聚乙烯醇降解菌的馴化與降解條件優(yōu)化

張東瑞，涂小麗，董國文，張麗華，王仁章

（1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建三明365004；2.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004）

聚乙烯醇降解菌的馴化與降解條件優(yōu)化

張東瑞1,2，涂小麗1,2，董國文1,2，張麗華1,2，王仁章1,2

（1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建三明365004；2.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004）

為了實(shí)現(xiàn)紡織工業(yè)廢水中PVA的生物降解，從活性污泥中馴化得到對PVA具有降解能力的混合菌種，并對降解條件進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下能在8 d對濃度為5g/L的PVA降解率達(dá)到87.5%。該混合菌體系為共生菌種，能夠有效代謝無機(jī)氮源氯化銨來降解PVA。

聚乙烯醇；混合菌體；生物降解

聚乙烯醇（PVA）是一種具有水溶性的高分子合成化合物，廣泛應(yīng)用于粘合劑、涂料、乳化劑、造紙和紡織等行業(yè)[1]。由于其可生化性差、難降解、易積累，對環(huán)境造成很大的污染[2]。自1973年成功分離出第一株以PVA為唯一碳源的降解菌以來，研究者們對PVA的生物降解進(jìn)行了廣泛研究[3]。但降解PVA的初始濃度普遍不高，大部分微生物降解PVA的濃度在0.1%-2.0%之間[4-7]。在環(huán)境中能夠自然降解PVA的微生物不多，純菌更是難于降解高濃度的PVA廢水，所以混合菌株是一個(gè)不錯(cuò)的選擇[8]。作者采用PVA長期存在環(huán)境下福建福維污水處理廠的活性污泥，對其進(jìn)行馴化得到能夠有效降解PVA的混合菌種，并研究相關(guān)因素提高PVA的降解效果和速率，為進(jìn)一步深入研究該混合菌種的應(yīng)用提供參考。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料和試劑

活性污泥采自福建福維污水廠曝氣池，PVA類型1788（福建福維生產(chǎn)）。液體培養(yǎng)基PVA1788 5 g/L，酵母粉2 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO40.25 g/L，MgSO40.06 g/L，CaCl20.05 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，NaCl0.02 g/L，調(diào)pH到7.5。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入瓊脂20 g/L(4%)，調(diào)pH至7.5。

1.2馴化方法

取適量活性污泥接入含有適量PVA的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以PVA作為唯一碳源進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，不斷馴化富集，進(jìn)行篩選，獲得能夠有效降解PVA的菌種。搖瓶培養(yǎng)：將馴化好的污泥以4%的接種量（體積）加入裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃培養(yǎng)。

1.3測試方法

根據(jù)Finely法[9]，PVA在硼酸的情況下與I2產(chǎn)生反應(yīng)，于690 nm下測試其光密度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算乘以稀釋倍數(shù)得到PVA的濃度(TU1900，北京普析)。菌體生長情況測定：用比濁法測定，取2 mL菌株培養(yǎng)液，稀釋3倍后，每隔24 h在波長600 nm處測其OD600。

1.4混合菌種群分析

通過提取樣品中微生物的總DNA，采用引物F338GC-R518進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]，然后進(jìn)行DGGE凝膠電泳，割膠回收，克隆測序（上海生工）。

2結(jié)果與討論

2.1 PVA降解菌的馴化

將活性污泥以4%的體積接種量接入裝有100 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)1個(gè)半月后，逐步提高PVA濃度(PVA濃度由1 g/L提高到5 g/L)，經(jīng)過5個(gè)周期的再馴化，獲得能夠有效降解PVA的混合菌種，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，經(jīng)過馴化的混合菌株能夠有效降解高濃度的PVA模擬廢水?；旌暇陮? g/L PVA降解率在第10 d達(dá)到73.9%。相對應(yīng)地，混合菌株的生物量在第2 d達(dá)到最大值，之后變化相對穩(wěn)定。

取馴化好的種子液，稀釋成倍數(shù)為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的懸浮液，分別吸取0.5 mL的10-4和10-5的懸浮液均勻涂在固體培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，然后加入碘-硼酸溶液，于暗處反應(yīng)10 min拿出觀察菌落周圍或菌落下產(chǎn)生透明圈情況，根據(jù)菌落形態(tài)和透明圈大小，挑出3株純菌株分別接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（PVA濃度為1 g/L）。

