miRNA145介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜微粒減少血管平滑肌細(xì)胞遷移

黃若蘭，張忠，陳銘泰，王玲，常曉，喬秋杰

(1.深圳市中醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518033； 2.深圳市中醫(yī)院 心血管科，廣東 深圳 518033； 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 518000)

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·論 著·

miRNA145介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜微粒減少血管平滑肌細(xì)胞遷移

黃若蘭1，張忠2，陳銘泰3，王玲1，常曉1，喬秋杰1

(1.深圳市中醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518033； 2.深圳市中醫(yī)院 心血管科，廣東 深圳 518033； 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 518000)

目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)膜微粒對血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖遷移的影響及其機(jī)制。方法：誘導(dǎo)MSC凋亡釋放膜微粒(MSC- MPs)用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對照組(A組)、膜微粒組(B組)、miRNA145組(C組)、膜微粒加抗miRNA145組(D組)及膜微粒加miRNA145組(E組)5組。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)評價(jià)VSMC的遷移能力，免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)等比較各組VSMC凋亡水平。以實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA145表達(dá)水平。結(jié)果：E組VSMC遷移數(shù)量最少[(40.4±3.0)個]，D組最多[(69.0±5.6)個]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miRNA145的表達(dá)水平E組最高，A組與D組最低(P<0.05)；MTT結(jié)果提示E組VSMC增殖抑制率及凋亡率最高，D組最低(P<0.05)；半胱氨酸蛋白酶- 3免疫印跡法結(jié)果也類似。結(jié)論：MSC- MPs可減少VSMC凋亡，抑制VSMC遷移，而miRNA145參與了這一過程。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 膜微粒； 血管平滑肌細(xì)胞； 遷移； 凋亡

動脈粥樣硬化性疾病在我國發(fā)病率及死亡率都高居首位。由血管功能失衡和損傷修復(fù)引起的血管重構(gòu)，是眾多血管疾病的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[1]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)作為維持血管壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要成分，與多種血管性疾病如動脈粥樣硬化斑塊、冠脈介入術(shù)后再狹窄等密切相關(guān)[2- 4]。抑制VSMC的增殖和遷移可能會給此類疾病的治療帶來新的希望。

VSMC的功能受到多因素調(diào)節(jié)，有報(bào)道稱微小RNA(miRNA)145抑制VSMC的增殖、凋亡、遷移，與心肌祖細(xì)胞存活、損傷修復(fù)及缺氧耐受性有關(guān)，間接對VSMC起保護(hù)作用[5]。miRNAs通過調(diào)節(jié)VSMC功能影響血管疾病的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)得到多方驗(yàn)證[6]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，許多干細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM- MSCs)移植具有巨大應(yīng)用潛力[7]，能在應(yīng)激或凋亡時通過旁分泌機(jī)制產(chǎn)生膜微粒(microparticles，MPs)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息傳遞，發(fā)揮與來源細(xì)胞類似的作用[8- 9]。干細(xì)胞通過旁分泌機(jī)制釋放的外泌體含有促進(jìn)受損組織修復(fù)的miRNAs，說明干細(xì)胞的功能與miRNAs調(diào)控存在相關(guān)性[10]。本研究采用血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)的VSMC遷移模型，以MSCs- MPs與VSMC共培養(yǎng)，慢病毒轉(zhuǎn)染干預(yù)miRNA145表達(dá)或抑制確認(rèn)其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

1.1.1 細(xì)胞 雄性SD大鼠4只，鼠齡4～6周，體重60～80 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。大鼠頸椎脫臼處死后，提取股骨和脛骨骨髓腔中的干細(xì)胞，詳細(xì)方法見參考文獻(xiàn)[11- 12]。

