響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲波輔助提取茶皂素工藝研究

陳小紅，吳德武，龍娟娟

（1．龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；2．龍巖學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建龍巖364012）

響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲波輔助提取茶皂素工藝研究

陳小紅1，吳德武2，龍娟娟2

（1．龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；2．龍巖學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建龍巖364012）

以油茶籽粕為原料，乙醇水溶液為浸提液，通過微波－超聲波輔助提取茶皂素，在超聲波功率80W，超聲波作用時(shí)間50Min的條件下，考察乙醇濃度、料液比、微波功率和浸提時(shí)間對(duì)茶皂素提取率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以茶皂素浸提得率為響應(yīng)值通過響應(yīng)面法優(yōu)化茶皂素的浸提提工藝。以反相柱層析法純化提取的茶皂素，對(duì)純化的茶皂素以紅外、紫外光譜進(jìn)行表征。結(jié)果表明，超聲波功率80W，超聲波作用時(shí)間50Min的條件下，茶皂素的提取工藝為：乙醇濃度77%，料液比1∶20(g∶ML)，微波功率714W，浸取時(shí)間336s，在優(yōu)化條件下，茶皂素浸提得率為（8．1±0．3)%，其純度為65．2%，微波－超聲波輔助在浸提中表現(xiàn)出協(xié)同作用。反相柱層析法純化提取的茶皂素，可得到高純度茶皂素。

茶籽粕；微波；超聲波；茶皂素；反相柱層析；紅外

油茶籽粕是食用油茶籽榨油后得到的殘?jiān)?，是提取茶皂素的天然原材料之一，從油茶籽粕中提取得到的茶皂素又叫做茶皂甙，是一類?fù)雜的糖苷化合物，具有良好的表面活性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的發(fā)泡、乳化、分散、濕潤等作用，并具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等生理活性，大量應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)、建筑建材、日用化工等行業(yè)[1-3]。受產(chǎn)地、品種以及榨油工藝的影響，油茶籽粕中茶皂素的含量大致在10%～15%[3]。由于微波在輻射過程高頻電磁波可穿透介質(zhì)直接作用于植物內(nèi)部細(xì)胞的效果，超聲波在介質(zhì)傳播中產(chǎn)生特殊的“空化效應(yīng)”，近年來，微波提取與超聲波提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用在茶皂素的提取工藝研究中[4-9]?；谖⒉?、超聲波輔助提取技術(shù)能夠很好地提高油茶籽粕中茶皂素的提取得率，本實(shí)驗(yàn)固定超聲波功率80W，超聲波作用時(shí)間50 min的條件下，通過響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲波協(xié)同輔助提取茶皂素的提取工藝條件。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MG08S一203型微波儀(南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司)；YP-B5001電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；DK-98-II電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV-5600紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；Nicolet Avatar330傅立葉紅外光譜儀，（美國Termo Electron公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（鞏義市子華儀器有限公司）；索氏提取器；抽濾裝置一套。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及試劑

油茶籽粕（龍巖市茶麗健茶油開發(fā)有限公司）；茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁試劑有限公司）；無水乙醇（AR）（西隴化工股份有限公司）；50μMODS-A反相硅膠填料（日本YMC公司）；香草醛(香蘭素)（≥99%)（西隴化工股份有限公司）；硫酸（AR）（95%～98%）（西隴化工股份有限公司）；無水甲醇（AR）（西隴化工股份有限公司）；石油醚（AR）（西隴化工股份有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1油茶籽粕中茶皂素的提取

油茶籽粕粉碎過80目篩，稱取30 g于索氏提取器在石油醚中回流脫脂24 h，取出烘干。重復(fù)此操作，制備脫脂油茶籽粕若干備用。然后稱取5.0 g的脫脂茶籽粕粉末放入100 mL燒杯中加一定體積濃度的乙醇溶液，攪拌分散均勻，在超聲波功率80W下，超聲波作用時(shí)間50 min，之后取出，在微波儀中分別按不同微波功率、微波提取時(shí)間的條件下，進(jìn)行浸提。浸提完畢，減壓抽濾得到茶皂素浸提液，測(cè)定濾液體積V，裝入錐形瓶中。