圖1 PVA的降解和混合菌株生長情況

從圖2可以看出，單菌株對PVA的降解效果非常差，該體系為混合菌[11]，接下來的環(huán)境條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用混合菌種。

圖2單菌株對PVA的降解情況

測序結(jié)果在http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch上比對，并提交到NCBI，結(jié)果見表1。通過測序發(fā)現(xiàn)主要降解PVA微生物有9種優(yōu)勢菌株，其中鞘氨醇單胞菌屬已有報(bào)道能夠降解PVA[12]，其它菌株還未見相關(guān)報(bào)道。

表1 9種優(yōu)勢菌株16S rDNA序列比對結(jié)果

2.2不同氮源對菌體生長和PVA降解的影響

為了提高PVA降解效率，以1.0 g/L PVA作為唯一碳源，考察不同氮源對該混合菌體生長和PVA降解的影響(總氮含量相等)，氮源種類及使用量分別為氯化銨（0.83 g/L）、尿素（0.4 5g/L）、硝酸鈉（1.29 g/L）、酵母粉（2.16 g/L）、蛋白胨（1.77 g/L）、硫酸銨（1.00 g/L），考察其在pH7.5，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，在有機(jī)氮源中，酵母粉和蛋白胨都有利于菌體的大量生長，以無機(jī)氮作為氮源時(shí)，菌體生長量較有機(jī)氮源小，且差距明顯。然而，降解PVA最多的并不是有機(jī)氮源，而是無機(jī)氮源，其中氯化銨作為氮源時(shí)混合菌體降解PVA的速率最快，其次是硝酸鈉，菌體生長量很高的酵母粉和蛋白胨都沒有能夠有效降解PVA。崔雙科等研究發(fā)現(xiàn)菌體在以酵母膏為氮源時(shí)生長非常好，但是酶活很低，究其原因可能是菌體在代謝有機(jī)氮源時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些粘性物質(zhì)，減小了細(xì)胞的表面積以及影響細(xì)胞分泌PVA降解酶，從而導(dǎo)致菌體代謝有機(jī)氮源時(shí)PVA降解率比較低[13]。

圖3不同氮源對混合菌體生長和PVA降解的影響

綜上表明氮源對微生物降解PVA起著關(guān)鍵性作用。因此后期實(shí)驗(yàn)中只加入氯化銨，并考察了其濃度對混合菌體降解PVA的影響。分別以濃度為0.2，0.5，0.8，1.0，2.0，5.0 g/L的氯化銨取代原培養(yǎng)集中的濃度，在pH7.5，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖4所示。

圖4不同氯化銨濃度對混合菌體PVA降解能力的影響

根據(jù)圖4可知，氯化銨濃度在0.2～0.8 g/L之間，PVA降解率隨著氯化銨濃度的增加而上升，在0.8 g/L時(shí)達(dá)到最大值。隨著氯化銨濃度的繼續(xù)增加，PVA降解率逐漸下降，這可能是加入過多的氮源，導(dǎo)致氮碳比過高，引起菌體不適，所氯化銨的最適濃度為0.8 g/L。

2.3外加碳源對菌體生長和PVA降解的影響

在以PVA作為唯一碳源時(shí)，此混合菌體降解高濃度的PVA廢水時(shí)周期過長，需要一周時(shí)間左右，因此考慮采用混合碳源，輔助其它碳源來促進(jìn)菌體生長，從而縮短降解周期。在PVA含量為1.0 g/L的液體培養(yǎng)基中，分別添加淀粉、蔗糖、葡萄糖（1.0 g/L），在pH7.5，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，輔助其它碳源能夠促進(jìn)菌體生長，但PVA的降解率反而下降了，表明添加其它有機(jī)碳源并沒有促進(jìn)PVA的降解，而是擬制PVA的降解。崔雙科等在研究混合菌系產(chǎn)酶營養(yǎng)條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加其它碳源有利于菌體的生長，但同時(shí)擬制了PVA降解酶的酶活，從而導(dǎo)致PVA降解率的下降[13]，故在之后的實(shí)驗(yàn)中不再添加其它碳源。