1.1.2 主要試劑 洛斯維培養(yǎng)基(RPMI 1640)購自美國GIBCO公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、Dulbecco’s改良培養(yǎng)基(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(EDTA)等細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)試劑均購自美國Hyclone公司,AngⅡ購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司，總RNA抽提試劑(Trizol)提取液購自美國Invitrogen公司，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)小室(transwell)購自美國Corning公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)購自美國Sigma公司，特殊化學(xué)修飾的miRNA145拮抗劑(antago- miRNA145)及其陰性對照(null- miRNA)購自廣州優(yōu)迪生物科技有限公司。其他試劑為分析純，購自廣州化學(xué)制劑總廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MSC的提取及鑒定 將MSC接種于10%FBS、DMEM培養(yǎng)基，置于飽和濕度、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。收集在對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)干預(yù)和實(shí)驗(yàn)。第4代MSC培養(yǎng)至80%融合時，改變培養(yǎng)條件為無血清、低氧(體積分?jǐn)?shù)94%N2、5%CO2和1%O2)，72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，低速離心5 min，將上清液分裝入超速離心管，提取方法見文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 VSMC分離與培養(yǎng) 無菌條件下分離SD大鼠胸主動脈，小心去除內(nèi)膜和外膜，取中層平滑肌切成1 mm3左右的組織塊，以含20% FBS的DMEM培養(yǎng)液行組織貼壁法原代培養(yǎng)。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下靜置培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)液。待單層細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿約80%時，取出組織塊傳代。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，含10%FBS、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 U·ml-1青霉素、100 μg·ml-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用融合度90%左右的第3～5代VSMC。

