Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制研究

魏娉，路三軍，嚴(yán)金海，郭俊萍，姜琳娜

(1.邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002； 2.磁縣人民醫(yī)院，河北 邯鄲 056500)

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·論 著·

Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制研究

魏娉1，路三軍1，嚴(yán)金海2，郭俊萍1，姜琳娜1

(1.邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002； 2.磁縣人民醫(yī)院，河北 邯鄲 056500)

目的:研究Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制。方法:分別將構(gòu)建好的pcDNA 3.1- Slug和miR- 140通過(guò)Lip 2000轉(zhuǎn)染到Eca- 109中，以pcDNA 3.1和Lip 2000空轉(zhuǎn)作為對(duì)照組，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)變化，檢測(cè)細(xì)胞中E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)情況變化，另外使用穿透小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力在轉(zhuǎn)染前后的變化情況。結(jié)果:轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1- Slug和miR- 140到Eca- 109中后細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1- Slug的Eca- 109中E- 鈣黏素表達(dá)下調(diào)，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的數(shù)量明顯增多。轉(zhuǎn)染miR- 140的Eca- 109中E- 鈣黏素表達(dá)上調(diào)，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少。在食管癌細(xì)胞中miR- 140和Slug的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.96)。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子Slug能夠提高食管癌上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力和侵襲能力，而miR- 140是通過(guò)調(diào)控Slug來(lái)調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞侵襲性的。

Slug； 微小核糖核酸- 140； 食管癌； 侵襲能力； 上皮細(xì)胞- 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

在上皮細(xì)胞- 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生過(guò)程中，E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白等多種信號(hào)分子參與其中，在該過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1- 4]。Slug基因是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示，其在EMT的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有非常重要的作用，腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移與Slug基因的表達(dá)密切相關(guān)[5- 7]。另外研究顯示，miRNA在EMT中也具有非常重要的作用，例如miR- 200和miR- 205均已被證明能夠一直EMT，從而降低癌細(xì)胞的侵襲能力[8- 9]。然而miR- 140可能與Slug在食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中具有某種相互作用。本研究探討了二者在食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)聯(lián)，以期為后期食管癌轉(zhuǎn)移的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

Eca- 109人食管癌細(xì)胞株購(gòu)自上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司,Slug cDNA的全長(zhǎng)pcDNA 3.1載體由作者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員構(gòu)建完成,氯仿購(gòu)自上海一基生物試劑有限公司,PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司,Liposomes轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司,RPMI 1640購(gòu)自Hyclone公司,相關(guān)引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 pc- DNA3.1- Slug載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)Slug的引物序列為上游：5′- GCTCCTTCCTGGTCAAGAAACAT- 3′，下游：5′- CCGAGGTGAGGATCTCTGGTT- 3′。使用氯仿抽取Eca- 109細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，再使用Slug的引物擴(kuò)增Slug DNA片段，然后構(gòu)建重組pcDNA 3.1- Slug質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。測(cè)序鑒定無(wú)誤后使用Lip 2000將構(gòu)建好的重組pcDNA 3.1- Slug質(zhì)粒和miR- 140分別轉(zhuǎn)染至Eca- 109中，標(biāo)記為pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109組和miR- 140/Eca- 109組，另以Lip 2000轉(zhuǎn)染Eca- 109細(xì)胞和pcDNA 3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 轉(zhuǎn)染48 h后在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 免疫化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞中E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后漿細(xì)胞接種在涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，細(xì)胞貼壁后取出撥片，用之前已預(yù)冷的丙酮固定，PBS沖洗，加入對(duì)應(yīng)的1∶1 000稀釋過(guò)的一抗，30 min后PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，然后加入二抗，37 ℃ 30 min后PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，再加入三抗，30 min后PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，然后DBA顯色。計(jì)算E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白呈陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)miR- 140和Slug的表達(dá)情況 引物設(shè)計(jì)：miR- 140莖環(huán)引物序列為：正義鏈5′- GGCAGAGAGTCCTAGCAGTC- 3′，反義鏈5′- AGTCAGATGACAGCCCCACA- 3′，Slug莖環(huán)引物序列為正義鏈5′- GCATTTCTTCACTCCGAAGC- 3′，反義鏈5′- TGAATTCCATGCTCTTGCAG- 3′。

表達(dá)量的計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量(R)=2-△△ct=

2-[(ct樣品- ct內(nèi)參)- (ct空白- ct內(nèi)參空白)]。

1.2.5 穿透小室法檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力 將穿透小室置于24孔板內(nèi)，微孔膜嵌套上室鋪一層基質(zhì)膠，嵌套下室加入500μl事先配好的RPMI 1640(含有10%胎牛血清)，然后在嵌套上室中加入200 μl細(xì)胞懸液，每小組設(shè)置3復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后取出小室，去基質(zhì)膠后使用4%的多聚甲醛固定，HE染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)，穿膜的細(xì)胞數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)變化

