順鉑處理后幾種hTERT mRNA剪接異構(gòu)體的變化*

楊夢莉， 陳香嶺， 隋 旭， 廉亞茹， 馬春霞， 姚宇峰， 史 荔， 馬千里, 俞建昆**

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明理工大學(xué)， 云南 昆明 650093; 3.昆明醫(yī)學(xué)大學(xué)第三附屬醫(yī)院 胸外科， 云南 昆明 650118)

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順鉑處理后幾種hTERTmRNA剪接異構(gòu)體的變化*

楊夢莉1， 陳香嶺1， 隋 旭2， 廉亞茹1， 馬春霞1， 姚宇峰1， 史 荔1， 馬千里3, 俞建昆1**

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明理工大學(xué)， 云南 昆明 650093; 3.昆明醫(yī)學(xué)大學(xué)第三附屬醫(yī)院 胸外科， 云南 昆明 650118)

目的： 利用順鉑處理肺癌、宮頸癌細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞，檢測人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(hTERT)mRNA的選擇性剪接是否發(fā)生變化。方法:將培養(yǎng)的肺癌A549和H1299細(xì)胞，宮頸癌C33A、SiHa和CaSki細(xì)胞及人胚腎293FT細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，用順鉑處理實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，DMSO處理對照組細(xì)胞；設(shè)計hTERT α+β+、α+β-、α-β+、INS3及DEL[e2]引物，提取兩組細(xì)胞的總RNA，利用RT-PCR檢測hTERTmRNA 剪接異構(gòu)體表達(dá)。結(jié)果:與對照組細(xì)胞相比，隨著順鉑濃度的增加，肺癌A549和H1299細(xì)胞，宮頸癌C33A、SiHa和CaSki細(xì)胞以及人胚腎293FT細(xì)胞中hTERTα+β- 和INS3異構(gòu)體比例升高，而DEL[e2]異構(gòu)體變化不明顯。結(jié)論:在順鉑引起的DNA損傷情況下，細(xì)胞可利用hTERTmRNA選擇性剪接調(diào)控機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過改變不同異構(gòu)體的量和所占比例，從而調(diào)節(jié)端粒酶功能活性。

肺腫瘤； 宮頸腫瘤； 人胚腎細(xì)胞； 細(xì)胞，培養(yǎng)的； 人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位； 順鉑

端粒是真核細(xì)胞線性染色體的末端物質(zhì)，由TTAGGG重復(fù)序列構(gòu)成，端粒DNA序列具有高度保守性，在維持染色體穩(wěn)定性中起重要作用。人端粒酶主要由兩個亞單位組成，即端粒酶RNA(hTR)和催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)[1]。hTERT作為端粒酶的限速酶，在端粒酶的活性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。研究表明，端粒酶活性的調(diào)節(jié)主要依賴于hTERTmRNA的表達(dá)，而hTERTmRNA表達(dá)會由于選擇性剪接(alternative splicing)而產(chǎn)生多個異構(gòu)體，到目前為止已發(fā)現(xiàn)14種hTERT 轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，主要是由于外顯子的缺失及內(nèi)含子的插入造成的[2-3]。Pre-mRNA選擇性剪接作用可以調(diào)節(jié)hTERT基因的表達(dá)量，同時也可以改變蛋白的結(jié)構(gòu)，對端粒酶活性產(chǎn)生重要的影響[4]。近來研究表明，用DNA損傷試劑或者輻射處理細(xì)胞后，一些與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的基因會相應(yīng)的發(fā)生選擇性剪接的變化[5]?？拱┧幬镯樸K具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，可引起DNA鏈斷裂，本研究選取肺癌A549、H1299細(xì)胞，宮頸癌C33A、SiHa和CaSki細(xì)胞及人胚腎293FT細(xì)胞用順鉑處理，探究hTERT的α+β+、α+β-、α-β+、INS3及DEL[e2]幾種剪接異構(gòu)體是否發(fā)生改變，并且這些異構(gòu)體所占比例在順鉑不同濃度處理樣品中是如何變化的，為探討端粒酶不同剪接異構(gòu)體的功能及其調(diào)控剪接信號通路和機(jī)制提供信息，為臨床治療腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