1.2.3 miRNA145的過表達(dá)與敲除實(shí)驗(yàn) VSMC更換無FBS、無抗生素DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以不含血清培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基(Opti- MEM)準(zhǔn)備miRNA145(或者antago- miRNA145)和脂質(zhì)體2000(lipo2000)的混合液。100 μl Opti- MEM中加入1 μl lipo2000以及50 nmol·L-1(低濃度組)或100 nmol·L-1(高濃度組)的miRNA145(5′- GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU- 3′)，或者抗miRNA145(5′- AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC- 3′)，然后加入到以400 μl不完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的VSMC中，柔和混勻后孵育24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) A組為對照組(VSMC+AngⅡ)：Ang誘導(dǎo)的VSMC遷移模型；B組為膜微粒組(MSC- MPs+VSMC+AngⅡ)：MSC- MPs與Ang誘導(dǎo)的血管平滑肌共培養(yǎng)；C組為miRNA145組(過表達(dá)miRNA145+VSMC+AngⅡ)：構(gòu)建過表達(dá)miRNA145轉(zhuǎn)染VSMC，AngⅡ誘導(dǎo)遷移模型；D組為膜微粒加抗miRNA145組(MSC- MPs+抗miRNA145+VSMC+AngⅡ)：MSC膜微粒與抗miRNA145轉(zhuǎn)染的VSMC共培養(yǎng)，AngⅡ誘導(dǎo)遷移；E組為膜微粒加miRNA145組(MSC- MPs+miRNA145- VSMC+AngⅡ)：MSC膜微粒與miRNA145過表達(dá)的VSMC共培養(yǎng)，觀察AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC遷移。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 各組VSMC按每孔0.5×105個細(xì)胞接種于遷移實(shí)驗(yàn)小室6孔共培養(yǎng)板上層(底部為聚酯透明濾膜)，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后向培養(yǎng)液中加入100 nmol·L-1的AngⅡ作用6 h，建立VSMC遷移模型。各組VSMC按每孔1×105個細(xì)胞接種于遷移實(shí)驗(yàn)小室6孔共培養(yǎng)板下層。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，共培養(yǎng)72 h。取出遷移實(shí)驗(yàn)小室上室，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，用棉簽小心擦去微孔膜上層細(xì)胞，甲醇室溫固定30 min。0.05%結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，輕輕撕下基底膜，倒扣至載玻片，風(fēng)干后用中性樹膠封片，在200倍顯微鏡下選取5個不重疊區(qū)域計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 MTT法檢測細(xì)胞活性水平 收集VSMC，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個·ml-1，每孔加入100 μl，體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)過夜，于每孔待測細(xì)胞中加入MTT溶液20 μl(5 mg·ml-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞砜150 μl，搖床低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(A值)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值為該組A值。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測VSMC凋亡率 按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ- FITC)操作說明檢測細(xì)胞凋亡。把細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量胰酶消化細(xì)胞，室溫孵育至適當(dāng)時機(jī)，吸除胰酶細(xì)胞消化液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新離心管內(nèi)，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5～10萬重懸的細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入100 μl 1倍 Annexin Ⅴ緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μl熒光素(AnnexinⅤ- FITC)和 5 μl 碘化丙啶染色液(PI)，輕輕混勻。20～25 ℃避光孵育15 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin Ⅴ- FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.8 免疫印跡法檢測各組半胱氨酸蛋白酶- 3活性 收集上述各組VSMC，向每管沉淀細(xì)胞中加入100 μl放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液，混勻后移入1.5 ml離心管。加入苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF，1∶100)，在4 ℃冰箱中靜置30 min后，于4 ℃離心20 min，按照蛋白定量試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。以50 μl上樣，經(jīng)10%SDS聚丙酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，與半胱氨酸蛋白酶- 3(1∶1 000)常溫?fù)u床振蕩孵育2 h。加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)標(biāo)記的二抗(博士德公司，1∶2 500稀釋)，常溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯影，曝光。以β- 肌動蛋白作為內(nèi)參，利用Image- Pro Plus 6.0 成像系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)印跡條帶的積分光密度(IOD)值，并計(jì)算各組半胱氨酸蛋白酶- 3的IOD值與內(nèi)參IOD值的比值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測miRNA145的表達(dá)水平 Trizol法提取VSMC總RNA后，在紫外分光光度計(jì)儀上測A260/A280值，計(jì)算RNA純度和濃度，選擇介于1.8～2.1者為合格樣品，可用于實(shí)驗(yàn)。采用miRNA145特異性逆轉(zhuǎn)錄引物及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA(TaKaRa)。miRNA145莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物：5′- GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGGGATTC- 3′；實(shí)時定量PCR上下游引物序列如下：正向，5′- GAAGGTCCAGTTTTCCCAGG- 3′；反向，5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT- 3′。定量PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s(收集熒光信號)，40個循環(huán)。融解曲線分析：溫度60～95 ℃，每分鐘讀1次。RNU6B作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)源性參照。miRNA145的相對表達(dá)量采用經(jīng)典的2-ΔCt來表示(ΔCt=Ct miRNA-CtU6)。每個標(biāo)本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MSC凋亡時釋放膜微粒的鑒定

低氧低營養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h的BM- MSCs，凋亡率為10%，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液超速離心后得到沉淀，經(jīng)過流式細(xì)胞儀對這些結(jié)構(gòu)的表型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其可表達(dá)CD29、CD44和CD73，而不表達(dá)CD31和CD45，與MSC的表型一致，說明來自MSC，即MSC- MPs。

2.2 VSMC的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及鑒定

培養(yǎng)的VSMC呈典型“峰- 谷”樣生長；同一視野下明光觀察病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體積無改變，細(xì)胞分泌物無增加。

2.3 VSMC遷移情況

遷移實(shí)驗(yàn)小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E組VSMC遷移數(shù)量最少[(40.4±3.0)個]，D組[(69.0±5.6)個]與A組[(71.4±2.3)個]之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而多于B組[(50.8±2.6)個]以及C組[(42.4±3.3)個](P<0.05)。

2.4 VSMC轉(zhuǎn)染后miRNA145的表達(dá)

RT- PCR測定miRNA145的表達(dá)水平：A組

2.5 MTT檢測VSMC增殖抑制率

MTT法檢測不同分組對VSMC增殖抑制率的影響，各組結(jié)果見圖1。E組增殖抑制率(24.71%±3.20%)最高，D組(4.97%±4.17%)最低(P<0.05)。