1.3.2浸提液中茶皂素含量的測(cè)定[9]

采用80%的乙醇溶液為溶劑，稱取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確配制180、360、540、720、900μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍取1.00 mL茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試管中，往其中加入1 mL 8%香草醛乙醇溶液和10 mL 77%硫酸溶液，充分混合搖勻后，置于60℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min，取出后置于冰水浴中冷卻10 min，放至室溫，把液體移入玻璃比色皿，以蒸餾水為參比，在波長為550 nm處測(cè)定溶液的吸光度，以茶皂素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程為y＝1247.3994x-30.5605，R2＝0.9997。

準(zhǔn)確移取茶皂素濾液1.00 mL至250 mL容量瓶中，以80%的乙醇溶液為溶劑，定容搖勻待測(cè)，取1.00 mL定容后的稀釋茶皂素液加入試管中，采用上述方法測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)茶皂素濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得到的方程，求得稀釋定容后茶皂素溶液的茶皂素含量，進(jìn)而求出茶籽粕中茶皂素提取得率：

其中x為稀釋定容后茶皂素溶液的吸光值；N=250為稀釋的倍數(shù)；V為茶皂素濾液體積；W=5.0為茶籽粕質(zhì)量。

1.3.3茶皂素的反相柱層析純化[10-11]

以50μMODS-A反相硅膠為填料，采用無水乙醇勻漿濕法上柱。稱取3 g提取、干燥后的茶皂素溶解在40 mL 5%的甲醇溶液，通過分液漏斗控制于1 mL/min速度上樣，以1.5 mL/min的洗脫速度，梯度洗脫，先采用50%的甲醇溶液以2倍柱床體積淋洗；再用60%的甲醇溶液以2倍柱床體積淋洗，每2 min收集1份洗脫液，對(duì)每份洗脫液進(jìn)行紫外吸光檢測(cè)。對(duì)215 nm處有強(qiáng)吸收峰的洗脫液進(jìn)行濃縮、干燥。

1.3.4茶皂素純化物表征[10-11]

（1）紫外掃描

以60%甲醇溶液為溶劑，將純化后的茶皂素配置成濃度為0.5 mg/mL的溶液，進(jìn)行紫外掃描，得到紫外掃描光譜圖。

（2）傅立葉紅外掃描

取微量純化后茶皂素樣品與KBr混合后壓片，進(jìn)行紅外掃描，得到紅外掃描光譜圖。

2結(jié)果分析

2.1微波-超聲波輔助單因素浸提茶皂素試驗(yàn)

2.1.1微波功率對(duì)茶皂素得率的影響

稱取脫脂茶粕粉末5.0 g若干份，按固液質(zhì)量比1∶7，乙醇濃度60%，浸提時(shí)間為280 s，調(diào)節(jié)微波功率，將所得提取液過濾，保留于帶塞錐形瓶中備用并檢測(cè)其茶皂素含量。微波功率對(duì)茶皂素得率的影響結(jié)果如圖1所示。由圖可知，微波功率對(duì)茶皂素的提取有一定的影響，隨著微波功率的增大，茶皂素得率逐漸增大，當(dāng)微波功率為700W時(shí),茶皂素得率達(dá)到5.8%。因此，提取茶皂素適宜的微波輻射功率為700W。