細(xì)胞NCI-H1299、C33A、SiHa、CaSki及293FT購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，A549購自中國科學(xué)院昆明動物所細(xì)胞中心。NCI-H1299細(xì)胞使用Hyclone改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，其余細(xì)胞均使用Hyclone DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液(GE Healthcare Life Sciences)，兩種培養(yǎng)液均含10%FBS(Certified Foetal Serum, Biological Industries)，青霉素和鏈霉素濃度分別為100 U/mL和100 mg/L,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%的CO2。順鉑購自Sigma Aldrich公司，用DMSO溶解后使用。順鉑加入時細(xì)胞處于對數(shù)增長期，在培養(yǎng)皿表面覆蓋率為70%～90%。5種腫瘤細(xì)胞都分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度的順鉑處理，對照組細(xì)胞用相應(yīng)濃度的DMSO處理；對照組中A549、H1299、C33A、SiHa、CaSki、293FT細(xì)胞加入DMSO濃度分別為56、72、63、56、42、63 μmol/L。實(shí)驗(yàn)組中A549、H1299順鉑濃度分別是7、14、21、28、35、42、49、56 μmol/L和9、18、27、36、45、54、63、72 μmol/L，C33A濃度為 9、18、27、36、45、54、63 μmol/L,SiHa濃度為8、16、24、32、40、48、56 μmol/L,CaSki濃度為6、18、24、30、36、42 μmol/L，293FT濃度為9、18、27、36、45、54、63 μmol/L。

1.2 提取總RNA

各組細(xì)胞在順鉑或DMSO處理24 h時傾倒除去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗1次，徹底除去PBS后，加入RNAiso Plus(TakaRa公司)，按照試劑說明書程序提取總RNA。

1.3 檢測異構(gòu)體

oligo(dT)18引物用PrimeScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA第一鏈，再用PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。α+β-和α-β+ 上游引物為5′-GCCTGAGCTGTACTTTGTCAAG -3′,下游引物為5′-GCAAACAGCTTGTTCTCCATGTC-3′。引物設(shè)計起始于外顯子5和終止于外顯子9，產(chǎn)物大小為274、456 bp；INS3上游引物為5′-CTCCATCCTGAAAGCCAAGAAC-3′,下游引物為5′-TGTCGAGTCAGCTTGAGCAG-3′,引物設(shè)計起始于外顯子14和終止于外顯子15，產(chǎn)物大小為123、282 bp；DEL[e2]上游引物ACTACCGCGAGGTGCTGC，下游引物GACGACGTACACACTCATCAG，引物設(shè)計起始于外顯子1和終止于外顯子3，產(chǎn)物大小259、1613 bp，如圖1所示。PCR反應(yīng)總體積20 μL，94 ℃ 3 min預(yù)變性；94 ℃ 變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用RT-PCR進(jìn)行試驗(yàn)檢測，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Bio-RAD凝膠成像儀自帶分析軟件處理，最終數(shù)值為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。

注：全長α+β+剪接異構(gòu)體包含16個外顯子和完整的RT結(jié)構(gòu)域，α-β+剪接異構(gòu)體位于第6外顯子處缺失36個核

2 結(jié)果

2.1hTERTα+β- mRNA異構(gòu)體的變化

與對照組細(xì)胞比較，實(shí)驗(yàn)組A549、H1299、293FT、C33A、SiHa及CaSki細(xì)胞隨著順鉑濃度的增加，α+β+異構(gòu)體(*a)的比例呈先增加、后逐漸降低的趨勢，而α+β-異構(gòu)體(*b)的比例逐漸增加，其中293FT、CaSki以及C33A細(xì)胞中出現(xiàn)36 bp的α-β+(*c)目標(biāo)帶，變化趨勢與α+β+異構(gòu)體一致。如圖2。

2.2hTERTINS3 mRNA異構(gòu)體的變化

與對照細(xì)胞相比，在實(shí)驗(yàn)組A549、 H1299、293FT、C33A和SiHa細(xì)胞隨著順鉑濃度的增加，α+β+(*b)異構(gòu)體的比例呈逐漸降低的趨勢，而INS3異構(gòu)體(*a)的比例逐漸增加。如圖3。

