鹿角靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析

姜芳燕，李 花，尹樂樂，馬 軍，王輝芳

(1海南熱帶海洋學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022；2長沙市公安局刑偵支隊，湖南 長沙 410004)

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鹿角靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析

姜芳燕1，李 花2，尹樂樂1，馬 軍1，王輝芳1

(1海南熱帶海洋學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022；2長沙市公安局刑偵支隊，湖南 長沙 410004)

采用同源克隆法,從Ganodermaamboinense07基因組中成功PCR擴(kuò)增到編碼FIP-gam的全長基因,并進(jìn)行測序.通過生物信息學(xué)分析,可知FIP-gam基因全長333 bp,編碼107個氨基酸,理論分子量為12.0 kDa,等電點(diǎn)為4.4 8.進(jìn)化樹及序列分析結(jié)果顯示,FIP-gam與靈芝組FIPs同源性較高,而與金針菇、草菇和血紅叢赤殼的FIPs同源性較低.采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模,結(jié)果表明FIP-gam為α-螺旋和β-折疊形成啞鈴形的二聚體蛋白.本研究為進(jìn)一步高效表達(dá)FIP-gam及其結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ).

Ganodermaamboinense;免疫調(diào)節(jié)蛋白;基因克隆;生物信息學(xué)

0 引言

靈芝(Ganodermasp.)是我國傳統(tǒng)藥用真菌,含有多糖、三萜類、蛋白類、甾醇、脂肪酸、微量元素等多種營養(yǎng)和藥用成分,它們在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、心血管病以及抗菌中發(fā)揮著不同的作用[1].近年來,隨著生物技術(shù)在藥物研究和開發(fā)中的應(yīng)用,特別是對中草藥中基因、蛋白和藥理作用之間關(guān)系的逐漸探索,靈芝蛋白質(zhì)的研究逐漸得到重視[2].真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(Fungal Immunomodulatory Protein,FIP)是從某些藥(食)用真菌中提取的具有與真菌凝集素和免疫球蛋白相類似的結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)功能的一類小分子蛋白質(zhì)[3]. 1989年,Kino等首次從赤芝(G.lucidum)子實(shí)體中分離獲得FIP,并命名為Ling Zhi-8(LZ-8或FIP-glu)[4].到目前為止,已分別從赤靈芝(G.lucidum)、松杉靈芝(G.tsugae)、紫芝(G.japoncium)、小孢靈芝(G.microsporum)、紫芝(G.sinensis)、金針菇(Flammulinavelutipes)及草菇(Volvariellavolvacea)中得到了7種FIPs,分別為LZ-8(FIP-glu)、FIP-gts、FIP-gja、FIP-gmi、FIP-gsi、FIP-fve和FIP-vvo,形成了一個新的蛋白質(zhì)家族——FIPs[5-7].已分離出的天然FIPs的基本特征為分子量約12～13 kDa,110～114個氨基酸殘基.林忠等[8]和Lin等[9]研究報道,FIPs在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤病等方面具顯著效果.

鹿角靈芝(G.amboinense)因其形狀似鹿角而得名,主要產(chǎn)于我國海南和云南等地區(qū)[10].目前對鹿角靈芝的研究主要集中于多糖和三萜類化合物的提取、分離和生理活性的研究[11],而有關(guān)其蛋白質(zhì)研究報道較少.因此,筆者開展了鹿角靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-gam)基因克隆的研究,并應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對其編碼的蛋白進(jìn)行一系列的分析,以期為FIP-gam的后續(xù)高效表達(dá)打下基礎(chǔ),同時也為其在開發(fā)FIPs相關(guān)保健產(chǎn)品、功能性食品以及免疫治療藥物等方面提供理論參考和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

G.amboinense07購于江蘇新沂市康原食用菌研究所.PCR相關(guān)試劑如r-TaqDNA聚合酶、DNA Marker、dNTPs等購自北京三博遠(yuǎn)志有限公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司.CTAB、乙醇和異戊醇等常規(guī)試劑購自?？谔斓厣锛夹g(shù)有限公司.

1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯333g,葡萄糖20g,磷酸氫二鉀3g,硫酸鎂1.5 6g.

固體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯330g,葡萄糖19.8g,磷酸氫二鉀2.97g,硫酸鎂1.5 4g,瓊脂17.82g.