2.1.2微波輻射時(shí)間對(duì)茶皂素得率的影響

取脫脂茶粕粉末5.0 g若干份，按固液質(zhì)量比1∶7，乙醇濃度60%，微波功率700 W，調(diào)節(jié)微波時(shí)間分別為160、200、240、280、320、360、400 s浸提茶皂素，將所得提取液過濾，保留于帶塞錐形瓶中備用并檢測(cè)其茶皂素含量。微波輻射時(shí)間對(duì)茶皂素得率的影響如圖2所示。從圖可以看出，微波輻射時(shí)間對(duì)茶皂素的提取影響較大，初始時(shí)隨著微波輻射時(shí)間延長，茶皂素的得率逐漸增加，當(dāng)微波輻射時(shí)間為320 s時(shí)，茶皂素的得率為6.4%；繼續(xù)延長微波輻射時(shí)間，茶皂素得率變化不大。因此，取320 s為合適的微波輻射時(shí)間。

圖1微波功率對(duì)茶皂素提取效果的影響

圖2微波時(shí)間對(duì)茶皂素提取效果的影響

2.1.3料液質(zhì)量比對(duì)茶皂素得率的影響

稱取脫脂茶粕粉末5.0 g若干份，按乙醇濃度60%。浸提時(shí)間為320 s，微波功率為700W，固液質(zhì)量分別按1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 g/mL浸提茶皂素，將所得提取液過濾，保留于帶塞錐形瓶中備用并檢測(cè)其茶皂素含量。料液質(zhì)量比對(duì)茶皂素得率的影響結(jié)果如圖3所示，隨著固液質(zhì)量比增大，茶皂素的得率升高，當(dāng)固液比達(dá)到1∶16時(shí)，茶皂素得率為6.7%，繼續(xù)增加微波輻射固液質(zhì)量比，茶皂素得率變化不大，因此，取1∶16 g/mL為合適的料液質(zhì)量比。

2.1.4乙醇濃度對(duì)茶皂素得率的影響

稱取脫脂茶粕粉末5.0 g若干份，按料液質(zhì)量比1∶16 g/mL，微波功率為700W，浸提時(shí)間為320 s，乙醇濃度分別為50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%浸提。將所得提取液過濾，保留于帶塞錐形瓶中備用并檢測(cè)其茶皂素含量。不同乙醇濃度對(duì)茶皂素得率的影響結(jié)果如圖4所示，由圖可知，隨著乙醇濃度的增大，茶皂素得率逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，茶皂素得率達(dá)到7.1%，繼續(xù)增大乙醇濃度，茶皂素得率降低。因此，取乙醇濃度70%時(shí)為合適的提取溶劑。

圖3料液質(zhì)量比對(duì)茶皂素提取效果的影響

圖4乙醇濃度對(duì)茶皂素提取效果的影響

2.2微波輻射提取茶皂素的工藝優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面法優(yōu)化微波輻射提取茶皂素的工藝條件

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，考察乙醇濃度、料液比、微波功率、浸提時(shí)間四因素對(duì)茶皂素提取得率的影響，以茶皂素提取得率為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平見表1。根據(jù)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案進(jìn)行茶皂素的浸提，結(jié)果見表2。對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

表1因素與水平

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸分析結(jié)果

續(xù)表3

由表3模型的F值=12.88表明模型是顯著的，即模型的模擬值只有0.1%的可能性是由干擾噪聲而引起誤差，說明模型分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)表2實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行回歸分析得到方程：茶皂素得率(%)=-374.8137+6057A+62207037B+ 0.11362C+0.42742D–7.66667AB–8.5E-4AC–2.5E-3AD+0.13333BC+0.08333BD+2.5E-5CD–0.30533A2–1559.25926B2–4.25833E-5C2–3.83333 E-4D2，方程的R2=0.9280說明方程的擬合程度較好，圖5中回歸方程的殘差正態(tài)圖呈一條直線，說明回歸分析得到的方程擬合程度好，可信度高，通過方程可以很好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型的“Prob﹤F”﹤0.05、失擬項(xiàng)p=0.0264﹤0.05顯著，表明模型的可信度高，可以通過該模型優(yōu)化茶皂素的浸提工藝條件。由表3中的“P”可知A、B，A、C，A、D因素的交互影響顯著，因此本文只考察A、B，A、C，A、D雙因素交互影響的響應(yīng)面曲線及對(duì)應(yīng)的等高線圖，其結(jié)果如圖6～8所示。

