一株化血膽組織培養(yǎng)污染內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及防治

趙 鳳，耿開友*，胡 昳，夏體淵，陳澤斌，任 禛，靳 松

(1. 昆明學(xué)院科研處，云南 昆明 650214; 2. 昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214)

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一株化血膽組織培養(yǎng)污染內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及防治

趙 鳳1，耿開友1*，胡 昳2，夏體淵2，陳澤斌2，任 禛2，靳 松2

(1. 昆明學(xué)院科研處，云南 昆明 650214; 2. 昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214)

采用NA培養(yǎng)基分離純化細(xì)菌，通過形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)結(jié)合16S rDNA序列同源性分析，對(duì)引起化血膽組培苗污染的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，引起化血膽組培苗污染的內(nèi)生細(xì)菌為HXD5菌株，其形態(tài)特征及22項(xiàng)生理生化指標(biāo)與枯草芽孢桿菌相符；16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，HXD5與B.amyloliquefaciens(HQ727971)、B.vallismortis(FJ386541)、B.licheniformis(EF644414)、B.subtilis(AY583216)在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，同源性為99.9 %～100 %。因此確定引起化血膽組培苗污染的內(nèi)生細(xì)菌HXD5為枯草芽孢桿菌。抑菌試驗(yàn)表明，氯霉素對(duì)HXD5的抑菌效果要優(yōu)于鏈霉素。

化血膽；組織培養(yǎng)；內(nèi)生細(xì)菌；分離；鑒定；防治

化血膽為玄參科植物黑蒴[Melasmaarvense(Benth.) Hand.-Mazz.]的根，系多年生草本植物，主要分布于云南省南部地區(qū)，為云南省苗族、彝族、拉祜族等民族民間珍稀藥材[1]，云南多家醫(yī)院主要用于治療白血病、腫瘤、心腦血管病、黃疸型肝炎、肝腫大、跌打傷瘀腫、痛經(jīng)等疾病[2]。化血膽具有可開發(fā)為治療早期白血病、抗腫瘤和化血、溶血特效藥品的潛力。長期以來，化血膽藥材來源全部依賴于野生植物資源，隨著天然藥品市場的需求量與日俱增，化血膽野生資源受到嚴(yán)重破壞，目前野生資源已經(jīng)很難找到[3]。由于化血膽地域分布狹窄，種子自然萌發(fā)率極低(小于0.3 %)，利用種子直播育苗困難，加之近年來掠奪式過度采挖，目前全草鮮品已經(jīng)超過4000元/kg，處于有價(jià)無貨，極度珍稀、瀕臨滅絕。因此,對(duì)其進(jìn)行人工種苗快速繁殖技術(shù)研究是十分必要的。

在植物組織培養(yǎng)過程中，存在兩種類型的污染：一類是通常所說的污染，即外植體消毒不徹底，無菌操作和培養(yǎng)過程中，如：培養(yǎng)基、接種工具、接種室消毒不嚴(yán)格或操作不規(guī)范而導(dǎo)致的污染；另一類是內(nèi)生菌污染，內(nèi)生菌包括真菌和細(xì)菌，本研究探討的是內(nèi)生細(xì)菌所致的污染[4-6]。在化血膽組培快繁過程中，雖然對(duì)組培前的外植體進(jìn)行了嚴(yán)格的消毒滅菌，但10 d后發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)菌污染，污染率高達(dá)60 %以上，一旦被污染，菌苔很快布滿培養(yǎng)基表層及外植體的基部，大量消耗營養(yǎng)；外植體停止生長，逐漸枯萎死亡，嚴(yán)重影響組培苗的正常生長和繼代。

