慢性酒精暴露對SD大鼠急性腦缺血再灌注后早期海馬齒狀回顆粒下區(qū)神經干細胞的影響

陳鐘樑 李正儀 李紅蕾

慢性酒精暴露對SD大鼠急性腦缺血再灌注后早期海馬齒狀回顆粒下區(qū)神經干細胞的影響

陳鐘樑 李正儀 李紅蕾

目的 探討慢性酒精暴露對SD大鼠急性腦缺血再灌注后早期海馬齒狀回顆粒下區(qū)（SGZ）神經干細胞（NSCs）的影響。方法 將SD大鼠隨機分為正常組（自來水喂養(yǎng)）、對照組[單純大腦中動脈閉塞（MCAO），自來水喂養(yǎng)]和酒精組（酒精暴露后MCAO，6%乙醇水溶液喂養(yǎng)）。正常組于飼養(yǎng)28d后灌注取腦，對照組、酒精組分別于造模后1、3、7d灌注取腦。切取以視交叉前緣至垂體后緣包含海馬區(qū)厚約4mm的組織塊進行石蠟包埋、切片、HE染色、巢蛋白（Nestin）染色處理；使用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，計算并比較每張切片Nestin陽性細胞數(shù)。結果 HE染色可見對照組、酒精組造模后1d腦組織開始出現(xiàn)神經元損傷，造模后3d達到高峰，造模后7d開始恢復，且酒精組更為嚴重；正常組未見神經元損傷。Nestin染色可見對照組造模后1d SGZ Nestin陽性細胞開始增多，造模后7d達到高峰；酒精組造模后1d SGZ Nestin陽性細胞開始增多，3d達到高峰，造模后7d明顯回落；正常組SGZ可見少量散在分布的Nestin陽性細胞。酒精組Nestin陽性細胞的數(shù)量明顯少于對照組（P＜0.05）。結論 慢性酒精暴露可明顯抑制MCAO后早期內源性NSCs增殖，抑制損傷后神經組織自身的修復，從而導致缺血性腦卒中的預后不良。

慢性酒精暴露 大腦中動脈閉塞 神經干細胞

研究表明缺血性腦卒中可激活內源性神經干細胞（neural stem cells，NSCs）增殖，并誘導其遷徙、分化，從而促進腦卒中后的神經再生與功能恢復[1]。有文獻報道長期大量飲酒是腦卒中的常見病因之一，是增加腦卒中后長期病死率的獨立危險因子[2]。酒精中毒可能會影響血脂、血壓、紅細胞、血小板功能、腦局部血流量、心律失常、β-內啡肽和鎂離子等，從而間接促使腦卒中的發(fā)生[3-4]。然而目前對腦卒中后影響機制尚不清楚，故本實驗擬通過研究慢性酒精暴露對大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后早期內源性NSCs增殖的影響，進一步闡明長期大量飲酒對大鼠MCAO后的影響機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 健康、雄性、清潔級SD大鼠42只，鼠齡2個月，體重（200±10）g，由西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心提供。75%醫(yī)用乙醇、10%水合氯醛和4%多聚甲醛，由西安交通大學醫(yī)學試劑科提供；兔抗大、小鼠Nestin蛋白多克隆抗體，由北京博奧森生物技術有限公司提供；SAP法檢測試劑盒，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將42只SD大鼠隨機分為正常組6只、對照組（單純MCAO組）18只和酒精組（酒精暴露MCAO組）18只；對照組、酒精組大鼠再分為造模后1、3、7d等3個亞組，每個亞組6只。

1.2.2 動物模型建立 （1）慢性酒精暴露模型的制作：以6%乙醇水溶液作為飲水的唯一來源飼養(yǎng)28d，制作慢性酒精暴露模型；而對照組、正常組均以自來水喂養(yǎng)。（2）MCAO模型的制作：采用改良線栓法制作MCAO模型[5]，造模成功的大鼠左眼虹膜顏色變淺、眼裂變小、瞳孔縮小，右側偏癱以上肢為甚，提尾懸拉后出現(xiàn)向右旋轉。

1.2.3 術后評分 采用Zea-longa的5級4分法進行神經系統(tǒng)缺損程度評分，即無神經功能缺損癥狀為0分；輕微神經功能缺損，不能完全伸展右側前爪為1分；中度局灶性神經功能缺損，向右側轉圈為2分；重度局灶性神經功能缺損，向右側傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識水平下降為4分。實驗大鼠評分均≥2分。