圖1 各組間VSMC增殖抑制率差異

Fig 1 Differences of VSMC proliferation rate in each group

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測VSMC凋亡率結(jié)果

E組凋亡率(13.03%±0.75%)最高，D組(4.12%±0.40%)最低(P<0.05)，與A組(2.87%±0.40%)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.7 VSMC的半胱氨酸蛋白酶- 3表達(dá)

與A組相比，E、C、B組的半胱氨酸蛋白酶- 3蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，D組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

3 討 論

膜微粒是在細(xì)胞損傷、激活或者凋亡時從細(xì)胞膜上脫落的直徑<1 μm的膜性囊泡，從其形成及產(chǎn)生方式的不同，膜微粒主要分為兩類：(1)外排體(exosomes)，為均質(zhì)的膜微粒，直徑40～100 nm，是由細(xì)胞的內(nèi)吞噬而儲存于細(xì)胞質(zhì)多泡體中，并通過胞吐作用釋放至內(nèi)環(huán)境中，其標(biāo)志物包括CD9、CD63、Alix、flotillin- 1和Tsgl01等；(2)膜微囊(microvesicles)，為不均質(zhì)的膜微粒，直徑50～1 000 nm，由細(xì)胞質(zhì)膜直接出芽、分裂而產(chǎn)生，其沒有特定的標(biāo)志物，有報(bào)道稱標(biāo)志物與來源干細(xì)胞類似[13]。目前國內(nèi)外對BM- MSCs的研究認(rèn)為：許多細(xì)胞包括干細(xì)胞能在激活或者凋亡時通過旁分泌機(jī)制產(chǎn)生MPs[14- 15]，其攜帶表面受體、生物活性分子實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息傳遞，發(fā)揮與來源細(xì)胞類似的作用。

miRNA發(fā)現(xiàn)于真核生物中，是由18～25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，可通過與特定miRNA的3′非翻譯區(qū)(3′- untranslated region，3′UTR)結(jié)合，促使miRNA降解或抑制miRNA的翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)。近年來，對miRNA與干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，在多種干細(xì)胞中均存在各自特異的miRNA表達(dá)，對干細(xì)胞的生物學(xué)活動具有重要的調(diào)控作用。以往研究顯示幾種miRNAs家族成員可維持胚胎干細(xì)胞的多能性[16- 17]，此外，干細(xì)胞通過旁分泌機(jī)制釋放的外泌體含有促進(jìn)受損組織修復(fù)的miRNAs，說明干細(xì)胞的功能與miRNAs調(diào)控存在相關(guān)性。Collino等[18]發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs同時存在于膜微粒及其來源的MSC中，然而有一部分miRNAs卻選擇性地僅存在于膜微粒。而另一部分miRNAs僅存在于MSC。由此可見，間充質(zhì)干細(xì)胞能旁分泌產(chǎn)生膜微粒。同時膜微粒攜帶的RNA為其發(fā)揮疾病治療作用的主要組分之一。

本研究通過建立VSMC遷移模型，采用MSC- MPs與VSMC共培養(yǎng)的方式，明確MSC- MPs能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC遷移，減少VSMC遷移率以及增加VSMC凋亡，采用miRNA145干預(yù)后，過表達(dá)miRNA145加強(qiáng)MSC- MPs的這一作用，而抑制miRNA145減弱MSC- MPs對VSMC的作用，提示MSC- MPs的抑增殖、抑凋亡作用與miRNA145正相關(guān)。miRNA145具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移等作用，而MSC- MPs與血管平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)也有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的作用[5，19]，說明MSC- MPs對VSMC的作用與miRNA有關(guān)，MSC- MPs影響VSMC的增殖、遷移及凋亡有可能通過miRNA145來實(shí)現(xiàn)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組凋亡率結(jié)果

Fig 2 Apoptosis rate of VSMC in each group detected by flow cytometry

圖3 各組VSMC的半胱氨酸蛋白酶- 3表達(dá)

