Th17/Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子在阿霉素腎病大鼠血清及腎組織中的表達(dá)水平及意義

吳玉輝 劉艷娟 渠巍 李宇紅 徐海霞 應(yīng)蓓 邱杰 林俊 邵曉珊*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省婦幼保健院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng)550003； 3.貴州省婦幼保健院兒童腎臟免疫風(fēng)濕科，貴州 貴陽(yáng) 550003)

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·論 著·

Th17/Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子在阿霉素腎病大鼠血清及腎組織中的表達(dá)水平及意義

吳玉輝1劉艷娟1渠巍2△李宇紅3徐海霞3應(yīng)蓓3邱杰3林俊3邵曉珊3*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省婦幼保健院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng)550003； 3.貴州省婦幼保健院兒童腎臟免疫風(fēng)濕科，貴州 貴陽(yáng) 550003)

目的 探討阿霉素(ADM)腎病大鼠 Th17 相關(guān)的IL-17 和Treg相關(guān)的IL-10 表達(dá)水平及意義。方法 采用一次性尾靜脈注射阿霉素的方法制備大鼠ADM模型，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，ADM組20只大鼠在造模后尿蛋白均達(dá)到50 mg/24 h 以上，表明造模成功，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中 Th17細(xì)胞和Treg 細(xì)胞數(shù)量及比例；ELISA法檢測(cè)各組血清和腎組織中Th17 相關(guān)的IL-17 和 Treg相關(guān)IL-10 水平。結(jié)果 ADM模型組大鼠在第14天出現(xiàn)蛋白尿，隨著時(shí)間的推移，蛋白尿的量持續(xù)升高，在第56天達(dá)到峰值，各時(shí)間點(diǎn)(14，28，42，56 d)ADM組大鼠的蛋白尿水平明顯高于同時(shí)間的對(duì)照組(P<0.001);ADM組和對(duì)照組 Th17 細(xì)胞百分率分別為(3.13±0.09)%、(0.88±0.05)%，ADM組較對(duì)照組明顯升高(P<0.001) ；ADM組和對(duì)照組 Treg細(xì)胞百分率分別為(1.94±0.15)%、(5.02±0.15)% ，ADM組明顯低于對(duì)照組(P<0.001)；ADM組Th17/Treg細(xì)胞比例較對(duì)照組高(P<0.001),ADM組大鼠(14，28，42，56 d)的血清及腎組織 IL-17表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.001)；IL-10表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.001)。結(jié)論 Th17/Treg為主的免疫失衡在ADM發(fā)病中起重要作用，可通過(guò)抑制或中和內(nèi)源性 IL-17 的表達(dá)和提升Treg的表達(dá)糾正失衡的 Th17/Treg，此方法可能成為兒童原發(fā)性腎病(PNS) 治療的新途徑之一。