1.2.4 標本取材與固定 正常組于飼養(yǎng)28d后灌注取腦，對照組、酒精組3個亞組分別于造模后1、3、7d灌注取腦。使用4%多聚甲醛灌注取腦后，切取以視交叉前緣至垂體后緣包含海馬區(qū)厚約4mm的組織塊，用石蠟包埋固定；按5μm厚度連續(xù)切片，隔五取三，分別進行HE染色、巢蛋白（Nestin）染色；使用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，隨機選取每只大鼠3張非連續(xù)切片，隨機選取每個部位3～4個非重疊視野進行計數(shù)，得出每張切片Nestin陽性細胞數(shù)。1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠體重變化及腦大體觀察 3組大鼠飼養(yǎng)28d后，正常組體重為（363.9±8.4）g，大于酒精組的（333.8± 41.5）g，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組（364.8± 26.4）g比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。酒精組、對照組灌注取腦，MCAO側半球明顯腫脹，以視交叉前緣向前5mm、向后8mm為肉眼所見腦缺血區(qū)的大體定位，且酒精組更為嚴重。大鼠腦底、腦凸面均未發(fā)現(xiàn)出血情況。

2.2 腦組織HE染色結果 正常組神經元形態(tài)正常，未見神經元損傷。對照組造模后1d可見缺血區(qū)域（基底核外側區(qū)、頂葉、顳葉）神經元部分皺縮呈三角形，部分呈不規(guī)則形態(tài)，細胞核濃染，胞質嗜酸性，中間夾雜一定數(shù)量的正常神經元，細胞周圍間隙增寬，毛細血管擴張充血；造模后3d缺血區(qū)域神經細胞大量脫失，腦組織結構變疏松，呈透亮的篩孔狀結構，殘存的神經細胞發(fā)生固縮，核仁不可見，神經膠質細胞數(shù)量明顯減少，間質呈空泡樣改變甚至大片破壞；造模后7d缺血區(qū)域神經細胞大量脫失，殘存的神經細胞發(fā)生固縮，核仁個別可見，神經膠質細胞反應性增生，神經細胞、神經膠質細胞周圍的細胞間隙明顯增大，間質染色變淡，組織稀疏。酒精組造模后1、3、7d細胞組織學表現(xiàn)與對照組類似，但神經組織損傷相對更重。3組大鼠造模后HE染色結果，見圖1（插頁）。

2.3 Nestin染色結果 正常組海馬齒狀回顆粒下區(qū)（subgranular zone，SGZ）可見少數(shù)散在分布的Nestin陽性細胞，左右兩側Nestin陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組造模后1d可見SGZ Nestin陽性細胞開始增多，造模后7d達到高峰，缺血側明顯多于對側（P＜0.05）。酒精組造模后1d可見SGZ Nestin陽性細胞開始增多，造模后3d達到高峰，造模后7d明顯回落。酒精組造模后1、3、7d雙側大腦Nestin+細胞數(shù)均明顯少于對照組（P＜0.05）。3組大鼠造模后Nestin染色結果見圖2（插頁），SGZ Nestin陽性細胞數(shù)見表1。

表1 3組大鼠造模后SGZ區(qū)Nestin陽性細胞數(shù)（個/視野）

3 討論

Nestin屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，是哺乳動物神經系統(tǒng)先祖細胞中的一種主要細胞骨架蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在神經胚開始形成、NSCs增殖時，會出現(xiàn)Nestin表達；隨著神經細胞的遷移，NSCs逐漸向祖細胞分化，Nestin表達逐漸減弱，直至神經細胞遷移完成；出現(xiàn)明顯分化特征時，Nestin表達完全停止，并被其他中間纖維蛋白取代[6]。很多研究者把Nestin陽性細胞近似看作是NSCs。

本研究結果顯示，對照組大鼠造模后1d可見SGZ Nestin陽性細胞持續(xù)增多，與王細林等[7]應用Nestin染色研究腦缺血后NSCs激活的實驗結果“SGZ Nestin陽性細胞在腦缺血后7d達到高峰”相同；以上說明MCAO可以誘導NSCs的激活。Shen等[8]亦研究發(fā)現(xiàn)大鼠MCAO后3、7d，大腦多個部位存在Nestin陽性細胞。此外，酒精組大鼠造模后亦出現(xiàn)Nestin陽性細胞增多，在造模3d達到高峰后開始回落；與Zhao等[9]研究結果“大劑量慢性酒精暴露（6.4%乙醇水溶液喂養(yǎng)）會加重大鼠腦缺血再灌注損傷”一致；以上提示慢性酒精暴露可以明顯抑制NSCs的激活。對照組、酒精組在MCAO后均出現(xiàn)雙側SGZ Nestin陽性細胞增多，且以缺血側為主；與Jin等[10]研究結果“一側腦缺血能啟動雙側大腦半球的NSCs，且以病灶側更為明顯”一致。

綜上所述，一側MCAO可以誘導SD大鼠雙側NSCs的激活，以缺血側為主；而大劑量慢性酒精暴露會明顯抑制MCAO后早期內源性NSCs的激活與增殖，抑制損傷后神經組織自身的修復，從而導致缺血性腦卒中的預后不良。

[1]Kokaia Z,Lindvall O.Neurogenesis after ischaemic brain insults [J].Curr Opin Neurobiol,2003,13(1):127-132.

