青楊4CL基因的克隆及生物信息學(xué)分析

姜 勇，胡尚連 *，曹 穎，盧學(xué)琴，徐 剛, 龍治堅(jiān), 黃 艷

(1.西南科技大學(xué) 植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621010；2. 四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川 綿陽(yáng) 621010)

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青楊4CL基因的克隆及生物信息學(xué)分析

姜 勇1,2，胡尚連1,2 *，曹 穎1,2，盧學(xué)琴1,2，徐 剛1,2, 龍治堅(jiān)1,2, 黃 艷1,2

(1.西南科技大學(xué) 植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621010；2. 四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川 綿陽(yáng) 621010)

4CL是木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為深入研究4CL的作用奠定基礎(chǔ)并為進(jìn)一步改良青楊提供理論支撐。以青楊嫩莖為試材，采用RT-PCR方法克隆青楊4CL基因，使用NCBI、DNAMAN及ExPASy等一系列在線軟件及工具，對(duì)青楊4CL基因的編碼區(qū)、氨基酸序列及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析?？寺×饲鄺?CL基因，命名為Pc4CL(GenBank注冊(cè)號(hào): KJ490636)。該基因全長(zhǎng)1623 bp，開放閱讀框?yàn)?～1611 bp，編碼536個(gè)氨基酸，含有4CL的保守域SSGTTGLPKGV和GEICIRG及催化活性殘基His-234。Pc4CL與PtC4CL同源性最高達(dá)97.95 %。

青楊；4CL基因；克隆；生物信息學(xué)分析

4-香豆酸：輔酶A連接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL, EC6.2.1.12)是苯丙烷類代謝途徑的最后一個(gè)酶，能以不同結(jié)構(gòu)的羥基苯乙烯酸為底物，即4CL同工酶可能控制不同分支途徑的碳流量, 進(jìn)而形成不同的木質(zhì)素單體(松柏醇、芥子醇和香豆醇)[1-2]。木質(zhì)素是植物體正常生長(zhǎng)所必須的有機(jī)物大分子，根據(jù)組成單體的不同分為紫丁香基木質(zhì)素(S-木質(zhì)素)、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)和對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素(H-木質(zhì)素)[1]，具有增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度，抵抗不良外界環(huán)境侵襲之功能[3]。然而，木質(zhì)素的存在卻阻礙了植物資源在紙漿制造業(yè)的有效應(yīng)用[4]。通過抑制4CL的表達(dá)，最終調(diào)控植株木質(zhì)素的含量或單體組成，從而有利于木質(zhì)素的脫除[5]。

青楊(PopuluscathayanaRehd)原產(chǎn)我國(guó)，自然分布廣泛，隸屬于楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)落葉喬木，是造紙及膠合板材極好的原料[6-8]。然而，林木中的木質(zhì)素含量高，占木材干重的15 %～36 %[9]。因此，通過基因工程手段降低青楊木質(zhì)素含量或單體組成具有重要的意義。研究表明，4CL具有不同催化特性和底物利用特性[10]，抑制毛白楊中4CL基因的表達(dá)可顯著降低轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)素含量，最高可達(dá)41.73 %[5]。但是，有關(guān)青楊4CL基因克隆的研究目前尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究以青楊嫩莖為試材，采用同源克隆技術(shù)獲得青楊4CL編碼序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步青楊遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采自于“西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院楊樹資源圃”，將青楊嫩莖切成2 cm左右，并迅速置于液氮中保存，后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)所使用的大腸桿菌DH5α來自生命科學(xué)與工程學(xué)院植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室；而RNA提取試劑盒購(gòu)自于成都博瑞克公司；LA-Taq聚合酶、X-Gal、IPTG、PMD19-T Vctor、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EcoRⅠ以及HindⅢ限制性內(nèi)切酶等試劑均購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA鏈的合成 參照RNA提取試劑盒說明書，提取青楊嫩莖總RNA。0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，選取質(zhì)優(yōu)量高的RNA用于cDNA的合成。

1.2.2 青楊4CL基因克隆 根據(jù)其他楊樹4CL的核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)青楊4CL基因的全長(zhǎng)克隆引物。引物序列為：上游引物(P1)：5′-ATGAATCCACAAGAAGAATTCA-3′；下游引物(P2)：5′-TAACGTCTTCCATTATATGCCTG -3′。