Th17/Treg； IL-17； IL-10; 兒童原發(fā)性腎病

腎病綜合征的發(fā)病機(jī)制與全身免疫功能包括細(xì)胞免疫及體液免疫功能紊亂有關(guān)[1]。按病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性及先天性三種，原發(fā)性腎病綜合征(Primary nephrotic syndrome,PNS)占90%以上，是兒童時(shí)期常見(jiàn)的慢性腎小球疾病，在兒科腎臟病中占首位，是引起我國(guó)兒童腎功能衰竭的原發(fā)疾病，部分患兒在應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑后可獲得緩解，但副作用大且復(fù)發(fā)率高。本研究采用一次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素(ADM)的方法制備SD大鼠的腎病模型，流式細(xì)胞檢測(cè)外周血Th17及Treg細(xì)胞數(shù)量，并測(cè)定血清和腎組織中Th17 細(xì)胞相關(guān)的白細(xì)胞介素( IL-17) 和 Treg細(xì)胞相關(guān)的白介素(IL-10)水平，旨在初步探討ADM腎病大鼠相關(guān)的 Th17/Treg比例及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17 和IL-10 表達(dá)及意義，為臨床預(yù)防PNS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組( 20只) 和模型組( 20只) 。主要試劑及儀器：Anti-Rat CD3 FITC,Anti-Rat CD8a PE ,Anti-Rat IL-17A APC,Anti-Rat CD4 ECD,Anti-Rat CD25PE,Anti-Rat Foxp3 Percp cy5，APC同型對(duì)照單抗IgG1,Percp cy5同型對(duì)照IgG2 (美國(guó)EBI公司)，PMA、Monensin、ionomycin、固定液、破膜劑(聯(lián)科生物公司)，RPMI1640培養(yǎng)基( 美國(guó) Gibco 公司),小牛血清(北京艾然生物科技有限公司公司),胰蛋白酶(美國(guó) Gibco公司),大鼠IL-17和 IL-10 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D生物公司),尿蛋白定量試劑盒(泰思騰生物)，PT3502PC酶標(biāo)儀(北京普天)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素腎病模型的建立 阿霉素用無(wú)菌生理鹽水稀釋成50%(W/V)的溶液，模型組大鼠一次性尾靜脈注射阿霉素溶液6.5 mg/kg,對(duì)照組注射等量生理鹽水，SPF級(jí)條件飼養(yǎng)，自由飲食和進(jìn)水。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 (1)24 h尿蛋白檢測(cè): 分別在注射阿霉素后第13，27，41，55天將兩組大鼠單獨(dú)喂養(yǎng)在代謝籠中，收集24 h尿液，尿標(biāo)本離心后取上清，記錄24 h尿量; 采用鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合法檢測(cè)尿蛋白定量。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞的百分率：實(shí)驗(yàn)第56天將各組大鼠在乙醚麻醉下用肝素鈉抗凝管自股靜脈采血3 mL，取250 μL全血標(biāo)本，用RPMI-1640培養(yǎng)基(不含胎牛血清-FBS)1∶1等體積稀釋至500 μL，標(biāo)記測(cè)樣管和對(duì)照管，每管取250 μL稀釋液分別加入1 μL PMA(0.1 mg/mL)、5 μL Ionomycin (1 mg/mL)、1 μL Monensin(50 mg/mL)混勻后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，離心棄上清，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解5 min，離心棄上清，PBS重懸將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，2 500 r/min離心5 min,棄上清，PBS洗兩次后加入1 μL Anti-Rat CD3 FITC(0.5 mg/mL), 1 μL Anti-Rat CD8a PE(0.2 mg/mL)室溫避光孵育30 min,PBS洗1次后棄上清，加入0.5 mL 固定液,室溫避光孵育 20 min，加入1 mL PBS清洗1次，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入1 mL破膜劑室溫避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗1次后分別在測(cè)樣管中加入1 μL Anti-Rat IL-17A APC(0.2 mg/mL)及同型對(duì)照管中加入1 μL單抗APC-IgG1,4 ℃避光孵育30 min，PBS各洗1次，1 000 r/min離心5min棄上清，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞數(shù)量。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞的百分率：取200 μL全血 ，標(biāo)記測(cè)樣管和對(duì)照管，每管取100 μL全血，分別在每管中加入1 μL Anti-rat CD4 ECD、1 μL Anti-rat CD25 PE，室溫避光孵育30 min，1 000 r/min離心5 min棄上清，1 mL PBS 懸浮細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解5 min,1 000 r/min離心5 min棄上清，每管分別加入0.5 mL的Foxp3固定液混勻，室溫避光反應(yīng)20 min，用1 mL PBS洗1次，1 000r/min 離心后棄上清，每管加入1 mL 破膜液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗1次后分別加入1 μL Anti-rat Foxp3 Percp cy5(測(cè)樣管)，1 μL 同型對(duì)照單抗Percp cy-IgG2(對(duì)照管)，室溫避光孵育30 min，PBS各洗1次，1 000 r/min離心5 min棄上清，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量。(4)細(xì)胞因子測(cè)定: 實(shí)驗(yàn)第14,28,42，56天將各組大鼠在乙醚麻醉下自股靜脈采血5 mL，室溫靜置20 min，4 ℃ 2 000 r/min離心15 min，分離血清。剖腹取腎，將腎組織勻漿后離心，取上清液3 mL，均置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，采?ELISA法測(cè)定血清和腎組織中 IL-17和 IL-10 的水平，具體方法參見(jiàn) R&D公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠24h尿蛋白變化 ADM組20只大鼠在造模后尿蛋白均達(dá)到50 mg/24 h 以上，表明造模成功。模型組大鼠在第14天出現(xiàn)蛋白尿，隨著時(shí)間的推移，蛋白尿的量持續(xù)升高，在第56天達(dá)到峰值，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠的蛋白尿水平均明顯高于同時(shí)間的對(duì)照組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表 1。