圖5不同碳源對混合菌體生長和PVA降解的影響

2.4不同PVA濃度對混合菌體PVA降解能力的影響

在優(yōu)化氮源和碳源的基礎(chǔ)上，調(diào)整培養(yǎng)液中PVA濃度分別為2、4、6、8、10 g/L，考察在pH=7.5搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃培養(yǎng)8 dPVA降解及菌體生長情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6不同PVA濃度對混合菌體PVA降解能力的影響

在PVA濃度小于6 g/L時(shí)，菌體生長量隨PVA初始濃度的增加而增加，當(dāng)PVA濃度為6 g/L時(shí)，菌體生長量達(dá)到最大，此后，菌體生長量隨PVA初始濃度的增加而遞減。隨著PVA初始濃度的增加混合菌體PVA降解率逐漸降低，在PVA濃度為10 g/L時(shí)，幾乎不再降解PVA，所以PVA濃度10 g/L是該混合菌體降解PVA的最大耐受值。

2.5 MgSO4和FeSO4·7H2O對混合菌體PVA降解能力的影響

微生物的生長需要一定的微量元素，但某些微量元素會(huì)抑制微生物的活性。在前期優(yōu)化條件的基礎(chǔ)下，PVA濃度為5 g/L，其中MgSO4和FeSO4·7H2O添加量分別為0.06和0.02 g/L，pH=7.5，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃培養(yǎng)8 d，PVA降解情況如圖7所示。

圖7 MgSO4和FeSO4·7H2O對混合菌體PVA降解能力的影響

從圖7可知，只添加亞鐵離子的樣品中，PVA的降解率最高，達(dá)到87.5%，沒有礦質(zhì)元素加入的空白樣品為68.3%，說明亞鐵離子有促進(jìn)混合菌體降解PVA。只加入鎂離子的降解率為56.3%，低于空白值，混合加入亞鐵離子與鎂離子的降解率為79.92%，高于空白樣品的降解率，但低于只加入亞鐵離子的降解率，鎂離子的加入使PVA降解率明顯下降，這說明鎂離子對微生物的生物活性有一定的擬制作用。

3結(jié)論

以PVA為唯一碳源，運(yùn)用搖瓶培養(yǎng)富集方法，從活性污泥中馴化得到對PVA具有降解能力的混合菌種，在最優(yōu)條件下能在8 d對濃度為5 g/L的PVA降解率達(dá)到87.5%。該混合菌能夠有效代謝無機(jī)氮源來降解PVA。

對該混合菌體降解條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1）PVA降解的最佳氮源為0.8 g/L氯化銨；（2）外加1.0g/L淀粉、蔗糖、葡萄糖，均可提高菌體的生長量但抑制了PVA的降解；（3）PVA濃度10g/L是該混合菌體降解PVA的最大耐受值；（4）鐵離子對PVA的降解有促進(jìn)作用，而鎂離子抑制其降解。該體系最佳PVA降解培養(yǎng)基：NH4Cl0.8 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO40.25 g/L，CaCl20.05 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L，調(diào)pH至7.5。

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（責(zé)任編輯：朱聯(lián)九）

Screening of PVA-Degrading Strains and OptiMization of Degradation Conditions

ZHANG Dong-rui1,2,TU Xiao-li1,2,DONG Guo-wen1,2, ZHANG Li-hua1,2,WANG Ren-zhang1,2

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring&Sustainable Management and Utilization，Sanming 365004，China；2.College of Resource and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004，China)

In order to achieve the biodegradation of PVA in the textile industrialwastewater,a bacteriaMixture capable of degrading PVA was obtained froMactivated sludge.Simultaneously，the degradation conditionswere optiMized.Under the optimal conditions,the PVA degradation rate after 8 dayswas 87.5%in themediuMwith 5 g/L PVA.ThisMixed bacteriuMis symbiotic bacteria,which can effectively utilize the inorganic nitrogen source NH4Cl to degrade PVA.

polyvinylalcohol;mixed bacteria;biodegradation

X 172

A

1673-4343（2016）06-0078-05

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．013

2016-09-29

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2014Y0072）；大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（201211311010）；2011潔凈煤氣化技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心開放課題（XK1404）

董國文，男，安徽宿松人，博士，副教授。主要研究方向：污染環(huán)境生物修復(fù)。