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后在光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化可知，pcDNA 3.1- Slug/ Eca- 109及miR- 140/Eca- 109組細(xì)胞與Lip 2000/Eca- 109組細(xì)胞及pcDNA 3.1/Eca- 109組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的區(qū)別主要是pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109及miR- 140/Eca- 109轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更細(xì)長(zhǎng)，見(jiàn)圖1A、B、C。

A.未轉(zhuǎn)染； B.pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109轉(zhuǎn)染，細(xì)胞變得更細(xì)長(zhǎng)； C.miR- 140/Eca- 109轉(zhuǎn)染

圖1 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后光鏡下觀察圖 ×400

2.2 體外驗(yàn)證miR- 140對(duì)EMT轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用

免疫化學(xué)染色顯示，E- 鈣黏素主要位于Eca- 109細(xì)胞的胞漿和胞膜中，N- 鈣黏蛋白主要位于包膜中，波形蛋白主要位于胞漿中，呈顆粒狀。蛋白質(zhì)印跡法檢驗(yàn)NC(non- specific control)、miR- 140模擬物、inhibitor加NC以及inhibitor轉(zhuǎn)染Eca- 109細(xì)胞后E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白、波形蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR- 140表達(dá)上調(diào)，相應(yīng)的E- 鈣黏素表達(dá)量上升，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)量下降。反之，在miR- 140表達(dá)受到抑制時(shí)，E- 鈣黏素表達(dá)量下降，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)量上升。據(jù)此可以推測(cè)miR- 140的表達(dá)可能調(diào)控E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖2、3。

GAPDH為甘油三磷酸脫氫酶

圖2 miR- 140表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)志物表達(dá)影響的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果

圖3 miR- 140表達(dá)對(duì)EMT標(biāo)志物表達(dá)影響的積分光密度(IOD)檢測(cè)結(jié)果

2.3 miR- 140對(duì)Slug的調(diào)控作用

為檢測(cè)miR- 140對(duì)Slug的調(diào)控作用，使用免疫印跡法檢測(cè)miR- 140的表達(dá)量變化與Slug表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR- 140的表達(dá)與Slug的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.96)，該結(jié)果預(yù)示著miR- 140很有可能是通過(guò)作用于Slug基因來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用的。見(jiàn)圖4～7。

2.4 miR- 140通過(guò)Slug發(fā)揮作用的驗(yàn)證

為驗(yàn)證miR- 140在Eca- 109細(xì)胞中對(duì)Slug的調(diào)控作用，通過(guò)RNA干擾的方法檢測(cè)miR- 140的表達(dá)與Slug表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示，Slug的表達(dá)水平在miR- 140抑制劑和siRNA/對(duì)照組共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均明顯降低。穿透小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-140抑制劑轉(zhuǎn)染沉默Slug的細(xì)胞后細(xì)胞的浸潤(rùn)力發(fā)生了一定程度的逆轉(zhuǎn)。由此說(shuō)明，miR- 140可能需要通過(guò)Slug發(fā)揮作用。見(jiàn)圖8、9。

圖4 定量實(shí)時(shí)檢測(cè)食管癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中Slug相對(duì)于GAPDH的表達(dá)水平

圖5 實(shí)時(shí)檢測(cè)NC組、miR- 140模擬物、抑制劑加NC和miR- 140抑制劑的Eca- 109細(xì)胞中Slug的mRNA表達(dá)水平

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NC組、miR- 140模擬物、抑制劑加NC和miR- 140抑制劑的Eca- 109細(xì)胞中的Slug表達(dá)水平(以GAPDH作為對(duì)照)