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用LA-TaqDNA高保真聚合酶進(jìn)行4CL全長(zhǎng)序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56.5 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存[11]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T Vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 青楊4CL基因全長(zhǎng)序列的生物信息學(xué)分析

1.3.1 4種楊樹4CL基因編碼氨基酸多序列比對(duì) 使用DNAMAN和Clustal W軟件分析青楊4CL基因的全長(zhǎng)序列，并將其編碼的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的毛果楊(PopulustrichocarpaTorr, XM-002324441)、毛白楊(PopulustomentosaCarrière, AF314180)、鉆天柳(Choseniaarbutifolia, KC818108)的全長(zhǎng)4CL基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析

1.3.2 4CL基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用MEGA 5.05軟件分析青楊、毛白楊、毛果楊、鉆天柳、芒果(MangiferaindicaL., KF929405)、覆盆子4CL1(Rubusidaeus, AF239687)、覆盆子4CL2(Rubusidaeus4CL2, AF239686)、大豆4CL2(Glycinemax, AF002259)、大豆4CL1(Glycinemax,AF279267)、擬南芥4CL1(Arabidopsisthaliana, AY376729)、擬南芥4CL2(Arabidopsisthaliana, AY376728)、擬南芥4CL5(Arabidopsisthaliana, AY376732)、赤桉(EucalyptuscamaldulensisDehnh., GQ916947)、紅麻(Hibiscuscannabinus, HM151379)及大麻(CannabissativaL., KC970301)的編碼氨基酸序列。采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用隨機(jī)逐步比較的方式搜索最佳系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行Bootstrap校正，生成最終的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 4CL蛋白保守域分析 為確定4CL酶存在不同底物特異性的原因，利用MEME version 4.9.1軟件(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)在線分析上述15種植物4CL蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。參數(shù)設(shè)置，motifs數(shù)量最大值為20，motifs寬度設(shè)置為10～80。

1.3.4 4CL基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 利用ORF-finder(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/gorf/gorf.html)在線程序分析其4CL基因的開放閱讀框，再用ExPaSy工具中提供的Prot-Param軟件(http://web.expasy.org/pro-tparam/)在線分析該基因編碼的氨基酸的物理化學(xué)參數(shù)、組成、理論等電點(diǎn)、親水性以及消光系數(shù)，用ExPaSy工具提供的SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/-npsa_automat.pl?page=npsa_Sopma.html)在線預(yù)測(cè)4CL酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，最后用CPHmodels軟件(http://www.cbs.dtu.dk/-services/CPHmodels/)在線預(yù)測(cè)4CL酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用RasMol軟件對(duì)青楊、毛白楊、鉆天柳及毛果楊的4CL基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.5 4CL基因編碼蛋白的功能預(yù)測(cè) 用PSORTⅡ軟件(http://psort.hgc.jp/form2.html)分析Pc4CL蛋白的亞細(xì)胞定位，用ProtScale 軟件(http://web.expasy.org/protscale/)對(duì)Pc4CL疏水性進(jìn)行分析，再用TMpred軟件http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)Pc4CL蛋白序列跨膜區(qū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青楊4CL基因全長(zhǎng)克隆及其編碼的氨基酸序列分析

通過RT-PCR技術(shù)，獲得了青楊的4CL基因編碼序列(圖1-A)，全長(zhǎng)為1623 bp，開放閱讀框?yàn)?～1611 bp，利用ORF-finder軟件分析青楊4CL基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，獲得1個(gè)含536個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，將其命名為Pc4CL。使用NCBI的Blastp軟件分析其保守區(qū)，獲得序列的保守域。使用DNAMAN程序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到的毛白楊、鉆天柳和毛果楊4CL基因氨基酸編碼序列分別進(jìn)行比對(duì)分析，并利用Clustalw2.0對(duì)Pc4CL、毛白楊(PtC4CL)、鉆天柳(Ca4CL)及毛果楊(Pt4CL)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)(圖1-B)。