Fig 3 Expression of caspase- 3 in VSMC in each group detected by Western blot

VSMC參與多種疾病的病理過程，VSMC的增殖、遷移和黏附引起血管內(nèi)膜增生，導(dǎo)致動脈粥樣硬化和再狹窄，對心血管性疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用[20]。對于終末期心血管病，采用干細(xì)胞治療曾被寄予厚望，然而由于損傷組織的缺血缺氧環(huán)境，90%以上的MSC移植入體內(nèi)后72 h內(nèi)死亡，在存活的干細(xì)胞中，通過旁分泌機(jī)制產(chǎn)生的膜微粒有可能在修復(fù)及再生損傷組織的過程中起關(guān)鍵作用[21]。我們的實(shí)驗(yàn)提示這一作用有可能通過miRNA來實(shí)現(xiàn)。然而轉(zhuǎn)染miRNA145后VSMC的遷移減少，凋亡也明顯增加，VSMC適當(dāng)?shù)牡蛲雎适蔷S持血管結(jié)構(gòu)及形態(tài)的影響因素之一，過度凋亡也會導(dǎo)致血管壁變薄，是動脈粥樣硬化斑塊易損性的干預(yù)靶點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)中觀察到的VSMC凋亡是否有利于改善動脈粥樣硬化和血管狹窄性疾病，需要動物模型或者其他實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。抑制miRNA145后MSC- MPs抑制VSMC遷移及增加凋亡率的作用減少，提示miRNA145有可能起關(guān)鍵調(diào)控作用。但干細(xì)胞膜微粒并非通過單一機(jī)制實(shí)現(xiàn)細(xì)胞調(diào)控，仍有待繼續(xù)深入研究，以期為心血管疾病的干細(xì)胞治療帶來進(jìn)展及突破。

[1] 王鳳，章怡祎，劉萍.動脈粥樣硬化動物模型的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，33(2):235- 238．

[2] 劉晶，馬坤嶺，倪杰，等.動脈粥樣硬化模型小鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，30(4):537- 540．

[3] MARX S O，TOTARY- JAIN H，MARKS A R.Vascular smooth muscle cell proliferation in restenosis[J].Circ Cardiovasc Interv，2011，4(3): 104- 111．

[4] 吳校林，江洪，陳靜，等.Kindlin- 2對血管平滑肌細(xì)胞遷移和黏附的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華心血管病雜志，2014，42(11):938- 943．

[5] 金杰，廖明芳，王亮，等.微小RNA調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖及其參與心血管疾病病理形成的研究進(jìn)展[J].中華心血管病雜志，2015，43(9): 837- 840.

[6] 蔣珽，項(xiàng)陽.MicroRNA 在冠心病中的作用研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，31(5):639- 643．

[7] 黎葉飛，盛祖龍，姚玉宇，等.兩種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植途徑治療急性心肌梗死的比較研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，30(5):687- 691．

[8] CHEN L，WANG Y，PAN Y，et al.Cardiac progenitor- derived exosomes protect ischemiac myocardium from acute ischemia/reperfusion injury[J].BBRC，2013，431(4):566- 571．

[9] van BERLO J H，KANISICAK O，MAILLET M，et al.C- kit+cells minimally contribute cardiomyocytes to the heart[J].Nature，2014，509(3):337- 345．

[10] 王艷，石蓓.微小核糖核酸與干細(xì)胞移植治療心肌梗死的研究進(jìn)展[J].中國循環(huán)雜志，2015，30(207):916- 918．

[11] ELLISON G M，VICINANZA C，SMITH A J，et al.Adult c- kitpos cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair[J].Cell，2013，8(3):827- 842．

[12] 吳原波，尹琪，金培峰，等.SDF- 1α在體內(nèi)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用及其對缺血心臟修復(fù)的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，41(2):136- 140．

[13] 耿志敏，王玨，范鴻洋，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜微粒促進(jìn)大鼠心肌梗死后血管新生[J].中國病理生理雜志，2015，8(3):1371- 1375.