內(nèi)生細(xì)菌污染是普遍的，如金線蓮(Anoectochilusroxburghii)組培中污染率達(dá)到50 %[7]，仙客來(Cyclamenpersicum)的塊莖組織內(nèi)生細(xì)菌污染率達(dá)83.0 %[8]，地黃(Rehmanniaglutinosa)由于有內(nèi)生細(xì)菌的存在污染率達(dá)100 %等[9]。從已有的報(bào)道看，被鑒定的種類主要有黃單胞菌屬(Xanthomonas)[10]、芽孢桿菌屬(Bacillus)、萄球菌屬(Staphylococcus)[11]、假單胞屬(Pseudomonas)[12]、土壤桿菌屬(Agrobacterium)[13]、葡腸桿菌屬(Enterobacter)、棒桿狀菌屬(Corynebacterium) 、沙雷氏菌屬(Serratia)、短小桿菌屬(Curtobacterium)[14]、歐文氏菌屬(Erwinia)[15-18]等。在組培苗內(nèi)生菌污染防治的相關(guān)報(bào)道中，多采用對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理，比如：黃化處理、熱擊、多次消毒、灼燒、酸化培養(yǎng)基、在培養(yǎng)基中加入抗生素。特別是抗生素的使用具有較好的效果[12]。

內(nèi)生菌污染是化血膽快繁體系建立的極大障礙，至今尚未有相關(guān)研究的報(bào)道。本研究通過形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)結(jié)合16S rDNA序列同源性分析，對(duì)1株引起化血膽外植體培養(yǎng)污染的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離與鑒定，并試驗(yàn)了氯霉素、鏈霉素、新潔爾滅、來蘇爾對(duì)污染菌的防治情況，為預(yù)防化血膽組織培養(yǎng)污染、建立無性繁殖技術(shù)體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

被污染的化血膽組培苗由昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生細(xì)菌分離和培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，細(xì)菌DNA提取，16S rDNA片段擴(kuò)增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程(大連)產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，氯霉素(USP Grade)、鏈霉素(USP Grade)購自北京索萊寶生物科技有限公司，新潔爾滅、來蘇爾購自濟(jì)南光輝化工有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離純化及保藏

挑取污染菌苔接種于NA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，挑取單菌落于試管斜面中4 ℃保存。

1.4 形態(tài)特征觀察及生理生化指標(biāo)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行芽孢染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。形態(tài)特征觀察及生理生化試驗(yàn)參見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[20]，主要測(cè)定項(xiàng)目包括培養(yǎng)性狀、菌體大小、革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色、接觸酶反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)性、氧化細(xì)胞直徑、芽孢形狀、葡萄糖產(chǎn)酸、運(yùn)動(dòng)性、是否好氧、V-P反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、還原硝酸鹽、水解淀粉、耐1 %～7 %氯化鈉、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、形成吲哚、丙酸鹽利用、分解酪素、分解酪氨酸、尿酶試驗(yàn)、5～60 ℃生長的情況，最適生長溫度，最適pH。

1.5 16S rDNA序列分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取細(xì)菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。PCR反應(yīng)體系(50 μl)組成：10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[21](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (約50 g/L) 1 μl，Taq酶2.5 U，雙蒸水35.5 μl。PCR擴(kuò)增按Sambrook方法進(jìn)行[22]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行同源性搜索[23]，通過MEGA4.0進(jìn)行比對(duì)，隨后選用Maximum Composite Likelihood距離模型進(jìn)行UPGMA分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹用Bootstrap法(1000次重復(fù))檢驗(yàn)。用MegAlign軟件，將這些序列用Clustal W法進(jìn)行多序列比對(duì)，建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化距離圖。

1.6 抑菌試驗(yàn)

選取氯霉素(USP Grade)、慶大霉素(USP Grade)、新潔爾滅、來蘇爾，采用濾紙片法對(duì)HXD5進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。氯霉素和鏈霉素設(shè)3個(gè)梯度：0.005、0.025、0.125 g/mL，潔爾滅和來蘇爾不稀釋直接使用。將各抑菌平皿(直徑20 cm)置于28 ℃培養(yǎng)48 h后，記錄抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征觀察及生理生化指標(biāo)的測(cè)定

