太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性研究

馬秀蘭，馬建萍，張穎，艾合買提·阿不都熱依木，李靜茹，曾琳，鄭永唐，楊柳萌，馬麗雪

1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，國家中醫(yī)臨床研究基地艾滋病研究室，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國科學(xué)院昆明動物研究所分子免疫藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223

太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性研究

馬秀蘭1，馬建萍1，張穎1，艾合買提·阿不都熱依木1，李靜茹1，曾琳1，鄭永唐2，楊柳萌2，馬麗雪2

1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，國家中醫(yī)臨床研究基地艾滋病研究室，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國科學(xué)院昆明動物研究所分子免疫藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223

目的 評價太芪培元顆粒體外對HIV-1病毒的抑制活性。方法 MTT法檢測太芪培元顆粒細(xì)胞毒性；通過細(xì)胞病變法檢測太芪培元顆粒對HIV-1急性感染的抑制活性；應(yīng)用HIV-1 p24抗原ELISA檢測太芪培元顆粒對HIV-1急性感染細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制活性，并計(jì)算藥物治療指數(shù)。結(jié)果 太芪培元顆粒細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)CC50為（3.761±0.370）mg/mL；合胞體抑制實(shí)驗(yàn)EC50為（0.454 5±0.204 6）mg/mL，治療指數(shù)為5.84～12.97；p24抑制實(shí)驗(yàn)EC50為（0.56±0.27）mg/mL，治療指數(shù)為5.30～8.74。結(jié)論 太芪培元顆粒體外抗HIV-1活性較弱。

太芪培元顆粒；人類免疫缺陷病毒；體外抗病毒活性；免疫機(jī)制

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的傳染性疾病，以嚴(yán)重?fù)p害全身免疫系統(tǒng)為特征。目前，抗HIV藥物依然是AIDS防治的主要手段。太芪培元顆粒是新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，其主要功效為益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)益脾腎，臨床主要用于治療AIDS證屬氣陰兩虛、肺腎不足者。經(jīng)長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，該制劑可明顯改善AIDS患者癥狀，提高其生存質(zhì)量，對患者CD4+T淋巴細(xì)胞水平有提高作用[1-6]。本實(shí)驗(yàn)通過太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性的研究，為該藥作用機(jī)制研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞和病毒

人T淋巴細(xì)胞系C8166和HIV-1實(shí)驗(yàn)株HIV-1ⅢB，英國Medical Research Council AIDS Reagent Project惠贈。按常規(guī)方法制備HIV-1ⅢB，滴定并計(jì)算病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。將病毒貯存液進(jìn)行分裝，-70 ℃保存。實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞和病毒按照常規(guī)方法進(jìn)行凍存及復(fù)蘇。

1.2 藥物

太芪培元顆粒，新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司，批號130808。疊氮胸苷(3'-Azido-3'-deoxythymidine，AZT)，Sigma公司。

1.3 主要試劑與儀器

HEPES、MTT、DMF、青霉素、硫酸鏈霉素、谷氨酰胺，Sigma公司；2-巰基乙醇，Bio-Rad公司；RPMI-1640和胎牛血清，Gibco公司。酶標(biāo)儀ELX-800（BIO-TEK），微量移液器（Gilson），二級生物安全柜Froma ClassⅡ、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HIV-1感染性滴定

HIV-1ⅢB按Johnson＆Byington所述方法改良進(jìn)行滴定，按Reed＆Muench方法計(jì)算病毒的TCID50[7]。

2.2 C8166細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將100 μL C8166細(xì)胞懸液（4×105/mL）與不同濃度待測藥物溶液混合，設(shè)3個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含任何藥物的對照孔，MTT法檢測細(xì)胞毒性。于酶標(biāo)儀570 nm波長處測定光密度（OD）值（參考波長630 nm），計(jì)算得到對50%細(xì)胞產(chǎn)生毒性時的化合物濃度（CC50），即對50%正常T淋巴細(xì)胞系C8166細(xì)胞產(chǎn)生毒性時的藥物濃度。計(jì)量資料以±s表示，按Reed＆Muench法計(jì)算CC50。