圖7 miR- 140與Slug的mRNA在腫瘤樣本中表達(dá)量之間的關(guān)系

3 討 論

近年來(lái)食管癌在全球范圍內(nèi)的致死率已經(jīng)上升至第6位[10- 11]。臨床上主要采用手術(shù)并輔以放療和化療的治療方法，然而腫瘤易轉(zhuǎn)移而使患者的生存率始終保持在很低的水平[12]。闡明食管癌發(fā)生的機(jī)制對(duì)其預(yù)防和治療具有非常重要的意義。癌細(xì)胞的侵襲性主要是通過(guò)極性和黏附性來(lái)體現(xiàn)的，一旦有極性和黏附性的上皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成具有侵襲性和移動(dòng)性的間充質(zhì)細(xì)胞后癌細(xì)胞便變成了具有侵襲性的細(xì)胞[13]。EMT因在上皮細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用而成為研究的熱點(diǎn)之一[14]。研究顯示，九成以上的惡性腫瘤均發(fā)生EMT而成為具有浸潤(rùn)性的細(xì)胞而發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。Slug是轉(zhuǎn)錄因子Snail家族的一員，主要編碼一種鋅指蛋白，在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，也是激活EMT過(guò)程中非常重要的轉(zhuǎn)錄因子之一[13]。其在EMT發(fā)生過(guò)程中主要有E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白等標(biāo)志物表達(dá)量的改變，主要是在具有浸潤(rùn)性的細(xì)胞中E- 鈣黏素表達(dá)下調(diào)、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)上調(diào)。研究表明，miRNA在EMT的發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮著調(diào)控作用，通過(guò)RNA干擾機(jī)制來(lái)沉默腫瘤基因[16]。有研究顯示，miR- 140在EC細(xì)胞中的表達(dá)量下降，Slug的表達(dá)量在EC細(xì)胞中卻有所增加，但是其機(jī)制并未闡明。本研究旨在闡述Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系并闡明其調(diào)控機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，將pcDNA 3.1- Slug質(zhì)粒和miR- 140轉(zhuǎn)入Eca- 109細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株，同時(shí)以miR- 140的模擬物、miR- 140抑制劑等來(lái)調(diào)控miR- 140的表達(dá)量，以此來(lái)探討miR- 140的表達(dá)量和Slug表達(dá)量及其他標(biāo)志物表達(dá)量之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，沉默miR- 140導(dǎo)致E- 鈣黏素表達(dá)量的減少、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)量上升，能穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，顯示具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多。而在miR- 140高表達(dá)的樣本中，由于miR- 140表達(dá)量的上升而導(dǎo)致E- 鈣黏素表達(dá)量上升，能穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說(shuō)明具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)量的下降，且miR- 140表達(dá)量和Slug的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為-0.96。推測(cè)原因miR- 140對(duì)Slug的調(diào)控可能是與其3′- UTR結(jié)合而發(fā)揮作用，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

aP<0.05

A. 在Eca- 109細(xì)胞中Slug的相對(duì)表達(dá)量，可以看出抑制劑+siRNA/對(duì)照組和抑制制劑組的Slug相對(duì)表達(dá)量明顯高于抑制劑+siRNA/Slug組；B.不同組別中侵襲細(xì)胞數(shù)目，可以看出抑制劑+siRNA/對(duì)照組和抑制劑組侵襲細(xì)胞百分含量明顯高于抑制劑+siRNA/Slug組

圖8 Slug在miR- 140抑制劑和siRNA/對(duì)照組共轉(zhuǎn)染以及Slug沉默的細(xì)胞中的表達(dá)

圖9 穿透小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 ×100

綜上所述，在食管癌細(xì)胞中Slug高表達(dá)從而能誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而miR- 140的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)Eca- 109細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，且miR- 140是通過(guò)靶向調(diào)控Slug的表達(dá)來(lái)影響食管癌的侵襲力和轉(zhuǎn)移的。

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Relationship between Slug and the invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulation mechanism

WEI Ping1，LU San- jun1，YAN Jin- hai2，GUO Jun- ping1，JIANG Lin- na1

(1.The First Hospital of Handan City，Handan 056002，China； 2.The People’s HospitalofCixian，Handan056500，China)

Objective： To study the association of Slug with invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulating mechanism. Methods: pcDNA 3.1- Slug recombinant plasmid was constructed and transfected into esophageal carcinoma cell lines of Eca- 109，with pcDNA 3.1 and Lip 2000 mock transfection served as control group. The morphological changes of cells were observed under the microscope. The expressions of E- cadherin， N- cadherin and vimentin were determined， and invasion ability of the cells before and after transfection was detected by Transwell chamber method. Results:The cells of miR- 140/Eca- 109 and pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109 became elongated. The expression of E- cadherin was down- regulated，and N- cadherin and waveform protein was increased in the Eca- 109 cells when transfected with pcDNA 3.1- Slug.The expression of E- cadherin was up- regulated， and N- cadherin and waveform protein was decreased in the Eca- 109 cells when transfected with miR- 140.The number of cells through the Matrigel was significantly reduced. The expression of miR- 140 and Slug in esophageal carcinoma cells was negatively correlated(r=-0.96). Conclusion: The Slug transcription factor can improve the ability of mesenchymal transition and invasion of esophageal epithelial cells， and miR- 140 may regulate the cell invasion of Eca- 109 via controlling Slug expression．

Slug; miR- 140; esophageal cancer; invasion ability; epithelial- mesenchymal transition

2016- 02- 01

2016- 03- 20

魏娉(1974-)，女，河北邯鄲人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。E- mail:2049167585@qq.com

魏娉，路三軍，嚴(yán)金海，等.Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(4)：569- 574．

R735.1

A

1671- 6264(2016)04- 0569- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.022