A：青楊4CL基因克隆(泳道1：marker；泳道2：目標(biāo)基因DNA片段)；B：Pc4CL與其它植物4CL的氨基酸序列比對(duì)(實(shí)線框表示氨基酸保守域；虛線框表示酶催化活性殘基；* 氨基酸一致；: 氨基酸強(qiáng)相似；·氨基酸弱相似；-氨基酸缺失)；C：Pc4CL保守區(qū)結(jié)構(gòu)域；D：Pc4CL基因序列及對(duì)應(yīng)氨基酸編碼序列(陰影區(qū)為氨基酸保守序列；*為終止密碼子)A: Cloning of 4CL gene (Lane 1:marker; Lane 2: target gene); B: Amino acid sequence alignment of Pc4CL with other 4CL(The solid line boxes indicate amino acids conserved domain; dashed box represent His-234 residues with the catalytic activity; * The same amino acid;: Strong similar of amino acid; ·Weak similar of amino acid; -amino acid missing);C: The conserved domain of Pc4CL; D:The sequence of Pc4CL gene and encoding amino acid sequence(Grey boxes contain the conserved amino acid motif; * means terminal code)圖1 青楊4CL基因克隆及其編碼氨基酸序列分析Fig.1 Cloning of 4CL gene and its encoding amino acid sequence analysis in Populus cathayana Rehd

Pc4CL氨基酸序列的15～510 bp處存在4CL的保守域，并且含有腺苷酸形成酶超家族保守域(圖1-C)。同時(shí)，通過對(duì)Pc4CL、PtC4CL、Ca4CL及Pt4CL的氨基酸序列比對(duì)得知，4條氨基酸序列均存在SSGTTGLPKGV和GEICIRG 2個(gè)保守序列(圖1-B)，前者被認(rèn)為是4CL催化反應(yīng)中與AMP結(jié)合的功能域[12]，其附近第234位點(diǎn)存在組氨酸(H)(圖1 B，虛線框)，研究表明His-234 與ATP的α-磷酸基團(tuán)形成氫鍵，降低磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，它的側(cè)鏈位置阻止CoA 過早進(jìn)入PtC4CL1 的活性中心；在第二步反應(yīng)中His-234通過側(cè)鏈的構(gòu)象變化開放CoA進(jìn)入活性中心的通路，同時(shí)奪取CoA巰基的質(zhì)子，增強(qiáng)CoA親核攻擊香豆酰-AMP 的能力，催化最終產(chǎn)物的形成[13]；而后者也是4CL中絕對(duì)保守域[14]。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Pc4CL蛋白與毛白楊、鉆天柳和毛果楊4CL基因編碼蛋白具有高度的同源性，與毛白楊的相似性為97.95 %，與鉆天柳的為94.44 %，與毛果楊的為72.53 %，推測(cè)Pc4CL與PtC4CL具有相同的功能，是合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶[5]。

2.2 4CL基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹推測(cè)(圖2-A)，Pc4CL、At4CL1及PtC4CL聚為一個(gè)類群，表明這些物種的4CL蛋白之間的親緣性較近，其中青楊和毛白楊的4CL蛋白親緣性最近，有研究表明PtC4CL對(duì)香豆酸的比活力最強(qiáng)，但對(duì)芥子酸沒有活性[15]，而Pc4CL是否具有類似功能還有待進(jìn)一步研究。

1條蛋白質(zhì)鏈由多個(gè)結(jié)構(gòu)域(domain)組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有獨(dú)立的結(jié)構(gòu)折疊(fold)和功能，并且這種折疊是獨(dú)立的[16-17]。使用MEME對(duì)Pc4CL及其它物種4CL氨基酸序列進(jìn)行保守序列分析，共獲得20個(gè)保守基序(motif)(圖2-B)，在不同4CL蛋白序列中，基序種類、排序及位置都非常保守。Pc4CL和PtC4CL中出現(xiàn)的motif種類、排序及位置完全一致，與進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。有些motif只特異性的存在于4CL中，如motif114只存在于At4CL1和At4CL5，而motif12只在Ri4CL1和Cs4CL中出現(xiàn)，推測(cè)這種差異可能導(dǎo)致不同4CL具有不同的功能及底物特異性[10]。有研究表明，Gm4CL1能夠特異性轉(zhuǎn)化芥子酸，而Gm4CL2不能轉(zhuǎn)化芥子酸[19]，通過比較Pc4CL、PtC4CL、Gm4CL1及Gm4CL2的motif發(fā)現(xiàn)，Gm4CL1中在147～156 bp存在motif13，而其它3種蛋白在此處均不存在motif13，表明147～156 bp處的motif13可能參與芥子酸的識(shí)別或結(jié)合，此推測(cè)還有待進(jìn)一步研究。