2.3 HIV-1ⅢB致細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)

按100 μL/孔梯度倍比加稀釋藥物于96孔培養(yǎng)板，再將8×105/mL C8166細(xì)胞50 μL/孔接種至培養(yǎng)板，加50 μL HIV-1ⅢB稀釋上清液，1300 TCID50/孔。設(shè)置重復(fù)孔3個，同時以不含任何藥物正常細(xì)胞作為對照孔。陽性藥物對照為AZT。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 d，100倍倒置顯微鏡下對合胞體形成計(jì)數(shù)。50%有效濃度（EC50）為抑制合胞體形成50%時的藥物濃度。計(jì)量資料以±s表示，按Reed＆Muench法計(jì)算EC50。

2.4 HIV-1ⅢB急性感染C8166細(xì)胞中病毒復(fù)制抑制實(shí)驗(yàn)

將4×105個/mL C8166細(xì)胞與HIV-1ⅢB（MOI＝0.04）、HIV-1RF（MOI＝0.4）37 ℃感染2 h，1500 r/min離心，PBS洗滌3次，去除游離的病毒離子，取100 μL細(xì)胞接種至含100 μL不同稀釋度待測化合物96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)上清液3000 r/min離心后收集，用終濃度0.5%Triton X-100裂解滅活。采用捕獲p24抗原ELISA檢測。2 μL/板抗鼠IgG-Fc抗體4 ℃鋪板過夜；5%脫脂奶粉4 ℃封板過夜；加自制的鼠抗p24單抗100 μL/孔，置37 ℃溫育60 min；加100 μL/孔裂解感染細(xì)胞培養(yǎng)上清，37 ℃、2 h；加100 μL/孔1∶100稀釋的自制兔抗p24多抗，置37 ℃溫育；加100 μL/孔1∶20 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，置37 ℃溫育；加OPD底物反應(yīng)液。10 min后，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。ELISA測定OD值，測定波長為490 nm，參考波長630 nm。計(jì)量資料以±s表示，計(jì)算p24抗原抑制率。

3 結(jié)果

3.1 太芪培元顆粒的細(xì)胞毒性作用

太芪培元顆粒組CC50值為（3.761±0.370）mg/mL，明顯高于AZT組（1371.37 μg/mL）。結(jié)果見表1。

表1 2組不同濃度C8166細(xì)胞毒性比較（±s）

表1 2組不同濃度C8166細(xì)胞毒性比較（±s）

組別 濃度 細(xì)胞存活率/% CC50太芪培元顆粒組5 mg/mL 22.62± 4.39 2.5 mg/mL 75.80± 0.47 1.25 mg/mL 100.47± 2.33 0.625 mg/mL 106.01± 1.73 0.312 5 mg/mL 100.47±11.11 0.156 25 mg/mL 87.15± 2.20陽性藥組 2 μg/mL 39.33± 1.20（3.761±0.370）mg/mL 0.4 μg/mL 84.83± 2.50 0.08 μg/mL 112.17± 1.50 0.016 μg/mL 115.11± 1.50 0.003 2 μg/mL 115.90± 1.40 0.000 64 μg/mL 108.26± 6.70 1371.37 μg/mL

3.2 太芪培元顆粒對HIV-1ⅢB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞病變的抑制作用

太芪培元顆粒組EC50值為（0.454 5±0.204 6）mg/mL與AZT組（0.458 5±0.371 6）mg/mL比較差異不明顯。結(jié)果見表2。

表2 2組不同濃度HIV-1ⅢB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞病變抑制作用比較（±s）

表2 2組不同濃度HIV-1ⅢB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞病變抑制作用比較（±s）

組別 濃度 細(xì)胞病變抑制率/% EC50/（mg/mL）太芪培元顆粒組5 mg/mL 100 1 mg/mL 83.20±3.18 0.2 mg/mL 37.60±4.80 0.04 mg/mL 1.60±2.40陽性藥組 200 ng/mL 100 0.454 5±0.204 6 40 ng/mL 100 8 ng/mL 92.80±2.40 1.6 ng/mL 83.20±4.16 0.32 ng/mL 61.60±5.23 0.064 ng/mL 23.60±4.21 0.458 5±0.371 6

