22-3p高表達(dá)為28例，正常表達(dá)16例，低表達(dá)33例。miR-22-3p高表達(dá)與臨床病理特征之間無相關(guān)性（P>0.05），但部分指標(biāo)如浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移P值接近0.05，預(yù)測 miR-22-3p高表達(dá)可能與抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定相關(guān)性；miR-22-3p高表達(dá)的患者生存時(shí)間延長，表明miR-22-3p能改善食管鱗癌患者的預(yù)后。

本研究證實(shí)miR-22-3p在食管鱗癌中高表達(dá)患者的預(yù)后較非高表達(dá)患者好，兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Zhang等[9]研究miR-22在肝癌中的表達(dá)情況和預(yù)后等關(guān)系結(jié)果相一致，同時(shí)他們?cè)诟伟┘?xì)胞中研究還發(fā)現(xiàn)miR-22體外抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與miR-22調(diào)控HDAC4基因相關(guān)。本研究證實(shí)miR-22-3p表達(dá)水平與臨床特征如性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤程度、吸煙和飲酒無相關(guān)性（P>0.05），與Zhang等[10]研究 miR-22的表達(dá)在結(jié)直腸癌中的臨床意義的結(jié)果相一致，miR-22在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)較正常組織低，miR-22的表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的位置和淋巴管浸潤不相關(guān)（P>0.05）；矛盾的是Zhang等研究發(fā)現(xiàn)miR-22的表達(dá)水平與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），可能與本研究標(biāo)本量小及標(biāo)本來源不同有關(guān)。

Guo等[11]研究miR-22的表達(dá)情況與胃癌關(guān)系同樣發(fā)現(xiàn)：miR-22可能在胃癌的進(jìn)展中也發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)在細(xì)胞層面研究發(fā)現(xiàn)，miR-22可能是通過調(diào)控Sp1基因來抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤。Xu等[12]研究miR-22的表達(dá)情況與腫瘤的關(guān)系的機(jī)制發(fā)現(xiàn)：miR-22是一種新型的通過細(xì)胞衰老機(jī)制調(diào)控腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。miR-22在體內(nèi)外通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的衰老來阻止腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展，miR-22可能主要以SIRT1、Sp1和CDK6基因?yàn)榘谢?，通過這三個(gè)基因的細(xì)胞衰老信號(hào)通路，最終以p53或pRb通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和進(jìn)展。

Fan等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-22在腎細(xì)胞癌中低表達(dá)，但體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：miR-22抑制786-0和A498細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤。miR-22可能通過作用于PTEN靶基因發(fā)揮抑癌基因的作用。在急性髓系白血病研究中，Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)miR-22在急性髓系白血病中低表達(dá)，且發(fā)揮著一個(gè)潛在抗腫瘤基因作用。miR-22通過調(diào)控多個(gè)癌基因（CRTC1、FLT3、MYCBP），抑制CREB和MYC通路發(fā)揮作用。miR-22在急性髓系白血病中低表達(dá)是由TET1/GFI1/EZH2/SIN3A通路抑制和（或）基因組DNA損失。與此同時(shí)，納米粒子攜帶miR-22寡核苷酸在體內(nèi)顯著抑制白血病進(jìn)展[15-22]，同時(shí)，本文研究揭示TET1/GFI1/EZH2/SIN3A/miR-22/CREB-MYC信號(hào)電路，提供了表觀遺傳/遺傳機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了miR-22在臨床上治療急性髓系白血病的潛力。

本研究結(jié)果顯示miR-22-3p是一種抑制食管鱗癌發(fā)生、進(jìn)展的小分子RNA，其相對(duì)高表達(dá)能延長患者的生存時(shí)間，且改善預(yù)后。本研究初步證實(shí)了miR-22-3p的相對(duì)表達(dá)情況和食管鱗癌預(yù)后的相關(guān)性，其高表達(dá)可能降低食管鱗癌的浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但細(xì)胞機(jī)制和分子生物學(xué)研究仍需進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2016-04-27）