2.3 Pc4CL基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

Pc4CL與PtC4CL具有相同的氨基酸殘基數(shù)，均為536個(gè)(表1)，但分別較Ca4CL和Pt4CL少4和10個(gè)氨基酸殘基。4種植物的4CL基因編碼蛋白分子量介于58.5～61.1kD，其中最大的是Pt4CL，而最小的是PtC4CL。4種4CL蛋白帶負(fù)電的殘基數(shù)與帶正電的殘基數(shù)之差等于10，而它們的理論等電點(diǎn)大致相同(都小于7)，在植物體內(nèi)帶負(fù)電，難以與帶負(fù)電的ATP相結(jié)合，而在降低ATP負(fù)電荷的過程中，His-234可能起到關(guān)鍵性作用。蛋白質(zhì)的總親水性平均系數(shù)正值越大，表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大表示親水性越好[20]。ProtScale 軟件分析結(jié)果表明，4種蛋白質(zhì)的總親水性系數(shù)均為負(fù)值，其中絕對(duì)值最大的是Ca4CL，最小的是Pt4CL，表明4種蛋白質(zhì)均有較弱的親水性。

A：4CL蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹；B：4CL保守結(jié)構(gòu)域分析A: The clustering analysis of 4CL protein family; B: The conservative structure domain analysis of 4CL圖2 Pc4CL與其它物種4CL的聚類分析及保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 The clustering analysis and conservative structure domain analysis between Pc4CL and other species 4CL

表1 Pc4CL、PtC4CL、Ca4CL及 Pt4CL 編碼蛋白理化性質(zhì)

表2 不同4CL基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 Pc4CL基因編碼蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA軟件預(yù)測(cè)青楊、毛白楊、鉆天柳以及毛果楊4CL基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明(表2)，在4種植物4CL基因編碼的蛋白中，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋和無規(guī)卷曲，這2種二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基約占70 %左右；而在這2種結(jié)構(gòu)中，參與形成無規(guī)卷曲的氨基酸較α-螺旋多10 %，構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角的氨基酸數(shù)較少，所占比例為6.85 %～8.02 %。在4種蛋白中，構(gòu)成各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)量基本一致。有研究表明生物體內(nèi)的跨膜蛋白主要以α-螺旋形式跨膜[21]，而4CL中大約有30 %的氨基酸殘基參與形成α-螺旋，推測(cè)4CL為膜蛋白，疏水性殘基構(gòu)成跨膜區(qū)域，而親水性殘基裸露在水環(huán)境，從而形成4CL蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)，利用CPHmodels程序預(yù)測(cè)Pc4CL、PtC4CL、Ca4CL及Pt4CL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)。發(fā)現(xiàn)4種植物的4CL蛋白質(zhì)具有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，均含有大量的α-螺旋和無規(guī)卷曲。同時(shí)，也存在少量的β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈，與上述二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。

2.5 Pc4CL功能預(yù)測(cè)

通過PSORTⅡ軟件分析Pc4CL蛋白的亞細(xì)胞定位，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Pc4CL占44.4 %，在分泌系統(tǒng)的小囊泡中占11.1 %，表明4CL蛋白可能主要分布在質(zhì)膜上，屬于膜蛋白，在細(xì)胞膜上行使其功能。

ProtScale 軟件分析結(jié)果表明，大約在Pc4CL蛋白的77-81區(qū)域、88-92區(qū)域、224-257區(qū)域、274-285區(qū)域、335-346區(qū)域、448-453區(qū)域以及475-481區(qū)域具有很強(qiáng)的疏水性，其中疏水性最強(qiáng)的在229，親水性系數(shù)高達(dá)2.9(圖4-A)。結(jié)合TMpred軟件預(yù)測(cè)Pc4CL蛋白質(zhì)序列跨膜區(qū)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明Pc4CL可能在以80、235、246為中心位置形成由膜內(nèi)到膜外的跨膜區(qū)域；在以81、97、245、336為中心位置形成由膜外到膜內(nèi)的跨膜區(qū)域(圖4-B)。