3.3 太芪培元顆粒對HIV-1ⅢB感染C8166細(xì)胞p24表達(dá)的抑制作用

太芪培元顆粒對HIV-1復(fù)制表達(dá)p24抗原的抑制率隨藥物濃度的增加而升高，而對照藥AZT的趨勢與其相同，見表3。

表3 2組不同濃度HIV-1ⅢB感染C8166細(xì)胞后p24表達(dá)抑制作用比較（±s）

表3 2組不同濃度HIV-1ⅢB感染C8166細(xì)胞后p24表達(dá)抑制作用比較（±s）

組別 濃度 p24抗原抑制率/% EC50太芪培元顆粒組 5 mg/mL 100.44± 0.62 1 mg/mL 74.73±13.56 0.2 mg/mL 23.20±19.38 0.04 mg/mL 9.68±23.07 0.008 mg/mL 11.55±16.48 0.001 6 mg/mL -陽性藥組 200 μg/mL 100.32± 0.39（0.56±0.27）mg/mL 40 μg/mL 100.10± 0.22 80 μg/mL 98.62± 1.66 1.6 μg/mL 91.88± 3.18 0.32 μg/mL 7.70±14.12 0.064μ g/mL -1.92±15.95（0.43±0.29）ng/mL

3.4 太芪培元顆粒對HIV-1活性治療指數(shù)的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及公式（治療指數(shù)＝CC50÷EC50），太芪培元顆粒合胞體抑制實(shí)驗(yàn)治療指數(shù)為5.84～12.97，對照藥AZT治療指數(shù)為1 902 038～6 996 785；p24抑制實(shí)驗(yàn)中，太芪培元顆粒治療指數(shù)為5.30～8.74，對照藥AZT治療指數(shù)為1 904 680～9 795 500。表明太芪培元顆粒體外抗HIV-1病毒活性較弱。

4 討論

太芪培元顆粒用于治療氣陰兩虛、肺腎不足型AIDS，以太子參、生地黃為君藥。太子參味甘、微苦，歸脾、肺經(jīng)，功效為補(bǔ)氣健脾、生津潤肺；生地黃味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，功效為清熱涼血、養(yǎng)陰生津。本方重用二藥，以達(dá)益氣養(yǎng)陰之功效。該藥在臨床應(yīng)用中可改善患者癥狀體征，提高免疫力，但本研究體外抗HIV-1病毒結(jié)果顯示其抗HIV活性較弱。

近年來，中醫(yī)藥對AIDS的防治研究成果初顯，但其作用機(jī)制的研究依然是難點(diǎn)，尤其是中藥復(fù)方的作用機(jī)制研究。在藥物體外抗HIV病毒研究中，篩選了大量中藥及其有效成分均有體外抗病毒活性。大量臨床研究表明，中藥復(fù)方在AIDS治療的各個領(lǐng)域均有所長，例如對帶狀皰疹的中西醫(yī)結(jié)合治療，對高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療相關(guān)血脂異常的研究，對患者免疫重建的研究等，均取得較好的療效[8-11]。與此同時，研究者也指出，中醫(yī)藥治療的療效可能是通過改善患者免疫功能低下等機(jī)制起到緩解臨床癥狀的作用，但具體作用機(jī)制及如何確定中藥介入的指征和時機(jī)等問題需要深入研究[12]。

目前研究中可見小樣本觀察提出中藥治療不僅可以提高CD4+水平，同時還可以降低病毒載量[13]，但是缺乏大樣本規(guī)范研究的數(shù)據(jù)。有學(xué)者提出運(yùn)用中醫(yī)免疫觀，從防治、養(yǎng)生的多方面入手，調(diào)整HIV/AIDS患者的免疫平衡，發(fā)揮中醫(yī)藥在診治過程中微觀調(diào)節(jié)與宏觀辨證相結(jié)合的優(yōu)勢，通過進(jìn)行相應(yīng)的免疫調(diào)理達(dá)到提高免疫能力的治療目的[14]。

綜上，中醫(yī)藥防治AIDS要找準(zhǔn)切入點(diǎn)，不可盲目以抗病毒為目標(biāo)，偏離了中醫(yī)藥臨床療效的實(shí)際意義。

[1] 馬建萍,劉建國,馬秀蘭,等.中維醫(yī)結(jié)合治療艾滋病臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(8)：1584-1586.

