地屈孕酮對多囊卵巢綜合征妊娠大鼠種植窗期PR、ICAM- 1的影響

劉音吟，談勇，徐菊芳

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023; 2.武警南京醫(yī)院，江蘇 南京 210028)

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·論 著·

地屈孕酮對多囊卵巢綜合征妊娠大鼠種植窗期PR、ICAM- 1的影響

劉音吟1，談勇1，徐菊芳2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023; 2.武警南京醫(yī)院，江蘇 南京 210028)

目的：探討多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠低著床率的可能原因及地屈孕酮在種植窗期的作用機制。方法：80日齡始正常大鼠以生理鹽水(NS)、PCOS模型大鼠以克羅米芬(CC)連續(xù)灌胃5 d后分別與雄鼠合籠，選取妊娠大鼠隨機分為A組(正常妊娠組)、B組(PCOS妊娠組)、C組(PCOS妊娠加地屈孕酮組)3組。于妊娠第5天各組大鼠以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定雌二醇(E2)、孕酮(P)、腫瘤壞死因子(TNF-)表達(dá)水平，免疫組化法測定右側(cè)子宮內(nèi)膜孕激素受體(PR)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM- 1)表達(dá)水平。結(jié)果：種植窗期E2、TNF-表達(dá)B、C組高于A組(P<0.05，P<0.01)，P表達(dá)C、A組高于B組(P<0.05，P<0.01)，E2/P值3組間差異顯著(P<0.05，P<0.01)，PR表達(dá)B組低于A組(P<0.05)，ICAM- 1表達(dá)B組低于A、C組(P<0.05)；PR與E2、P、E2/P值均無相關(guān)性(P>0.05)，ICAM- 1與P呈正相關(guān)(P<0.05)，TNF-與E2/P值呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：PCOS大鼠低著床率可能與性激素、TNF-水平異常及低PR、ICAM- 1有關(guān)；地屈孕酮可能通過調(diào)整P、E2/P值，上調(diào)ICAM- 1、PR表達(dá)，改善卵巢功能及子宮內(nèi)膜容受性，提高胚胎著床率。

多囊卵巢綜合征； 地屈孕酮； 種植窗期； 孕激素受體； 細(xì)胞間黏附分子； 大鼠

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是生育年齡女性常見的內(nèi)分泌疾病，是導(dǎo)致無排卵型不孕癥的主要因素之一。臨床多采用促排卵治療提高患者的排卵率，但妊娠率仍普遍較低，這可能與其黃體功能不全、子宮內(nèi)膜容受性差，受精卵與子宮內(nèi)膜不能同步發(fā)育，影響胚胎著床有關(guān)。針對這種“高排低孕”的現(xiàn)象，臨床常結(jié)合孕激素早期黃體支持以減少早期妊娠丟失。子宮內(nèi)膜僅在一個很短的時間內(nèi)允許胚胎著床，這一時期子宮內(nèi)膜容受性達(dá)到最高，稱為種植窗期。現(xiàn)有研究表明，孕激素受體(PR)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM- 1)與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[1- 2]，可以作為種植窗期容受性標(biāo)志物，其表達(dá)異常易導(dǎo)致胚胎著床的失敗。本研究將圍繞種植窗期血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、腫瘤壞死因子(TNF- α)及子宮內(nèi)膜PR、ICAM- 1表達(dá)，分析各因素之間相關(guān)性，并從子宮內(nèi)膜容受性角度探討PCOS大鼠低著床率的可能原因及地屈孕酮提高著床率的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

1.1.1 實驗動物

21日齡斷乳雌性SD大鼠40只，80日齡SPF級成年雄性SD大鼠20只，均由南通大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(蘇)2008- 0010。在江蘇省中醫(yī)院動物實驗室[動物實驗使用許可證號130SYXK(蘇)2012- 0047]，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，自由采食和飲水，環(huán)境溫度22～24 ℃。

1.1.2 試劑

脫氫表雄酮(DHEA)：武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司；克羅米芬(CC)：高特制藥有限公司(批號Batch F0201)；Envision免疫組化檢測試劑盒：福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

Leica ASP300S全自動真空組織脫水機，Shandon包埋機、手動切片機及全自動染色機，OLYMPUS顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立妊娠大鼠模型及分組