圖3 Pc4CL編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The encoding protein tertiary structure prediction of Pc4CL

A：Pc4CL疏水性分析；B：Pc4CL蛋白序列跨膜區(qū)預(yù)測(cè)(得分在500以上顯著)A: Hydrophobicity analysis of Pc4CL; B: The transmembrane region prediction of Pc4CL protein sequence (score above 500 significantly)圖4 Pc4CL跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)Fig.4 Transmembrane region prediction of Pc4CL

3 討論與結(jié)論

本研究采用RT-PCR技術(shù)從青楊中獲得一條全長(zhǎng)為1623 bp的基因序列，其開放閱讀框?yàn)?～1611，編碼536個(gè)氨基酸。大約在該氨基酸序列15～510處存在4CL的保守域及具有保守序列SSGTTGLPKGV和GEICIRG，將其命名為Pc4CL，Genbank 注冊(cè)號(hào)為KJ490636。

序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，Pc4CL與PtC4CL同源性高達(dá)97.95 %，表明Pc4CL可能是木質(zhì)素合成過程中的關(guān)鍵酶，并且其作用底物可能是香豆酸而非芥子酸，為了進(jìn)一步確認(rèn)Pc4CL的底物是香豆酸及參與底物識(shí)別或結(jié)合的基序，使用MEME對(duì)Pc4CL及其它物種4CL氨基酸序列進(jìn)行保守序列分析，共獲得20個(gè)保守基序(motif)(圖2-B)。研究表明，Gm4CL1能夠特異性轉(zhuǎn)化芥子酸，而Gm4CL2不能轉(zhuǎn)化芥子酸[19]，通過比較Pc4CL、PtC4CL、Gm4CL1及Gm4CL2的motif發(fā)現(xiàn)，Gm4CL1中在147～156 bp存在motif13，而其它3種蛋白在此處均不存在motif13，表明147～156 bp處的motif13可能參與芥子酸的識(shí)別或結(jié)合，此推測(cè)還有待進(jìn)一步研究。PSORTⅡ軟件分析Pc4CL蛋白的亞細(xì)胞定位，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Pc4CL占44.4 %，在分泌系統(tǒng)的小囊泡中占11.1 %，表明Pc4CL蛋白可能主要分布在質(zhì)膜上，屬于膜蛋白，在細(xì)胞膜上行使其功能。與該分析結(jié)果一致，TMpred軟件預(yù)測(cè)Pc4CL可能在以80、235、246為中心位置形成由膜內(nèi)到膜外的跨膜區(qū)域；在以81、97、245、336為中心位置形成由膜外到膜內(nèi)的跨膜區(qū)域(圖4-B)。

[1]楊冬梅. 東方山羊豆4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)基因的克隆與表達(dá)研究[D]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010.

[2]李金花, 張綺紋, 牛正田, 等. 木質(zhì)素生物合成及其基因調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 世界林業(yè)研究, 2007,20(1): 29-37.

[3]Lewis N G, Yamamoto E. Lignin: occurrence, biogenesis and biodegradation[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1990,41: 455-496

[4]耿 颯, 徐存拴, 李玉昌. 木質(zhì)素的生物合成及其調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2003, 23(1): 171-81.

[5]賈彩虹, 趙華燕, 王宏芝, 等. 抑制4CL基因表達(dá)獲得低木質(zhì)素含量的轉(zhuǎn)基因毛白楊[J].科學(xué)通報(bào), 2004, 49(7): 662-666.

[6]賀俊東, 胥 曉, 郇慧慧, 等. 青楊雌雄扦插苗光合作用日變化與葉綠素?zé)晒鈪?shù)特征[J].植物研究, 2014, 34(2): 219-225.

[7]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志第二十卷第二分冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1984.

[8]蘇曉華, 黃秦軍, 張香華, 等. 中國(guó)大青楊基因資源研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2001, 14(5): 472-478.

[9]Higuchi T. Biosynthesis of lignin. In: Higuchi T (eds) Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components[M]. New York: Academic Press, 1985: 141-160.