1.3 主要分子操作

靈芝總DNA提取和PCR產(chǎn)物回收等分子操作參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行.通過GenBank查詢比對,克隆FIP-gam基因保守區(qū)所用簡并引物為GA-F(HHGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG)和GA-R(CTAGTTCCACTGG GCGATGATGAAGTC).以G.amboinense07基因組為模板,以GA-F和GA-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增獲得約300 bp的DNA保守片段,送往深圳華大基因有限公司測序.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將FIP-gam氨基酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行BLASTP比對,搜索同源蛋白序列,以確定FIP-gam的歸屬.系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參照文獻(xiàn)[13].

1.5 FIP-gam序列分析

FIP-gam基因編碼蛋白的理化性質(zhì)采用ProtParam預(yù)測；信號肽使用SignalP 4.1 Server進(jìn)行分析；亞細(xì)胞定位采用CELLO v.2.5 預(yù)測; 二級結(jié)構(gòu)采用SOPMA進(jìn)行分析,并應(yīng)用SWISS-MODEL通過同源建模的方法,預(yù)測FIP-gam的三級結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與討論

圖1 FIP-gam基因保守片段PCR電泳圖(泳道M：分子量DL2000,泳道1：FIP-gam)

2.1 FIP-gam基因保守片段的克隆

以鹿角靈芝(G.amboinense07)的基因組為模板,以GA-F和GA-R為引物,進(jìn)行基因保守PCR擴(kuò)增,目的片段大小為300 bp左右的條帶,結(jié)果如圖1所示.回收目的片段送往深圳華大基因有限公司測序,FIP-gam基因保守片段的測序結(jié)果顯示,該片段長為333 bp,條帶與目的片段大小相符合.

2.2 FIP-gam理化性質(zhì)分析

采用ProtParam對FIP-gam氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析.結(jié)果表明,FIP-gam分子式為C542H813N139O167S,分子量為11980.3 ,等電點(diǎn)為4.4 8.其氨基酸數(shù)目為107,其中負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為12；正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為8.FIP-gam的不穩(wěn)定系數(shù)為3.01,該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白.A280 nm摩爾消光系數(shù)：19940；A280nm消光系數(shù)：1.6 44 mg/mL；脂溶系數(shù)：80.09；總平均親水性值(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.2 44,說明FIP-gam為親水蛋白.

2.3 FIP-gam蛋白結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測和分析

2.3.1 信號肽分析

采用SingalP 4.1 對FIP-gam進(jìn)行信號肽分析.結(jié)果表明,基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neural networks,NN),其預(yù)測值為Smean score；基于隱馬爾可夫模型(hidden Markov models,HMM),其預(yù)測值為Sprob.將SignalP 4.1 預(yù)測所得Smeanscore=0.2 40和HMM Cmaxscore=0.3 99等數(shù)值帶入公式L=-918.2 35-123.4 55×Smeanscore+1983.4 4×HMM Cmaxscore,對L值進(jìn)行計算,L>0的蛋白為具信號肽的分泌蛋白.FIP-gam的L值=-386.4 85<0,說明FIP-gam不具有信號肽.

2.3.2 亞細(xì)胞定位預(yù)測

采用CELLO v.2.5 對FIP-gam進(jìn)行亞細(xì)胞定位檢測,結(jié)果則顯示其預(yù)測FIP-gam在細(xì)胞(2.1 22)和周質(zhì)空間(0.826)均有分布,其中細(xì)胞外分布較多.在真核細(xì)胞中,大多數(shù)蛋白都是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體蛋白分泌途徑分泌到細(xì)胞外,這個過程被稱為經(jīng)典分泌途徑[14].根據(jù)信號肽預(yù)測可知,FIP-gam不具有信號肽,不能通過經(jīng)典分泌途徑分泌到細(xì)胞外.在真核細(xì)胞中,有少數(shù)蛋白質(zhì)的分泌并不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑,而是通過其他途徑進(jìn)行分泌,這些在細(xì)胞外有明確功能的蛋白質(zhì)并不含有信號肽,這類分泌途徑被稱為非經(jīng)典分泌途徑[14].真核細(xì)胞蛋白非經(jīng)典分泌與細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、腫瘤形成、傳染病病理學(xué)等密切相關(guān)[14],而目前研究證明FIPs在促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、抗過敏、抗腫瘤和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等方面均有重要作用[8, 9].因此,推測FIP-gam的分泌方式應(yīng)屬于真核細(xì)胞非經(jīng)典蛋白分泌途徑.但由于真核細(xì)胞非經(jīng)典分泌途徑較多,所以目前仍不清楚FIP-gam屬于何種方式.