1.2.1.1 建立PCOS大鼠模型 將40只21日齡斷乳雌鼠隨機分為PCOS模型組30只和正常組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d。自23日齡開始，PCOS模型組采用改良的Anderson造模法[3]，每天上午頸背部皮下注射DHEA 6 mg·(100 g)-1加0.2 ml注射用大豆油，正常組每日上午頸背部皮下注射0.2 ml注射用大豆油作為對照，兩組連續(xù)用藥30 d造模完成。自注射第20天開始，每天觀察陰道涂片，造模結(jié)束PCOS模型組大鼠始終處于動情間期，可見陰道上皮呈現(xiàn)持續(xù)性角化，無動情周期變化；于造模結(jié)束后次日PCOS模型組和正常組全部雌性大鼠眼眶靜脈采血，PCOS模型組血清睪酮值升高為造模成功。

1.2.1.2 建立妊娠大鼠模型 自80日齡起，正常組以生理鹽水(NS)10 ml·(kg·d)-1、PCOS模型組以CC 4.5 mg加NS 10 ml·(kg·d)-1，每天灌胃1次，連續(xù)用藥5 d后分別與雄鼠按2∶1合籠，次日檢查以發(fā)現(xiàn)陰栓記為妊娠第1天(d1)，作為妊娠大鼠模型(正常妊娠模型、PCOS妊娠模型)。

1.2.1.3 妊娠大鼠模型分組 隨機選取6只正常妊娠、12只PCOS妊娠模型大鼠分為3組，每組6只：A組(正常妊娠組)：從妊娠d1開始用NS 10 ml·(kg·d)-1灌胃，每天1次，連用5 d；B組(PCOS妊娠組)：從妊娠d1開始用NS 10 ml·(kg·d)-1灌胃，每天1次，連用5 d；C組(PCOS妊娠加地屈孕酮組)：從妊娠d1開始用地屈孕酮1.8 mg加NS 10 ml·(kg·d)-1灌胃，每天1次，連用5 d。

1.2.2 檢測方法及指標(biāo)

1.2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清E2、P、TNF- α表達(dá)水平 妊娠大鼠于妊娠d5處死前眼球取血清進(jìn)行ELISA檢測。

1.2.2.2 免疫組化Envision 法檢測子宮內(nèi)膜PR、ICAM- 1表達(dá)水平 妊娠大鼠于妊娠d5頸椎脫臼處死。取右側(cè)子宮固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，Envision法檢測子宮內(nèi)膜PR、ICAM- 1表達(dá)，每張切片取5個高倍視野，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測定各組光密度(OD)值，計算積分光密度(IOD)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組妊娠大鼠種植窗期血清E2、P、TNF- α表達(dá)水平及E2/P值

表1結(jié)果顯示：E2表達(dá)水平A組明顯低于B組、C組(P<0.01，P<0.05)，B組與C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；P表達(dá)水平B組明顯低于A組、C組(P<0.01)；A組與C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；E2/P值A(chǔ)組

表1 3組妊娠大鼠種植窗期血清激素、TNF- α的表達(dá)

Tab 1 The expression of serum hormone and TNF- α in three groups of rats during the implantation period

組別E2水平P水平E2/P值TNF?α水平A組66．686±12．943a2．761±0．616a24．720±5．521a0．935±0．170aB組99．165±18．4971．542±0．39166．431±12．6481．752±0．406C組91．698±19．918b2．543±0．278a36．235±7．992ab1．342±0．286b

a 與B組比較，P<0.01； b 與A組比較，P<0.05

2.2 3組妊娠大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜PR、ICAM- 1表達(dá)水平

圖1、2及表2結(jié)果顯示：3組種植窗期PR陽性細(xì)胞主要分布于細(xì)胞核；ICAM- 1陽性細(xì)胞主要分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。A組PR的IOD明顯高于B組(P<0.05)；A組與C組、B組與C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。B組ICAM- 1的IOD明顯低于A組、C組(P<0.05)；A組與C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 3組妊娠大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜PR免疫組化染色 HE×200

Fig 1 The immunohistochemical staining of PR in endometrium of three groups of rats during the implantation period(HE×200)