菌株HXD5(圖1b)在NA培養(yǎng)基上呈乳白色不透明菌落，菌落不規(guī)則形，稍凸起，表面干燥有褶皺，邊緣不整齊；芽孢直桿狀(圖2)，約2 μm，以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端。依據(jù)常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)，生理生化指標(biāo)均與枯草芽孢桿菌(Bacillus.subtilis)特征相同(表1)。

a.被菌株HXD5污染的化血膽組培苗；b.HXD5在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)a.Melasma arvense’s cultivation seedling polluted by the strain HXD5; b.Colony morphologies of strain HXD5 on NA culture medium圖1 菌株HXD5的形態(tài)特征Fig.1 The morphology of strain HXD5

表1 HXD5生理生化指標(biāo)

圖2 HXD5的芽孢染色(放大1000×)Fig.2 Spore morphologies of strain HXD5 under light microscopy (magnification, 1000×)

2.2 16S rDNA序列分析

通過BankIt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)將本研究所得序列HXD5提交到Genbank數(shù)據(jù)庫中，登錄號(hào)為KP900947。將菌株HXD5的16S rDNA與從GenBank中獲取與該菌株序列同源性較高的部分菌株(表2)16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，表明該菌株與B.subtilis、B.licheniformis、B.vallismortis、B.amyloliquefaciens聚在同一分支。通過Megalign進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)(圖4)，HXD5與B.licheniformis、B.vallismortis同源性最高，達(dá)100 %，其次為B.amyloliquefaciens(99.9 %)、B.subtilis(99.9 %)；系統(tǒng)發(fā)育樹與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化距離表得出的結(jié)果一致。結(jié)合2.1生理生化指標(biāo)結(jié)果，將HXD5鑒定為B.subtilis。

表2 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株相關(guān)信息

括號(hào)中的序號(hào)為Genbank登錄號(hào)；分支上的數(shù)字為自展值百分比；線段0.005為核酸替換率Genbank accession numbers were showed in the parentheses. The number at each branch point was the percentage supported by bootstrap. Bar: 0.0005 subsitutions per nucleotide position圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化距離Fig.4 Sequence distance of HXD5 based on 16S rDNA full-length sequence

2.3 抑菌試驗(yàn)

抑菌圈直徑由大到小為：氯霉素≥鏈霉素≥新潔爾滅≥來蘇爾。浸過來蘇爾的濾紙片，僅周圍1 mm左右范圍內(nèi)無菌生長(圖5)，未形成抑菌圈，幾乎無抑菌效果；浸泡過新潔爾滅的濾紙片，形成了17 mm的抑菌圈直徑，但抑菌圈邊緣模糊，抑菌效果較弱；氯霉素、鏈霉素均有明顯抑制HXD5的效果，抑菌圈邊緣清晰，且氯霉素優(yōu)于鏈霉素，抑菌圈直徑見表3～4。

培養(yǎng)皿直徑20 cm，a.新潔爾滅，b.來蘇爾，c.氯霉素，d.鏈霉素The diameter of culture dish was 20 centimeters, a.Bromogeramine, b.Lysol, c.Chloramphenicol Ⅲ, d.Streptomycin Ⅲ圖5 不同抗生素和消毒劑對(duì)HXD5的抑菌試驗(yàn)Fig.5 Bacteriostasis experiment of different antibiotics and disinfectants on HXD5

3 討 論

Leifert[24]等研究表明，在初代培養(yǎng)中，表面細(xì)菌引起的污染通常在2～3 d就能在外植體周圍的培養(yǎng)基表面形成明顯的水污狀、油污狀、氣泡或干縮的紅、黃、乳白等顏色的菌落；而在外植體培養(yǎng)后3～5 d后才出現(xiàn)的細(xì)菌菌落，則可能是由內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。本研究在對(duì)化血膽組培苗污染情況調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)在外植體培養(yǎng)后3～5 d沒有細(xì)菌污染，而是在10 d后才出現(xiàn)的污染，所以推測(cè)可能是內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。

