瘤果黑種草子對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響*

于世博， 孔祥耀， 陳明翠， 任文凱， 袁桃花， 吳 寧

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

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瘤果黑種草子對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響*

于世博1， 孔祥耀1， 陳明翠1， 任文凱1， 袁桃花1， 吳 寧2*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的： 探討瘤果黑種草子對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響。方法：50只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及瘤果黑種草子高、低劑量組，除正常對(duì)照組外，其余各組給予56度白酒(10 mL/kg)灌胃建立急性酒精性肝損傷模型，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水；灌胃同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃葵花護(hù)肝寧，瘤果黑種草子高、低劑量組分別灌胃黑種草子水提液6 g/kg或2 g/kg進(jìn)行灌胃，連續(xù)10 d，灌胃期間觀察小鼠的體重、精神、活動(dòng)及毛色等情況；最后一次灌胃后10 h時(shí)取血檢測(cè)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平，同時(shí)稱取小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)，觀察小鼠肝組織外觀及肝組織病理學(xué)改變。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠體重減輕，嗜睡，毛發(fā)光澤度下降；瘤果黑種草子組小鼠情況明顯改善，小鼠毛發(fā)光滑整齊，體質(zhì)量增長(zhǎng)恢復(fù)正常，高劑量組最為明顯；小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)比較，模型組低于正常對(duì)照組，瘤果黑種草子組高于模型組 (P<0.05)；血清ALT及AST活性比較，模型組高于正常對(duì)照組，瘤果黑種草子組低于模型組 (P<0.05)；模型組小鼠肝組織外觀呈黃褐色、正常對(duì)照組呈紅褐色，瘤果黑種草子組介于兩組之間，高劑量組更接近正常對(duì)照組；HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞明顯氣球樣變性、壞死，并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，高劑量瘤果黑種草子組小鼠肝細(xì)胞的病理學(xué)改變減輕。結(jié)論：高劑量瘤果黑種草子水提液對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷有保護(hù)作用。

肝疾病，酒精性； 小鼠； 肝； 肝功能試驗(yàn)； 瘤果黑種草子； 維吾爾族藥物

維藥瘤果黑種草子是我國(guó)新疆維吾爾族的傳統(tǒng)常用藥材，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及抗菌等功效[1-4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)維藥瘤果黑種草子的研究較少，多集中于其抗腫瘤及抗氧化作用，但對(duì)民間流傳的良好保肝效果卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)建立急性酒精性肝損傷小鼠模型，觀察瘤果黑種草子對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響，為瘤果黑種草子的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器、藥品與試劑

昆明小鼠，雌雄各半，清潔級(jí)，體質(zhì)量為19～24 g。由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理中心提供，合格證號(hào)SCXK(黔)2012-001 。儀器主要有7150型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立)、RM2015型石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡)、BX51T-PHD-J11型顯微鏡(日本奧林巴斯)、多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)， 瘤果黑種草子購(gòu)于新疆維吾爾民族醫(yī)院。紅星牌56度白酒(北京紅星二鍋頭股份有限公司)、血清ALT、AST檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、葵花護(hù)肝片(北京葵花藥業(yè))。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝損傷模型及分組 50只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及瘤果黑種草子高、低劑量組。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠每日下午給予56度白酒(10 mL/kg)灌胃，建立急性酒精性肝損傷模型，正常對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予葵花護(hù)肝寧，瘤果黑種草子組分別給予黑種草子水提液6 g/kg或2 g/kg進(jìn)行灌胃，連續(xù)10 d。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間觀察各組小鼠活動(dòng)狀態(tài)、毛色、體質(zhì)量、飲食等一般狀態(tài)；末次給予白酒灌胃后禁食不禁水10 h，取血清測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性；迅速取出肝臟稱重，計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝重/體質(zhì)量)；取肝右葉用10%甲醛固定，石蠟包埋切片HE染色，觀察其病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量減輕，嗜睡，毛發(fā)光澤度下降，并伴有反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)及進(jìn)食減少，腹部腫脹等癥狀；與模型組比較，瘤果黑種草子組小鼠情況均有明顯改善，毛發(fā)光滑整齊，體質(zhì)量增長(zhǎng)恢復(fù)正常，其中高劑量組最為明顯。