[2]Naess H,Waje-Andreassen U,Nyland H.Risk factor burden predicts long-term mortality in young patients with arterial cerebral infarction[J].Acta NeurolScand,2013,127(2):92-96.

[3]Altura B M,Gebrewold A,Altura B T,et al.Role of brain[Mg2+]in alcohol-induced hemorrhagic stroke in a rat model:a 31P-NMR in vivo study[J].Alcohol,1995,12(2):131-136.

[4]Hillbom M,Juvela S,Karttunen V.Mechanisms of alcohol-related strokes[J].Novartis Found Symp,1998,216:193-207.

[5]戴炯,文立,熊文浩,等.改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型[J].上海交通大學學報(醫(yī)學版),2007(10):1218-1222.

[6]Lendahl U,Zimmerman L B,McKay R D.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein[J].Cell,1990,60(4): 585-595.

[7]王細林,曾慶杏,陳迎春.N-Methyl-D-Aspartate受體拮抗劑對腦缺血后成年大鼠神經干細胞內源性激活的實驗研究[J].中風與神經疾病雜志,2005(2):121-124.

[8]Shen C C,Yang Y C,Chiao M T,et al.Characterization of endogenous neural progenitor cells after experimental ischemic stroke[J].Curr Neurovasc Res,2010,7(1):6-14.

[9]Zhao H,Mayhan W G,Arrick D M,et al.Dose-related influence of chronic alcoholconsumption on cerebralischemia/reperfusion injury[J].AlcoholClin Exp Res,2011,35(7):1265-1269.

[10]Jin K,Minami M,Lan J Q,et al.Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(8): 4710-4715.

Effect of chronic alcoholic exposure on endogenous neural stem cells in rat hippocampal dentate gyrus at early stage of acute cerebralischemia and reperfusion

CHEN Zhongliang,LI Zhengyi,LI Honglei.Department of Neurosurgery，Huzhou Central Hospital，Huzhou 313000,China

Objective To investigate the effect of chronic alcoholic exposure on the proliferation of endogenous neural stem cells(NSCs)in rat subgranular zone(SGZ)in hippocampal gyrus at the early stage of acute cerebral ischemia and reperfusion. Methods Forty-two SD rats were divided into 3 groups randomly:6 rats were fed with clean water(normal group), 18 rats underwent middle cerebral artery occlusion(MCAO)/reperfusion and fed with clean water(model group)and 18 rats underwent MCAO/reperfusion and fed with 6%alcoholas(alcohol group).Rats from normal group were sacrificed 28 days after feeding,and rats from model group and alcoholic group were sacrificed at 1,3 or 7 days after establishment of MCAO and reperfusion model,respectively.Brain samples were collected immediately after sacrifice.Brain tissues including hippocampal dentate gyrus were selected for paraffin imbedding and tissue slicing.HE stain was performed to detect the neuron damage,and immunohistochemistry stain was applied to detect the expression of Nestin in brain tissue.Images were obtained by image analysis system and the number of Nestin positive cells in each slice was calculated. Results Based on the HE stain,neuron damage was observed from day 1 after model establishment in model group and alcoholic group,peaked at the day 3 and reduced at the day 7.Neuron damage was not observed in normal group.A few Nestin positive cells were detected in the SGZ of normal group from the immunohistochemistry.In model group,the number of Nestin positive cells increased from day 1 after model establishment,peaked at day 7.And in alcoholic group,the number of Nestin positive cells increased from day 1 after model establishment,peaked at day 3,and reduced at day 7.Compared with model group,the number of Nestin positive cells in SGZ of alcoholic group was significantly reduced(P＜0.05). Conclusion Chronic alcoholic exposure can reduce the proliferation of endogenous NSCs in SGZ,leading to a poor prognosis of cerebral ischemic/reperfusion injuty.

Chronic alcoholic exposure Middle cerebralartery occlusion Neuralstem cells

2016-02-15）

（本文編輯：陳丹）

313000 湖州市中心醫(yī)院神經外科（陳鐘樑）；西安交通大學附屬第一醫(yī)院神經內科（李正儀）；浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院神經內科（李紅蕾）

李紅蕾，E-mail：honglei2015@foxmail.com