2.3 種植窗期子宮內(nèi)膜PR、ICAM- 1與血清E2、P、E2/P值、TNF- α的相關(guān)性

種植窗期子宮內(nèi)膜PR與E2、P、E2/P值、TNF- α均無相關(guān)性(r=0.085、0.057、-0.038、-0.272，均P>0.05)；ICAM- 1與P呈正相關(guān)(r=0.583，P<0.05)，而與E2、E2/P值、TNF- α無相關(guān)性(r=0.026、-0.450、-0.298，均P>0.05)；TNF- α與E2/P值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.535，P<0.05)，而與E2、P無相關(guān)性(r=-0.438、-0.454，均P>0.05)。

圖2 3組妊娠大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜ICAM- 1免疫組化染色 HE×200

Fig 2 The immunohistochemical staining of ICAM- 1 in endometrium of three groups of rats during the implantation period(HE×200)

表2 3組妊娠大鼠種植窗期PR、ICAM- 1表達(dá)

Tab 2 The expression of serum hormone and TNF- α in three groups of rats during the implantation period

組別PR?IOD(×104)ICAM?1?IOD(×104)A組31．47±9．71a34．68±21．26aB組13．95±10．747．84±6．64C組22．01±7．5617．99±7．47a

a 與B組比較，P<0.05

3 討 論

胚胎的成功著床取決于胚泡的侵入能力和子宮內(nèi)膜容受性。E2、P直接作用子宮內(nèi)膜，合適的E2、P是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)容受狀態(tài)的重要因素。有研究表明，子宮內(nèi)膜上很多分子的表達(dá)受E2、P調(diào)節(jié)。PR是子宮內(nèi)膜容受性的重要標(biāo)志物[2]，受雌、孕激素的調(diào)節(jié)。種植窗期子宮內(nèi)膜PR的正常表達(dá)是子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)最大容受性的關(guān)鍵。激素水平及其受體任何一項非正常表達(dá)都將影響子宮內(nèi)膜向黏附狀態(tài)的轉(zhuǎn)變歷程[4]。ICAM- 1是一種重要的細(xì)胞黏附分子，余秋波等[5]的研究表明，ICAM- 1基因及蛋白在早孕小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞均有表達(dá)且呈現(xiàn)一定規(guī)律性，與胚胎著床有關(guān)。TNF- α在適量范圍內(nèi)可刺激細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的合成，有利于蛻膜細(xì)胞外基質(zhì)降解及胎盤植入，對胎兒的生長和發(fā)育是必需的，但TNF- α過度表達(dá)可誘導(dǎo)一些有害物質(zhì)的產(chǎn)生，對妊娠不利[6]。

本研究結(jié)果顯示，各組妊娠大鼠種植窗期血清TNF- α、子宮內(nèi)膜PR、ICAM- 1均有表達(dá)，但PCOS妊娠大鼠血清P、子宮內(nèi)膜PR、ICAM- 1表達(dá)水平顯著低于正常妊娠大鼠、而血清E2、E2/P、TNF- α明顯高于正常妊娠大鼠，這說明種植窗期PCOS妊娠大鼠雌孕激素表達(dá)異常、TNF- α高表達(dá)、子宮內(nèi)膜PR和ICAM- 1低表達(dá)，使子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育不同步，內(nèi)膜容受性下降，是導(dǎo)致低著床率的可能原因之一。PCOS妊娠大鼠加用地屈孕酮后，血清P、ICAM- 1水平顯著提高、E2/P值顯著下降，改善了卵巢功能及子宮內(nèi)膜容受性，使著床率提高。本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，種植窗期子宮內(nèi)膜ICAM- 1與P呈正相關(guān)，TNF- α與E2/P值呈負(fù)相關(guān)，因此通過補充地屈孕酮，提高P、降低E2/P值，能在一定程度上上調(diào)ICAM- 1水平，調(diào)整TNF- α，改善內(nèi)膜的容受性，這也是加用地屈孕酮提高著床率的可能作用機制。但是，單純補充地屈孕酮雖能提高血中P水平，卻未必能相應(yīng)增加子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)，不能顯著提高對孕激素的攝取量，無法完全糾正內(nèi)膜容受不良的狀態(tài)及避免早期流產(chǎn)的發(fā)生。

在對有生育要求PCOS患者促排治療中，早黃體期加用地屈孕酮能改善內(nèi)膜容受性，提高早期妊娠率。在臨床治療中，我們可以結(jié)合種植窗期性激素水平評估胚胎著床情況，但是也應(yīng)該認(rèn)識到調(diào)控胚胎著床的機理非常復(fù)雜，受很多因素調(diào)控，還有許多未知因子參與其中，因此不能把激素水平高低作為評判胚胎著床與否的單一性指標(biāo)。同時，我們更應(yīng)該認(rèn)識到，對PCOS患者促排卵前調(diào)整其內(nèi)分泌水平，提高子宮內(nèi)膜容受性，才是減少妊娠丟失的根本手段。