2.2 小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)和血清ALT及AST活性

小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)比較，模型組低于正常對(duì)照組，瘤果黑種草子組高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清ALT及AST活性比較，模型組高于正常對(duì)照組，瘤果黑種草子組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)表1。

Tab.1 Body mass and liver index of mice in each group

與正常對(duì)照組比較，(1)P<0.01,(2)P<0.05 ；與模型組比較，(3)P<0.05,(4)P<0.01

2.3 小鼠肝組織外觀及HE染色

正常對(duì)照組小鼠肝組織外觀呈紅褐色且具有明顯光澤，觸之感覺(jué)柔軟且富有彈性；模型組小鼠肝組織外觀呈黃褐色，少數(shù)呈深紅色及灰白色，觸之感覺(jué)質(zhì)地較硬且缺少?gòu)椥?；瘤果黑種草子組肝臟外觀介于模型組與正常對(duì)照組之間，其中高劑量組更接近于正常對(duì)照組。HE染色后，鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組肝細(xì)胞完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，多數(shù)為單核，少見(jiàn)雙核及多核；模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹，并伴有氣球樣變，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞排列混亂，部分肝細(xì)胞伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性對(duì)照組及瘤果黑種草子組僅部分細(xì)胞可見(jiàn)氣球樣變性及少量點(diǎn)狀壞死，其中瘤果黑種草子高劑量組改善最為明顯。見(jiàn)圖1。

注：A為正常對(duì)照組，B為模型組， C、D分別為瘤果黑種草子高劑量及低劑量組，E為陽(yáng)性對(duì)照組

3 討論

肝臟是酒精在體內(nèi)代謝的重要臟器，過(guò)量的飲酒會(huì)造成肝臟組織不同程度的損傷。酒精性肝損傷為繼病毒性肝炎后的一種多發(fā)的肝損傷疾病[5]。天然保肝類藥物的研發(fā)已成為業(yè)界的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，一些民族中草藥從多角度、多靶點(diǎn)治療酒精性肝損傷的效果已逐漸得到認(rèn)可[6-10]。瘤果黑種草子作為我國(guó)新疆維吾爾族常用的藥材，具有抗氧化，抗炎等多種功效，當(dāng)?shù)鼐用癯Ｓ脕?lái)幫助消化、固齒、抗腫瘤及提高機(jī)體免疫力[11-12]。本研究模擬人類急性酒精中毒肝臟損傷過(guò)程，采用連續(xù)高劑量飲酒方法給小鼠每天灌胃高度白酒，隨著酒精灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠皮毛光澤度變差，體質(zhì)量下降，明顯低于對(duì)照組，表明過(guò)量飲酒導(dǎo)致的小鼠食欲和吸收功能降低，易造成小鼠營(yíng)養(yǎng)不良。