2.3hTERTDEL[e2] mRNA異構(gòu)體的變化

實(shí)驗(yàn)組A549、SiHa、H1299細(xì)胞中，α+β+異構(gòu)體(*a)和異構(gòu)體DEL[e2](*b)與對照細(xì)胞相比，變化趨勢不明顯。在C33A細(xì)胞中，α+β+異構(gòu)體(*a)變化趨勢不明顯，因DEL[e2]異構(gòu)體缺失少，導(dǎo)致DEL[e2](*b)未出現(xiàn)目標(biāo)條帶。

3 討論

hTERT是端粒酶功能的限速酶，端粒酶的活性是由hTERT在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，hTERT的轉(zhuǎn)錄存在著選擇性剪接的現(xiàn)象。已有研究表明，過表達(dá)α+β+異構(gòu)體和α+β-異構(gòu)體都有保護(hù)細(xì)胞在順鉑處理情況抗凋亡的作用，因α+β-異構(gòu)體RT 功能結(jié)構(gòu)域的缺失，導(dǎo)致其沒有端粒酶活性[6]。本文研究結(jié)果顯示，α+β-異構(gòu)體在順鉑處理時，隨著順鉑濃度增加而所占比例逐漸增高，可能原因是在順鉑造成DNA 損傷時，細(xì)胞生長分裂受抑制，高表達(dá)的α+β-轉(zhuǎn)錄水平導(dǎo)致端粒酶處于低活性狀態(tài)，有利于細(xì)胞阻滯于G2期檢查點(diǎn)進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。此外，Shusen Zhu等[7]人報道了INS3異構(gòu)體可抑制端粒酶活性，細(xì)胞生長變緩，具有負(fù)調(diào)控功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示INS3異構(gòu)體隨著順鉑濃度增加，比例逐漸增加，由此可以推測在順鉑處理作用下，INS3異構(gòu)體因RT結(jié)構(gòu)域的不完整導(dǎo)致端粒酶活性逐漸降低，但I(xiàn)NS3異構(gòu)體是否也具有抗凋亡作用還需進(jìn)一步探究。hTERT DEL[e2]在順鉑處理下，無明顯變化，但目前DEL[e2]異構(gòu)體與端粒酶活性的相關(guān)性還未曾報道，是進(jìn)一步需要研究的問題。幾種剪接異構(gòu)體的變化說明在應(yīng)對順鉑引起的DNA損傷中，hTERTmRNA剪接異構(gòu)體的水平和比例的變化是引起端粒酶功能活性降低的一種調(diào)節(jié)方式。

注：*a表示α+β+異構(gòu)體，*b表示α-β+異構(gòu)體，*c表示α+β-異構(gòu)體;-A表示α+β+異構(gòu)體剪接百分比；

注：*a表示α+β+異構(gòu)體，*b表示α-β+異構(gòu)體，*c表示α+β-異構(gòu)體;-A表示α+β+異構(gòu)體剪接百分比；

注：*a表示α+β+異構(gòu)體，*b表示α-β+異構(gòu)體，*c表示α+β-異構(gòu)體;-A表示α+β+異構(gòu)體剪接百分比；

近年來研究發(fā)現(xiàn) NF-κB 信號通路的激活與 hTERT 的表達(dá)和端粒酶活性有關(guān)。利用 NF-κB抑制劑姜黃素抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的 NF-κB 信號通路，可以明顯的抑制端粒酶活性，hTERTmRNA和蛋白表達(dá)[8]。Sykorova等[9]實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明 NF-κB 可以通過對hTERT啟動子的增強(qiáng)調(diào)節(jié)而調(diào)節(jié) hTERT 的表達(dá)。此外，DEL[e4-13]異構(gòu)體通過剪接調(diào)控能夠在端粒酶陽性和陰性細(xì)胞中增強(qiáng)Wnt信號[10],但是在順鉑造成的DNA損傷情況下，α+β-的活性是否與Wnt 信號通路有關(guān)，NF-κB 信號通路的激活與 hTERT 的表達(dá)和端粒酶活性影響還未有人報道，以上已證實(shí)的研究結(jié)果將為本試驗(yàn)進(jìn)一步研究在順鉑造成細(xì)胞DNA損傷情況下，探究引起hTERT剪接變化的信號通路奠定基礎(chǔ)。