[1] 張煒,周劍萍,劉銀坤,等.細(xì)胞間黏附分子- 1在小鼠孕早期子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律及調(diào)節(jié)的研究[J].生殖與避孕,2000,20(1)：12- 16．

[2] 馮苗,李素春,潘萍,等.不明原因不孕患者著床窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)與性激素及其受體表達(dá)[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2009,18(6)：437- 439．

[3] ANDERSON E,LEE G Y.Polycystic ovarian condition in the dehydroepiandrosterone- treated rat model:hyperandrogenism and the resumption of meiosis are major initial events associated with cystogenesis of antral follicles[J].Anat Ree,1997,249(1):44- 53．

[4] 李莉,章漢旺,鄧彧,等.來曲唑與克羅米芬促排卵對小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)和雌孕激素受體表達(dá)的影響[J].中國婦幼保健雜志,2008,23(10)：1411- 1433．

[5] 余秋波,何俊琳,李紅梅,等.早孕小鼠子宮內(nèi)膜ICAM- 1的表達(dá)及意義[J].西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2007,29(2)：32- 35．

[6] 王玲.助孕寧I號方治療Th1/Th2失衡的腎虛型不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的應(yīng)用研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2012．

Effect of dydrogesterone on progesterone receptor and intercellular adhesion molecule- 1 in pregnant rats with polycystic ovarian syndrome in planting window period

LIU Yin- yin1，TAN Yong1，XU Ju- fang2

(1.Nanjing Traditional Chinese Medicine University，Nanjing 210023，China；2.ArmedPoliceHospitalofNanjing，Nanjing210028，China)

Objective： To investigate the possible reasons for low rate of implantation in rats with polycystic ovarian syndrome(PCOS)and the influence mechanism of dydrogesterone on implantation rate of PCOS rats. Methods: From the 80th day after birth， normal rats were given normal saline(NS) and PCOS rats model were given clomiphene(CC) for five consecutive days. Then they were mated with male rats. The pregnant rats were selected and divided into three groups with 6 in each group: group A(normal pregnant rats); group B(PCOS pregnant rats); group C(PCOS pregnant rats with dydrogesterone).On the 5th day of pregnancy， the levels of E2，P and TNF- α in each group were determined by ELISA ， and the expression levels of progesterone receptor(PR) and intercellular adhesion molecule- 1(ICAM- 1) in endometrium were detected by immunohistochemistry. Results: In planting window period ，the levels of E2 and TNF- α in group B and C were higher than those in group A(P<0.05，P<0.01)；the levels of P in group A and C were higher than those in group B(P<0.05，P<0.01). The values of E2/P in the three groups were significantly different(P<0.05，P<0.01).The expression of PR in group B was lower than that in group A(P<0.05)， and ICAM- 1 expression levels in group B were lower than those in group A and C(P<0.05). PR expression had no correlation with E2， P and E2/P(P>0.05).ICAM- 1 was positively correlated with P， while TNF- α was negatively correlated with E2/P. Conclusion: Low rate of implantation in PCOS pregnant rats was probably associated with abnormal sex hormone levels， TNF- α and decreased expression of PR and ICAM- 1.Dydrogesterone can possibly improve the rate of implantation through adjusting P and E2/P， upregulating ICAM- 1 and PR expression， and improving ovarian function and the receptivity of endometrium.

polycystic ovarian syndrome; dydrogesterone; implantation; progestrone receptor; intercellular adhesion molecule- 1; rats

2016- 04- 01

2016- 05- 01

江蘇省中醫(yī)藥科技項目(LZ11182)

劉音吟(1978-)，女，江蘇常熟人，講師，在讀博士研究生。E- mail：liuyinyin2005@163.com

談勇 E- mail:xijun1025@163.com

劉音吟，談勇，徐菊芳.地屈孕酮對多囊卵巢綜合征妊娠大鼠種植窗期PR、ICAM- 1的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，35(4)：514- 518.

R- 33； R711.75

A

1671- 6264(2016)04- 0514- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.009