ALT和AST時(shí)肝損傷疾病的敏感指標(biāo)，主要存在于細(xì)胞漿內(nèi)，AST還存在于線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重受損時(shí)，因肝細(xì)胞通透性增加，胞漿內(nèi)的ALT及線粒體內(nèi)的AST則釋放入血，導(dǎo)致血液中的ALT及AST的表達(dá)水平大幅升高[6]。因此，血清ALT及AST的含量可作為衡量酒精性肝損傷的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，瘤果黑種草子組小鼠一般情況均有明顯改善，毛發(fā)光滑整齊，體質(zhì)量恢復(fù)正常，其中高劑量組最為明顯。除此之外，本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)檢驗(yàn)小鼠血清ALT及AST的含量變化及觀察小鼠肝組織外觀和病理切片來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證瘤果黑種草子對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的影響。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT和AST水平明顯升高，肝臟出現(xiàn)明顯的小葉組織破壞及肝細(xì)胞的氣球樣變，說(shuō)明小鼠急性酒精性肝臟損傷模型建立成功。而與模型組相比，瘤果黑種草子均能提高小鼠肝臟重量及肝臟指數(shù)，并減緩ALT及AST升高的趨勢(shì)，以瘤果黑種草子高劑量組結(jié)果最為明顯，而低劑量組次之；進(jìn)一步觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)切片，發(fā)現(xiàn)高劑量瘤果黑種草子能夠明顯減輕急性酒精性肝損傷小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)的破壞及肝細(xì)胞的氣球樣變，腫脹及壞死。隨著瘤果黑種草子劑量的減少，其治療作用也逐步減弱。

綜上所述，瘤果黑種草子能延緩小鼠急性酒精性肝損傷，但因本研究瘤果黑種草子不同劑量對(duì)各效應(yīng)指標(biāo)的影響尚未呈現(xiàn)一致性的劑量效應(yīng)關(guān)系，有關(guān)瘤果黑種草子對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷干預(yù)的最佳有效劑量和確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(2016-07-17收稿，2016-10-20修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉 華

The Influence of Nigellae Semen to Acute Alcoholic Liver Damage Mice

YU Shibo1, KONG Xiangyao1, CHEN Mingcui1, REN Wenkai1， YUAN Taohua1, WU Ning2

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofBiochemistryandmolecularbiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To explore the effects of seeds of Uygur medicine Nigella glandulifera freyn on acute alcoholic liver damage of mice. Methods: 50 mice were randomly divided into control group, model group, the positive control group, high dose of Nigella water extract group(6 g/kg), and low dose of Nigella semen water extract group(2 g/kg). The normal group received saline of equal volume while the other groups were orally administered daily 56 degree liquor of 10 mL/kg to establish a model of acute alcoholic liver injury. When intragastric administration was going on, the positive control group received gavage of sunflower Huganning, while Nigella glandulifera freyn group were given intragastric administration of Nigella seeds water extract 6 g/kg(high dose) or 2 g/kg(low dose) for 10 d. The body weight, spirit, activity and hair color of mice were observed during the period of gavage. 10 h after the last intragastric administration, serum of mice was collected to detect serum glutamic pyruvic transaminase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) levels. At the same time, the mice body weight and liver weight were measured to calculate liver index and the liver tissue appearance and the pathological changes of liver tissue were observed. Results: Compared with the normal control group, model group mice showed weight loss, sleepiness, hair gloss drop. The situation of mice in Nigella glandulifera freyn group were significantly improved. Their mouse hair was smooth, body weight increased and returned to normal with high dosage groups being better. The body weight and liver index of mice in model group were lower than their counterparts of normal control group while the body weight and liver index in Nigella glandulifera freyn group were higher than their counterparts of model group (P<0.05). The serum ALT and AST activity in model group were lower than their counterparts of normal control group while the serum ALT and AST activity in Nigella glandulifera freyn group were higher than their counterparts in model group (P<0.05). The liver tissue appearance of model group was brown while normal control group reddish brown. The appearance of Nigella glandulifera freyn group was between model group and normal control group, with the high dose group closer to the normal control group. He staining results showed that mice hepatic cells of model group showed significant ballooning degeneration and necrosis, accompanied by a small amount of inflammatory cell infiltration. Compared with model group, the pathological changes of mice liver cell of high dose of Nigella glandulifera freyn was alleviated. Conclusion: High dose of Nigella glandulifera freyn water extract has a protective effect on acute liver injury in mice.

liver diseases,alcoholic; mice; liver; liver function tests; nigellae semen; Uygur medicine

?? E-mail:1638210715@qq.com

時(shí)間：2016-11-15 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.024.html

R29； R285.5

A

1000-2707(2016)11-1288-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.011