目前已報道在DNA損傷情況下，TERT會從核內(nèi)轉(zhuǎn)位至線粒體，在線粒體中的TERT 能夠降低線粒體中活性氧ROS(reactive oxygen species)水平，減輕線粒體DNA(mtDNA)損傷，通過增強(qiáng)線粒體功能從而提高細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷能力使細(xì)胞呈現(xiàn)抗凋亡的效應(yīng)[11]，且α+β+和α+β-異構(gòu)體在順鉑處理下都具有抗凋亡的作用[6]，過表達(dá)α+β+異構(gòu)體可提高基因組穩(wěn)定性和DNA修復(fù)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著順鉑濃度增加，α+β-異構(gòu)體比例增加，文獻(xiàn)已報道α+β+和α+β-異構(gòu)體都能定位于線粒體，推測α+β-與α+β+異構(gòu)體可能具有幫助或協(xié)同DNA修復(fù)功能，即在線粒體中通過增加順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)從而對細(xì)胞進(jìn)行凋亡保護(hù)，但這一問題還需進(jìn)一步證實(shí)。而對于INS3和DEL[e2]異構(gòu)體在順鉑處理下，hTERT是否會從核轉(zhuǎn)移至線粒體，能否減輕線粒體DNA損傷，異構(gòu)體的變化是否與凋亡耐受有關(guān)，這些問題還未曾報道，因此這些異構(gòu)體是否能轉(zhuǎn)移到線粒體中發(fā)揮相應(yīng)的功能有待研究，線粒體轉(zhuǎn)移定位以及凋亡的變化將成為下一步探究目標(biāo)。在順鉑處理下異構(gòu)體比例的變化可能是一種應(yīng)對外界刺激細(xì)胞耐受相適應(yīng)的現(xiàn)象，以適應(yīng)細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定的生理功能需要。

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(2016-07-20收稿，2016-10-12修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙 毅

Several Splice Isoforms of hTERT mRNA and Its Change in Cells after Treatment with Cisplatin

YANG Mengli1, CHEN Xiangling1, SUI Xu2, LIAN Yaru1, MA Chunxia1,YAO Yufeng1, SHI Li1, MA Qianli3, YU Jiankun1

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,Yunnan,China; 2.KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650093,Yunann,China; 3.DepartmentofThoracicSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To determine whether there is any change of alternative splicing of hTERT mRNA in lung cancer and cervical cancer cells and human embryonic kidney cells after cisplatin treatment, different dose of cisplatin were used to treat these two types of cell line. Methods: Cultivated lung cancer A549 and H1299 cells, cervical cancer C33A, SiH aand CaSki cells and HEK 293FT cells were divided into experiment group and control group; using cisplatin to treat experiment group cells and DMSO to treat control group cells; hTERT α+β+，α+β-，α-β+，INS3，DEL〗 alternative splicing sites were selected to design primers. Total RNA of treated cells and control cells after treatment with cisplatin were extracted and RT-PCR was used to test the spliced transcripts, and their ratios of hTERT mRNA in cancer cells. Results: The results indicated that the ratio of the hTERT α+β- and INS3 isoform increased with the increase of the concentration of cisplatin; but the change of DEL 〗 was not obvious. Conclusion: The activity of telomerase may be regulated through the expression and ratio of different alternative splicing isoforms of hTERT when DNA impairment.

lung neoplasm; cervical neoplasm; human embryonic kidney cells; cell,cultured; human telomerase reverse transcriptase; cisplatin

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目(2012IPB107)； 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金(新教師類)(20111106120056)

?? E-mail:yjk@imbcams.com.cn

時間：2016-11-15 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.018.html

R512.6

A

1000-2707(2016)11-1279-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.009