在組培內(nèi)生菌污染防治的研究中，在培養(yǎng)基中加入抗生素的方法已有報(bào)道。Reed等[25]在天竺葵(Pelargoniumhortorum)組培中發(fā)現(xiàn)頭孢噻肟(Cefotaxime Sodium)的抑菌效果良好，且對(duì)芽的增殖有促進(jìn)作用。韓美麗[26]等在綠巨人(Spathiphyllumkochii)組培中研究了青霉素鈉、先鋒霉素和慶大霉素對(duì)繼代培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑制效果，結(jié)果表明，先鋒霉素的抑菌效果最好，青霉素鈉和慶大霉素次之。本研究中16S rDNA序列分析和生理生化鑒定表明引起化血膽組培苗污染的細(xì)菌是B.subtilis，抑菌試驗(yàn)表明，無論是用氯霉素還是鏈霉素，使用濃度越高，抑菌效果越好，但成本也就越高。其是否會(huì)對(duì)外植體的生長造成影響還需進(jìn)一步研究，此外還需要對(duì)抗生素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，應(yīng)選擇穩(wěn)定、耐高溫高壓的抗生素。

表3 氯霉素抑菌結(jié)果

表4 鏈霉素抑菌結(jié)果

從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)來看，HXD5與B.subtilis、B.licheniformis、B.vallismortis、B.amyloliquefaciens聚在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，表明采用分子生物方法無法將其鑒定到種，結(jié)合生理生化指標(biāo)結(jié)果，才將HXD5鑒定為B.subtilis。由此可見，基于16S rDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究有一定的局限性，16S rDNA序列同源性更適用于屬以上分類單元，對(duì)于屬以下分類單元分辨率明顯低。在某些近緣種的鑒定中，如芽孢桿菌屬中解淀粉芽孢桿菌近緣種，很難精確確定它們的分類地位。因此只有有效地將細(xì)菌經(jīng)典分類學(xué)和現(xiàn)代分子分類學(xué)進(jìn)行結(jié)合，將表型鑒定和分子生物學(xué)鑒定綜合分析才能得出更為可靠的結(jié)論。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Isolation, Identification and Control of Pollution Endophytic Bacteria during Tissue Culture ofMelasmaarvense

ZHAO Feng1, GENG Kai-you1*, HU Yi2, XIA Ti-yuan2, CHEN Ze-bin2, REN Zhen2, JIN Song2

(1.Scientific Research Department, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Agriculture College of Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China)

Using the NA culture medium to isolate the strain, the bacterial species were identified by morphology, physiological and biochemical and the sequence analysis of the 16S rDNA. The results from physiological and biochemical tests showed that the morphological characteristics of the strain HXD5 matched the descriptions ofBacillussubtilis. The sequence analysis of 16S rDNA indicated that this strain had the same embranchment with theB.amyloliquefaciens(HQ727971),B.vallismortis(FJ386541),B.licheniformis(EF644414),B.subtilis(AY583216) in the phylogenetic tree with the homology of 99.9 %-100 %. The HXD5 strain was identified asBacillussubtilis. The tests of bacterial inhibition in vitro showed that the chloromycetin had stronger antimicrobial effect than streptomycin.

Melasmaarvense; Tissue culture; Endophytic bacteria; Isolation; Identification; Control

1001-4829(2016)07-1707-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.037

2014-09-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460491)；云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目(2013FD040)；云南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(2014Y390)；昆明學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(YJL14005)；云南省高校優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項(xiàng)目資助(05000511311)；滇池流域農(nóng)業(yè)面源污染綜合防控對(duì)策研究(2016JC01)

趙 鳳(1973-)，女，云南昆明人，副教授，主要從事園林植物組織培養(yǎng)及栽培管理研究,E-mail: lmz8226647@sina.com，*為通訊作者，E-mail: 1071889543@qq.com。

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