2.4 FIP-gam氨基酸序列同源性分析

將FIP-gam氨基酸序列提交NCBI,采用BLASTP搜索蛋白庫,查找相同或相似的氨基酸序列,應(yīng)用DNAMAN 6.0進(jìn)行單序列比對及同源性分析,結(jié)果如圖2所示.由圖可知,FIP-gam具有FIPs家族標(biāo)志性氨基酸殘基“-FDY-P”、“-KAY-YRV”、“-GYG-”和“-IADT-TI”等保守序列[8].不同F(xiàn)IPs的氨基酸序列具有一定的同源性,其中FIP-gam與黃靈芝(G.multiplicatum)FIP-gmu、泰山靈芝(G.taishanense)FIP-gta、赤芝(G.lucidum)FIP-glu、紫芝(G.japoncium)FIP-gja、川芝(G.sichuanense)FIP-gsi、松杉靈芝(G.tsugae)FIP-gts[15]和LZ-8等FIPs的同源性較高(大于86%),分別為86.5 5%、86.4 4%、87.2 9%、89.5 7%、87.2 9%、93.6 9%和93.6 9%.與黑芝(G.atrum)FIP-gat、黑靈芝(G.astum)FIP-gas[16]、樹舌靈芝(G.applanatum)FIP-gap以及小孢靈芝(G.microsporum)FIP-gmi的同源性略低,分別為79.2 8%、79.2 8%、73.4 5%和79.2 8%.而FIP-gam與非靈芝屬的FIPs之間同源性較低,如金針菇(F.velutipes)FIP-fve(58.77%)、草菇(Volvariellavolvacea)FIP-vvo[6](53.98%)和血紅叢赤殼(Nectriahaematococca)FIP-nha(60.5 3%).

圖2 不同F(xiàn)IPs氨基酸序列比對

(LZ-8(GenBank：AAA33350.1 )、金針菇(F.velutipes)FIP-fve(GenBank：GU388420.1 )、樹舌靈芝(G.applanatum)FIP-gap(GenBank：JN167598.1 )、黑芝(G.atrum)FIP-gat(GenBank：AJD79556.1 )、小孢靈芝(G.microsporum)FIP-gmi(PDB：3KCW_A)、血紅叢赤殼(Nectriahaematococca)FIP-nha(GenBank：EEU37941.1 )；松杉靈芝(G.tsugae)FIP-gts[15]、黑靈芝(G.astum)FIP-gas[16]、草菇(Volvariellavolvacea)FIP-vvo[6]等分別來自文獻(xiàn)；鹿角靈芝(G.amboinense)FIP-gam、黃靈芝(G.multiplicatum)FIP-gmu、泰山靈芝(G.taishanense)FIP-gta、赤芝(G.lucidum)FIP-glu、川芝(G.sichuanense)FIP-gsi、紫芝(G.japoncium)FIP-gja等6種FIPs為本課題組克隆.下圖同)