圖5回歸分析的殘差正態(tài)圖

由圖6因素A、B響應(yīng)面分析立體圖及相應(yīng)等高線圖可知液料比B在12.98的值時(shí)，乙醇濃度在66%至80%的區(qū)間范圍這內(nèi)可達(dá)到響應(yīng)面頂點(diǎn)，圖7等高線圖中出現(xiàn)圓心區(qū)間，表明在這個(gè)范圍內(nèi)響應(yīng)值有出現(xiàn)最優(yōu)點(diǎn)；由圖8等高線圖上出現(xiàn)橢圓心區(qū)，表明因素A、D對(duì)響應(yīng)值茶皂素浸提得率的交互影響比因素A、C更顯著。通過響應(yīng)面法對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化，獲得微波—超聲波輔助從茶籽粕粉浸提茶皂素的最優(yōu)工藝：固定超聲波功率80W，超聲波作用時(shí)間50min的條件下，乙醇濃度77.2%，料液比1∶20，微波功率714.4W，浸取時(shí)間335.5 s。在優(yōu)化條件下，茶皂素得率預(yù)測(cè)值為8.3%。

2.2.2響應(yīng)面法優(yōu)化微波輻射提取茶皂素的工藝條件的驗(yàn)證

對(duì)優(yōu)化結(jié)果的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，固定超聲波功率80W，超聲波作用時(shí)間50 min的條件下，取乙醇濃度77%，料液比1∶20，微波功率714W，浸取時(shí)間336 s進(jìn)行微波輔助提取茶皂素，平行試驗(yàn)4次，結(jié)果取平均值，測(cè)得茶皂素浸提得率（8.1±0.3)%，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，表明模型的可信度高，干燥后測(cè)得其純度為65.2%。與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.4%，表明響應(yīng)面法建立茶皂素浸提得率的模型可信度高，能夠指導(dǎo)從茶籽粕粉中采用微波-超聲波輔助浸提茶皂素。

圖6因素A、B響應(yīng)面分析立體圖及相應(yīng)等高圖

圖7因素A、C響應(yīng)面分析立體圖及相應(yīng)等高圖

圖8因素A、D響應(yīng)面分析立體圖及相應(yīng)等高圖

2.3同水平條件下優(yōu)化工藝與微波輻射提取、超聲波輔助提取工藝對(duì)茶皂素提取率的比較

取乙醇濃度77%，料液比1∶20的條件下，分別以超聲波功率80W，超聲波作用時(shí)間55.6 min以及微波功率714W，微波作用時(shí)間336 s，進(jìn)行茶皂素的提取，平行試驗(yàn)4次，結(jié)果取平均值，對(duì)比優(yōu)化工藝條件下茶皂素的提取率，結(jié)果如表4所示。

表4優(yōu)化工藝與微波、超聲波作用對(duì)茶皂素提取率的比較

由表4表明，同水平條件下，與單獨(dú)采用微波輻射提取或超聲波輔助提取相比較，優(yōu)化工藝的茶皂素提取得率可以獲得較大的提高，表明優(yōu)化工藝可為油茶籽粕中茶皂素提取的工業(yè)生產(chǎn)提供重要的參考價(jià)值。由微波－超聲波協(xié)同輔助提取的茶皂素得率(8.1%)大于單獨(dú)采用微波輻射提取或超聲波輔助提取的茶皂素得率之和(7.5%)，表明微波輻射與超聲波輔助在茶皂素浸提中表現(xiàn)出協(xié)同作用。

2.4反相柱層析純化后茶皂素的表征

按優(yōu)化的微波-超聲波輔助工藝提取茶籽粕粉中的茶皂素，對(duì)提取、干燥獲得的茶皂素進(jìn)行反相柱層析純化，純化后樣品的紅外吸收光譜如圖9、紫外吸收光如圖10所示。