表1 兩組大鼠24h尿蛋白變化

2.2 Th17/Treg細(xì)胞數(shù)量及比例 對(duì)照組Th17(0.88±0.05)%,Treg(5.02±0.15) %, Th17/Treg(0.18±0.01);實(shí)驗(yàn)組Th17(3.13±0.09) %,Treg(1.94±0.13) %, Th17/Treg(1.61±0.09)。和對(duì)照組相比，ADM組大鼠外周血Th17/Treg細(xì)胞數(shù)量均升高(P<0.001)， Treg細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.001)，Th17/Treg細(xì)胞比例增高(P<0.001)， 見(jiàn)圖1～2。

2.3 兩組大鼠血清 IL-17和IL-10 水平比較 ADM組大鼠第14，28，42，56天血清 IL-17水平明顯高于對(duì)照組 (P<0.001) ; 而IL-10水平明顯低于對(duì)照組 (P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠血清IL-17和IL-10 水平

2.4 兩組大鼠腎組織IL-17和IL-10 水平比較 ADM大鼠第14,28,42，56天腎組織 IL-17水平明顯高于對(duì)照組(P<0.001);而IL-10明顯低于對(duì)照組 (P<0.001)，見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠腎組織IL-17和IL-10 水平比較

3 討 論

阿霉素是一種治療急性白血病和多種實(shí)體瘤的有效常用化療藥物, 目前已對(duì)其進(jìn)行了較為廣泛的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)，突出性質(zhì)是能夠誘發(fā)大鼠典型腎病綜合征表現(xiàn), 而且該腎病模型具有慢性進(jìn)展性腎損害的特點(diǎn), 早期腎組織大致正常, 中期腎小球上皮空泡變性，晚期節(jié)段性或全小球硬化,這與人類進(jìn)行性腎臟疾病的表現(xiàn)過(guò)程非常類似,ADM 腎病模型為研究腎病蛋白尿、濾過(guò)屏障損害腎小球硬化機(jī)理等提供了比較理想的實(shí)驗(yàn)條件, 現(xiàn)已成為研究腎臟病的重要工具。

研究[2]發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病發(fā)病過(guò)程中起著重要作用,Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)不同于Th1和Th2細(xì)胞的T細(xì)胞亞群,Th17細(xì)胞參與調(diào)節(jié)和控制免疫應(yīng)答,在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用,IL-17是Th17細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)細(xì)胞因子,其受體分布于體內(nèi)多種組織,是一種強(qiáng)大的前炎癥細(xì)胞因子,也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子,通過(guò)促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集誘導(dǎo)細(xì)胞釋放前炎癥因子引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷,參與腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展,在宿主抗細(xì)菌感染免疫中發(fā)揮重要作用[3-4]。它在慢性炎癥疾病及自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中的作用也成為了研究熱點(diǎn)[5]。