[2] 張穎,馬建萍,馬秀蘭,等.中藥治療HIV感染療效觀察[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(12)：2628-2630.

[3] 曾琳,馬建萍,艾合買提?阿不都熱依木,等.平艾合劑1號方改善AIDS/HIV感染者生存質(zhì)量的研究[J].新中醫(yī),2012,44(8)：60-61.

[4] 李靜茹,馬建萍,馬秀蘭,等.平艾合劑I號方治療HIV／AIDS患者107例臨床研究[J].世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(5)：877-880.

[5] 艾合買提?阿不都熱依木,馬秀蘭,張穎,等.中藥對20例HIV/AIDS患者免疫功能影響的臨床觀察[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(3)：491-492.

[6] 艾合買提?阿不都熱依木,馬建萍,馬秀蘭,等.平艾合劑治療41例HIV/AIDS患者臨床觀察[J].世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(7)：1611-1615.

[7] 龍晶,侯曉敏,長高宏,等.八棱絲瓜蛋白1的體外抗HIV-1活性[J].中國天然藥物,2008,6(5)：372-376.

[8] 潘菊華,黃世敬,吳巍,等.艾滋病帶狀皰疹中西醫(yī)結(jié)合臨床研究探討[J].世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,13(2)：244-247.

[9] 倪量,王融冰,郭會軍,等.中藥治療HAART相關(guān)血脂異常的臨床研究[J].中國中藥雜志,2015,38(15)：2443-2447.

[10] 吳欣芳,王階,李勇.免疫1號聯(lián)合HAART對HIV/AIDS患者免疫功能重建的干預(yù)研究[J].中國中藥雜志,2015,38(15)：2453-2457.

[11] 劉震,王階,林洪生,等.中藥免疫2號方對艾滋病患者免疫重建的研究[J].中國中藥雜志,2015,38(15)：2458-2462.

[12] 岑玉文,譚行華,張堅(jiān)生,等.中西醫(yī)結(jié)合療法改善艾滋病合并肺部感染患者中醫(yī)癥候的隨機(jī)對照研究[J].中國中藥雜志,2015,38(15)：2448-2452.

[13] 梁杰,徐剛.中醫(yī)藥對HIV/AIDS患者的CD4+細(xì)胞及病毒載量影響的研究[J].云南中醫(yī)藥雜志,2012,33(10)：30-31.

[14] 王丹妮,郭會軍.從中醫(yī)免疫觀調(diào)節(jié)HIV/AIDS患者免疫平衡[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2012,18(10)：1140-1141.

Study on Vitro Anti-HIV-1 Activity of Taiqi Peiyuan Granules

MA Xiu-lan1, MA Jian-ping1,

ZHANG Ying1, ABUDUREYIMU Aihemaiti1, LI Jing-ru1, ZENG Lin1, ZHENG Yong-tang2, YANG Liu-meng2, MA Li-xue2(1. Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University, AIDS Lab of National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine, Urumqi 830000, China; 2. Laboratory of Molecular Immunopharmacology, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China)

Objective To evaluate the vitro anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules. Methods MTT was used to detect cytotoxicity of Taiqi Peiyuan Granules; cytopathy method was used to detect the inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules on acute infection of HIV-1; HIV-1 p24 antigen ELISA detection was used to detect inhibitory activity of Taiqi Peiyuan Granules for virus replication of HIV-1 acute infection cells, and count the medical therapeutic indexes. Results CC50of Taiqi Peiyuan Granules in cytotoxicity test was 3.761±0.370 mg/mL; the EC50of inhibition syncytial test was 0.454 5±0.204 6 mg/mL; the therapeutic index was between 5.84 and 12.97; p24 of Taiqi Peiyuan Granules in inhibition experiments was 0.56±0.27 mg/mL, and the therapeutic index was between 5.30 and 8.74. Conclusion Anti-HIV-1 activity of Taiqi Peiyuan Granules is relatively weak.

Taiqi Peiyuan Granules; human immunodeficiency virus; vitro antiviral activity; immunologic mechanism

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.016

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0061-03

2015-05-08；編輯：華強(qiáng)）

國家科技重大專項(xiàng)（2014ZX10005003）；新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目（XJC201181）

馬建萍，E-mail：majianpingm@163.com