[10]Allina S M, Pri-Hadash A, Theilmann D A, et al. 4-Coumarate: Coenzyme A Ligase in Hybrid Poplar. Properties of Native Enzymes, cDNA Cloning, and Analysis of Recombinant Enzymes[J]. Plant Physiol, 1998, 116(2): 743-754.

[11]劉紅梅, 胡尚連, 盧學(xué)琴, 等. 青楊CCoAOMT基因的克隆及其生物信息學(xué)分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(11): 2670-2674.

[12]Challis G L, Ravel J, Townsend C A. Predictive, structure-based model of Amino acid recognition by nonribosomal peptide synthetase adenylation domains[J]. Chem Biol, 2000(7): 211-224.

[13]任百光, 李德峰, 鄭彩霞, 等. His-234是毛白楊對(duì)香豆酸:CoA連接酶的重要酶催化活性殘基[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2013, 40(11):1165-1172.

[14]Fulda M, Heinz E, Wolter F P. The fad D gene of Escheri chia coli K12 is located close to rnd at 39.6 min of the chromosomal map and is a new member of the AMP-binding protein family[J]. Mol Gen Genet, 1994, 242(3): 241-249.

[15]饒國(guó)棟, 張永卓. 毛白楊4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL3)的酶學(xué)特征研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2013, 26(5): 542-547.

[16]Murzin A G, Brenner S E, Hubbard T, et al. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequence and structures[J]. J. Mol. Biol., 1995, 247: 536-540.

[17]Orengo C A, Michie A D, Jones S, et al. CATH-A hierarchic classification of protein domain structures[J]. Structure, 1997(5): 1093-1108.

[19]Lindermayr C, Mollers B, Fliegmann J, et al. Divergent Members of a Soybean (GlycinemaxL.)4-coumarate:Coenzyme A Ligase Gene Family[J]. Eur J Biochem, 2002, 269(4):1304-1315.

[20]劉雪梅, 陳 肅. 白樺4CL蛋白結(jié)構(gòu)分析及同源建模[J]. 生物信息學(xué)分析, 2010, 8(1): 38-42.

[21]Wallin E, von Heijne G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms[J]. Protein Sci, 1998(7):1029-1038.

(責(zé)任編輯 李 潔)

Cloning and Bioinformatics Analysis of 4CLGene inPopuluscathayanaRehd

JIANG Yong1,2, HU Shang-lian1,2*, CAO Ying1,2, LU Xue-qin1,2, XU Gang1,2, LONG Zhi-jian1,2, HUANG Yan1,2

(1. Lab of Plant Cell Engineering, Southwest University of Science and Technology, Sichuan Mianyang 621010, China; 2. Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province, Sichuan Mianyang 621010, China)

4CL (4-coumarate:CoA ligase) is an important biosynthase in the lignin biosynthesis, and its biological information was analyzed to lay the foundation for the further research on the role of 4CLgene and to provide theoretical support for further improvement ofPopuluscathayanaRehd. The young stem ofPuluscathayanaRehd was used to clone the 4CLgene with RT-PCR. The encoding region and amino acid sequence of 4CLgene, and the structure and function of protein encoded by 4CLgene were analyzed by NCBI, DNAMAN, ExPASy and some other online tools. The 4CLgene was cloned inPopuluscathayanaRehd. It was namedPc4CL(GenBank number: KJ490636). The full-length of nucleotide sequence is 1623 bp, the sequence of 1-1611 bp is the open reading frame encoding 536 amino acids. The conserved SSGTTGLPKGV and GEICIRG domain and His-234 residues with the catalytic activity were found inPc4CL. Phylogenetic analysis showed thatPc4CLhad 97.95 % similarity with PtC4CL.

PopuluscathayanaRehd; 4CLgene; Cloning; Bio-information analysis

1001-4829(2016)07-1547-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.009

2015-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31400257，31400 333)；四川省“十二五”重點(diǎn)公關(guān)資助項(xiàng)目(2011YZGG-10)；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金資助項(xiàng)目(2013JY0182)；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心基金資助(12zxsk07，13zxsk01)

姜 勇(1991-)，男，四川眉山人，碩士研究生，從事植物遺傳與品種改良研究，E-mail:yongjiang59@126.com，Tel：15982962782，*為通訊作者：胡尚連， E-mail:hushanglian@126.com。

S792.113

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