Treg是具有顯著免疫抑制作用的CD4+T細(xì)胞亞群,由 CD4+T 細(xì)胞分化而來(lái)，Treg 表達(dá)Foxp3，通過(guò)接觸抑制及釋放抗炎因子 IL-10及 TGF-β，并通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞增殖、炎性因子和抗體的產(chǎn)生、抑制記憶T細(xì)胞的功能,還能誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的凋亡[6]，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在機(jī)體上處于動(dòng)態(tài)平衡，相互拮抗和排斥，Th17促進(jìn)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，Treg抑制免疫應(yīng)答，維持免疫耐受[7]。Th17和Treg的相互調(diào)控，使機(jī)體效應(yīng)和抑制處于一種精細(xì)而復(fù)雜的平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生異常時(shí)，Th17/Treg功能失衡引起一系列炎癥免疫反應(yīng)損傷機(jī)體，研究[8]發(fā)現(xiàn) Th17/Treg的失衡預(yù)示炎癥性疾病惡化,本研究表明阿霉素腎病模型大鼠中Th17細(xì)胞的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.001)，Treg細(xì)胞的表達(dá)水平降低(P<0.001)， Th17/Treg比例增高(P<0.001)，阿霉素腎病模型大鼠血清和腎組織的IL-17表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.001),IL-10表達(dá)水平較對(duì)照組降低(P<0.001)。綜上所述，我們通過(guò)對(duì)Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè),明確了Th17和Treg細(xì)胞表達(dá)情況，Th17/Treg 為主的免疫失衡在ADM 發(fā)病中起重要作用，但兩種相關(guān)免疫細(xì)胞在阿霉素腎病大鼠的失衡變化的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，或可通過(guò)抑制或中和內(nèi)源性 Th17 和提升 Treg 的表達(dá)糾正失衡的 Th17/Treg,有望為深入研究PNS的病因和發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，進(jìn)而找到有效的治療方法，具有重要的基礎(chǔ)和臨床研究?jī)r(jià)值。

(本文圖1～2見(jiàn)封三)

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Significance and expression of variation of Peripheral Blood Th17/Treg cells and cytokines in Sprague Dawley rat induced by adriomycine

WuYuhui1,LiuYanjuan1,QuWei2,LiYuhong3,XuHaixia3,YingPei3,QiuJie3,LinJun3,ShaoXiaoshan3.

1.TheGraduatedSchoolofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangMaternal&ChildHealthCareHospital,Guiyang550003,China. 3.DepartmentofNephrologyofImmunization,GuiyangMaternal&ChildHealthCareHospital,Guiyang550003,China.

Objective To investigate the variation of Th17/Treg cells in Peripheral Blood and related cytokines (IL-17/IL-10) in Sprague Dawley (SD) rat induced by adriomycine (ADM). Methods SD rats were randomly grouped in vehicle control (n=20) and ADM model (n=20), Model group were injected with ADM via tail vein (6.5 mg/kg/body weight) , while control group were injected same amount of normal saline(NS). Peripheral blood (PBL) and Renal tissue were collected after injection at different time points (14, 28, 42, 56 d). Th17 and Treg cell numbers in PBL were analyzed by flow cytometry . Enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) were performed for detection of IL-17 and IL-10 in both PBL and renal tissue. Results ADM model were successfully established for further investigation. Biochemical results indicate the level of proteinuria were increased in ADM model in comparison with vehicle control after 14 days of injection(P<0.001), which reached peak levels after 56 days . Flow cytometric staining reveals CD4+CD8-IL-17+were higher in ADM (3.13±0.09)% compared to control (0.88±0.05)%, whereas CD4+CD25+Foxp3+cells were lower in ADM (1.94±0.13)% compared to control (5.02±0.15)% (P<0.001). Further, ELISA show IL-17 in serum and renal tissues were significantly higher in ADM compared to control (P<0.001), while IL-10 were observed lower compared to control (P<0.001). Conclusion Th17/Treg immune cells play a significant role in the pathogenesis of ADM ,which suggests it may be rectified vianeither inhibit or neutralize the expression of IL-17 and enhance Treg cells of expression. Possibly, the research above all may provide one of novel methods for treatment of primary nephrotic syndrome (PNS).

Th17/Treg； IL-17； IL-10； PNS

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)： NS2014-11)

R726.9

A

1000-744X(2016)09-0899-03

2016-06-10)

△*通信作者，△E-mail：doctor_quweichina@126.com;*E-mail:sxs22@sina.com