[14] NIEUWLAND R，STURK A.Why do cells release vesicles[J].Thromb Res，2010，125(1):49- 51．

[15] MAYERS J R，AUDHYA A.Vesicle formation within endosomes∶an ESCRT marks the spot[J].Commun Integr Biol，2012，5(1):50- 56．

[16] HEINRICH E M，DIMMELER S.MicroRNAs and stem cells: control of pluripotency，reprogramming，and lineage commitment[J].Circ Res，2012，110(3):1014- 1022．

[17] LEONARDO T R，SCHULTHEISZ H L，LORING J F，et al.The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming[J].Nat Cell Biol，2012，14(3):1114- 1121．

[18] COLLINO F，DEREGIBUS M C，BRUNO S，et al.Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected pattern of miRNAs[J].PLoS One，2010，5(7):11803- 11803．

[19] 龍仙萍，崔璨，陳攀科，等.降鈣素基因相關(guān)肽和受體活性修飾蛋白1對血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制[J].中華心血管病雜志，2015，43(6):537- 541.

[20] LI T S，TAKAHASHI M，OHSHIMA M，et al.Myocardial repair achieved by the intramyocardial implantation of adult cardiomyocytes in combination with bone marrow cells[J].Cell Transplant，2008，17(6):695- 703．

[21] GATTI S，BRUNO S，DEREGIBUS M C，et al.Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia- reperfusion- induced acute and chronic kidney injury[J].Nephrol Dial Transplant，2011，26(5):1474- 1484．

Bone marrow mesenchymal stem cell microparticles reduce the migration of vascularsmooth muscle cells through miRNA145

HUANG Ruo- lan1，ZHANG Zhong2，CHEN Ming- tai3，WANG Ling1，CHANG Xiao1，QIAO Qiu- jie1

(1.Department of Intensive Care Unit，Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518033，China；2.DepartmentofCardiology，ShenzhenTraditionalChineseMedicineHospital，Shenzhen518033，China；3.GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510000，China)

Objective: To investigate the impact and mechanism of microparticles derived from bone marrow mesenchymal stem cells (MSC- MPs) on migration and apoptosis of vascular smooth muscle cells(VSMCs).Methods: The bone marrow mesenchymal stem cells were induced to release microparticles(MSC- MPs) through apoptosis for the experiment.Five experimental groups were listed as follows: control group(A group); microparticles group(B group); miRNA145 group(C group); microparticles+antago- miRNA145 group(D group); microparticles+miRNA145 group(E group). Transwell assay was applied to detect the migration of smooth muscle cells， Western blot was used to determine the expression of protein， and flow cytometry and MTT were employed to examine the level of apoptosis in each group.The expression of miRNA145 was determined by real- time polymerase chain reaction(RT- PCR).Results: The number of VSMC migration was significantly lower in E group(40.4±3.0) than that in D group (69.0±5.6)(P<0.05).The MTT and flow cytometry showed that the expression of miRNA145， VSMC proliferation inhibition rate and apoptosis rate were highest in E group and lowest in D group(P<0.05).The result of caspase-3 expression evaluated by Western blot showed the same tendency. Conclusion: MSC- MPs could reduce the apoptosis of VSMC and inhibit the migration of VSMC， while miRNA145 is involved in the process．

bone marrow mesenchymal stem cell； microparticle； vascular smooth muscle cell； migration； apoptosis

2016- 03- 01

2016- 04- 15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573922)；廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項(xiàng)目(20151076)；廣東省科技廳-廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合項(xiàng)目(2014A020221002)

黃若蘭(1981-)，女，廣東饒平人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。E- mail：46743509@qq.com

張忠 E- mail:zzicu@126.com

黃若蘭，張忠，陳銘泰，等.miRNA145介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜微粒減少血管平滑肌細(xì)胞遷移[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(4)：475- 481．

R329.2

A

1671- 6264(2016)04- 0475- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.001