圖3 FIP-gam的系統(tǒng)進(jìn)化樹

上述15種FIPs氨基酸序列通過MEGA 4.0中的鄰接算法(neighbor-Joining algorithm)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,可靠性分析采用Bootstrap檢驗(重復(fù)1000次).由圖3可知,15個FIPs分布于4個聚類組,其中樹舌靈芝(FIP-gap)和金針菇(FIP-fve)各自聚成一個聚類組,草菇(FIP-vvo)和血紅叢赤殼(FIP-nha)聚成一個聚類組,其余10個靈芝FIPs聚成一個聚類組(同源性達(dá)87.4 7%).在靈芝聚類組中,黑芝(FIP-gat)和黑靈芝(FIP-gas)[16]聚成一個分支,同源性高達(dá)100%；小孢靈芝(FIP-gmi)單獨(dú)聚成一個分支,與兩種黑芝FIPs的同源性達(dá)93.99%；鹿角靈芝(FIP-gam)、黃靈芝(FIP-gmu)、泰山靈芝(FIP-gta)、赤芝(FIP-glu)、紫芝(FIP-gja)、川芝(FIP-gsi)、松杉靈芝(FIP-gts)和LZ-8,同源性達(dá)90.6 3%,其中FIP-gam單獨(dú)成了一個末支,但是它與該分支內(nèi)其他FIPs的差異并不是很大.說明10個靈芝FIPs聚類組內(nèi)雖然存在著一定的遺傳差異,但總體上親緣關(guān)系比較近,遺傳多樣性并不豐富.蘇春麗等[17]用β-微管蛋白基因部分序列對38個靈芝屬菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行探討,結(jié)果表明這些靈芝菌株分布于6個聚類組,其中樹舌亞屬、紫芝組的菌株各自聚成一組,其中黑靈芝歸于紫芝組.靈芝組的菌株分成四組,但大部分靈芝組菌株均聚于同一組,這表明樹舌亞屬、紫芝組和靈芝組間的遺傳差異較大.蘇愷琪等[16]根據(jù)靈芝FIPs氨基酸序列分析,采用NJ方法進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析,認(rèn)為黑靈芝的FIP-gas與紫芝的FIP-gsi和紫靈芝的FIP-gja為同一個分支.趙明文等[18]利用RAPD技術(shù)對生產(chǎn)中常用的靈芝屬 8個菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果表明根據(jù)UPGMA構(gòu)建的樹狀圖表明：8個菌株在較低的相似水平上可以分成 3個明顯不同的組：第 1組包括靈芝 0770(G.lucidum0770 )、黑芝(G.atrum)、松杉靈芝(G.tsugae)、韓國靈芝 (G.lucidumHG)和圓芝(G.rotundatum)；第2組包括紫靈芝(G.sinense)和密紋靈芝(G.crebrostriatum)；第 3組為樹舌靈芝(G.applanatum).而在本研究中,紫芝(FIP-gja)與其他靈芝FIPs歸為一個分支,且兩種黑芝FIPs與FIP-gja遺傳差異較大,并未歸為一個分支.總體來說,樹舌亞屬FIP和靈芝組間的FIPs遺傳差異較大.這些結(jié)果說明以FIPs作為靈芝的分類依據(jù)具有一定的可行性,但仍有一定的局限性,可結(jié)合其他分子分類標(biāo)記,如RAPD技術(shù)、ITS序列,或者其他一些編碼參與新陳代謝和結(jié)構(gòu)性蛋白的基因等,對靈芝進(jìn)行更加準(zhǔn)確的分類.

圖4 FIP-gam的SWISS-MODEL模擬

采用SOMPA預(yù)測FIP-gam的二級結(jié)構(gòu).分析結(jié)果表明,其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中,無規(guī)則卷曲占42.06%,β-折疊占34.5 8%,β-轉(zhuǎn)角占12.1 5%,α-螺旋占11.2 1%,這一比例說明FIP-gam為四種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)混合型蛋白,其中無規(guī)則卷曲占了較高的比例.將FIP-gam蛋白序列提交PDB數(shù)據(jù)庫,尋找與其同源的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示FIP-gam與已報道的G.lucidumLZ-8(PDB登錄號：3f3h)的同源性(93.6 9%)最高.進(jìn)一步通過DNAMAN 6.0比對兩個蛋白的同源性,結(jié)果顯示除個別氨基酸外,兩者氨基酸序列幾乎完全相同.以G.lucidiumLZ-8為模板,采用SWISS-MODEL對FIP-gam氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模,結(jié)果如圖4所示.FIP-gam三級結(jié)構(gòu)具有以下幾個結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①其三級結(jié)構(gòu)為由α-螺旋和β-折疊形成啞鈴形的二聚體,其中啞鈴的兩端由7個反向平行β-折疊組成球形,中間由2個α-螺旋和1個β-折疊組成啞鈴的柄；②N-末端結(jié)構(gòu)域是由一個α-螺旋和β-折疊是通過結(jié)構(gòu)域交換維持的二聚化,其中α-螺旋由約12個氨基酸形成,推測該結(jié)構(gòu)對二聚體的形成以及FIP-gam識別靶細(xì)胞表面受體并行使生物學(xué)活性至關(guān)重要.Lin等[15]通過松杉靈芝(G.tsugae)FIP-gts突變?nèi)笔?shí)驗證明,N 端α-螺旋中的有2個氨基酸(△ L5/ △L7)對于保持活性至關(guān)重要, 如果移去△ 5-△7 這三個氨基酸,α-螺旋的兩親性特征將被打亂,從而失去活性.③C-端結(jié)構(gòu)域?qū)儆诿庖咔虻鞍讟应?三明治折疊,其三明治結(jié)構(gòu)包括兩個β-片層(I和II)的,分別由β-鏈(ABE)和β-鏈(GFCD)形成,兩個β-片層之間通過無規(guī)則卷曲相連接.結(jié)構(gòu)分析表明,FIP-gam通過三維結(jié)構(gòu)域的N-末端螺旋的交換實(shí)現(xiàn)二聚化,并主要由疏水作用穩(wěn)定,因此二聚化對FIP-gam活性極其重要.有研究報道,FIPs具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等生物功能,但是FIP-gam是否具有這些功能,如何起作用,以及其結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系,還有待進(jìn)一步的研究.