圖9茶皂素紅外圖譜

圖10茶皂素紫外圖譜

由圖9可見，在2920、2850 cm-1處出現(xiàn)茶皂素烷烴配基的C—H伸縮振動(dòng)吸收峰。在1610 cm-1處出現(xiàn)C=C伸縮振動(dòng)吸收峰，在1385 cm-1處出現(xiàn)—OH伸縮振動(dòng)吸收峰，在1075、1045 cm-1與處出現(xiàn)C—O伸縮振動(dòng)強(qiáng)吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道的茶皂素紅外光譜值基本一致[12]。由圖10可見反相柱層析純化后的樣品在紫外吸收光區(qū)僅于波長215 nm處有最大吸收峰，與文獻(xiàn)相符[13]，在波長230 nm后沒有出現(xiàn)明顯的吸收峰，表明茶皂素提取物中的單寧、黃酮等雜質(zhì)得到了有效的分離，純化后的樣品純度高。

3結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化微波－超聲波協(xié)同輔助提取茶皂素，得到浸提茶皂素模型：茶皂素得率(%)= -374.8137+6057A+62207037B+0.11362C+0.42742D–7.66667AB–8.5E-4AC–2.5E-3AD+ 0.13333BC+0.08333BD+2.5E-5CD–0.30533A2–1559.25926B2–4.25833E-5C2–3.83333E-4D2；最優(yōu)浸提工藝：固定超聲波功率80W，超聲波作用時(shí)間50min的條件下，乙醇濃度77%，料液比1∶20，微波功率714W，浸取時(shí)間336 s。在優(yōu)化條件下，茶皂素浸提得率為（8.1±0.3)%，其純度為65.2%；同水平條件下與單獨(dú)采用微波輻射提取或超聲波輔助提取比較，優(yōu)化工藝條件下茶皂素的提取得率可以獲得較大的提高，可為油茶籽粕中茶皂素提取的工業(yè)生產(chǎn)提供重要的參考價(jià)值。微波輻射與超聲波輔助在優(yōu)化工藝中表現(xiàn)出協(xié)同作用。通過反相柱層析純化提取的茶皂素，可得到高純度茶皂素。

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(責(zé)任編輯：朱聯(lián)九）

The Research on the OptiMization of Technology Process by Response Surface Method

CHEN Xiao-hong1,WU De-wu2，LONG Juan-juan2

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，China 2.College of Chemistry&Materialse，Longyan University，Longyan 364012，China）

TheMicrowave and ultrasonic assisted extraction of tea saponin froMdefatted oil-tea seed cakewasstudied in this paper．Under the condition of ultrasonic power 80 W,radiation for 50 Min,the effects of ethanol concentration,liquid-solid ratio,Microwave powerand extracting time on tea saponin extraction yield were studied.On the basis of single factor experiment,the optiMized extraction processof tea saponin through the response surfacemethod,on tea saponin yield response value,was studied.Tea saponin was purified by reversed phase column chromatography and was characterized with IR,UV spectra.Experimental results show that the optiMized extraction processwas:the concentration of ethanolwas 77%,the solid-liquid ratio was 1∶20(g∶ML),microwave powerwas 714W,extracting time was 336s.At the optimal condition,tea saponin extraction yield was（8.1±0.3)%and its purity was up to 65.2%.Themicrowave and ultrasonic assisted extraction showed synergy in thisexperimentand tea saponin ofhighly puritywasobtained by reversed phase column chromatography.

oil-tea seed cake;Microwave;ultrasonic;tea saponin;reversed phase column chromatography;IR

TQ 914

A

1673－4343（2016）06－0064－08

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．011

2016－09－19

龍巖學(xué)院“攀登項(xiàng)目”（LQ 2013018）

陳小紅，女，福建永定人,實(shí)驗(yàn)師。主要研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)。通訊作者：吳德武，男，福建連城人,講師。主要研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)。