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用基因工程技術(shù),成功獲得G.amboinense07免疫調(diào)節(jié)蛋白的全長基因.運(yùn)用生物信息學(xué)方法對FIP-gam的氨基酸序列進(jìn)行分析.結(jié)果表明,FIP-gam的氨基酸數(shù)目為107,分子量為12.0 kDa,等電點(diǎn)為4.4 8.FIP-gam不具有信號肽,亞細(xì)胞定位預(yù)測表明,FIP-gam在細(xì)胞外分布較多,推測其通過非經(jīng)典分泌途徑分泌到細(xì)胞外.氨基酸序列和進(jìn)化樹分析,FIP-gam與靈芝組FIPs同源性較高,而與非靈芝屬的FIP-fve、FIP-vvo和FIP-nha同源性較低,FIP-gam與 FIP-gat、FIP-gas、FIP-gap和FIP-gmi的同源性則介于兩組之間.蛋白結(jié)構(gòu)模擬表明,FIP-gam三級結(jié)構(gòu)由α-螺旋和β-折疊形成啞鈴形的二聚體.本研究獲得FIP-gam基因序列及生物信息學(xué)分析結(jié)果,為進(jìn)一步重組表達(dá)FIP-gam及研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定良好基礎(chǔ),也為靈芝FIPs在開發(fā)保健產(chǎn)品、功能性食品以及免疫治療藥物等提供理論依據(jù).

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(編校：曾福庚)

Cloning and Bioinformatics of Fungal Immunomodulatory Protein Gene fromGanodermaamboinense

JIANG Fang-yan1, LI Hua2, YIN Le-le1, MA Jun1, WANG Hui-fang1

(1 School of Tropical Biology and Agronomy, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan, 572022, China;2 Criminal Investigation Division, Changsha Public Security Bureau, Changsha, 410004, China)

By applying homology cloning method, a gene fromGanodermaamboinense07 encoding a fungal immunomodulatory protein (FIP-gam) was cloned and sequenced. The results of bioinformatics analysis revealed that FIP-gam contains an open reading frame 333 bp in length. The cloned gene was predicted to encode a protein of 107 amino acid residues with a theoretical molecular mass of 12.0 kDa and a deduced pI of 4.4 8. Phylogenetic and sequence analysis suggested that FIP-gam shares relatively high homology with the FIPs fromGanodermasp., but shares relatively low homology with FIP-fve (F. velutipes), FIP-vvo (Volvariella volvacea), and FIP-nha (Nectriahaematococca). The homology modeling by SWISS-MODEL exhibited that FIP-gam, composed of α-helixes and β-strands that sustain the dimerization via domain swapping, forms a dumb-bell-shaped dimmer. This study provides the foundations for the further research on the expression of FIP-gam and the relationship between its structure and functions.

Ganodermaamboinense; fungal immunomodulatory protein; gene cloning; bioinformatics

2016-02-28

海南省自然基金(313049，20153141)；國家(省)重點(diǎn)科技項目三亞市配套資金(2014PT13)；海南省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(20130127)

姜芳燕(1984-)，女，浙江衢州人，海南熱帶海洋學(xué)院熱帶生物與農(nóng)學(xué)院副教授，博士，研究方向為微生物的資源及其催化與轉(zhuǎn)化.

Q75

A

1008-6722(2016) 02-0054-06

10.1 3307/j.issn.1 008-6722.2 016.1 2.