曲古抑菌素A對博萊霉素致肺纖維化小鼠NF-κB表達的影響研究

黃旭晴 徐長青 李旭

曲古抑菌素A對博萊霉素致肺纖維化小鼠NF-κB表達的影響研究

黃旭晴 徐長青 李旭

目的 觀察曲古抑菌素A（TSA）對博萊霉素（BLM）誘導的肺纖維化小鼠核因子-κB（NF-κB）表達的影響。方法96只健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、TSA早期干預組和TSA晚期干預組，各24只。模型組、TSA早期干預組和TSA晚期干預組小鼠均予以氣管內滴注BLM（10mg/kg體重）溶液0.15m l誘導肺纖維化模型，對照組小鼠予0.9%氯化鈉注射液0.15m l氣管內滴注。建模后，TSA干預組分階段（早期：第1～14天；晚期：第15～28天）予以TSA（40mg/kg體重）溶液腹腔注射，2次/周。模型組和對照組予以等體積二甲基亞砜腹腔注射作為溶媒對照。建模后第7、14、28天各組均隨機分3批處死小鼠8只，留取右肺上葉組織行HE染色和Masson染色觀察肺泡炎及肺纖維化程度，并行Szapiel評分，右肺中、下葉組織堿水解法檢測羥脯氨酸（HYP）含量，免疫組化方法檢測NF-κB表達水平。結果 病理學檢查比較，對照組小鼠肺泡結構正常，模型組小鼠肺組織在第7天出現(xiàn)出血、滲出等肺泡炎性改變，第28天出現(xiàn)明顯肺纖維化。模型組小鼠肺組織各時點肺泡炎Szapiel評分、HYP含量、NF-κB表達水平均高于對照組（均P＜0.05）；TSA早期干預組小鼠各時點以上指標均低于模型組（均P＜0.05），而TSA晚期干預組與模型組比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。結論 早期應用TSA或能通過抑制NF-κB的表達發(fā)揮延緩肺纖維化的作用。

曲古抑菌素A 肺間質纖維化 核因子-κB

特發(fā)性肺纖維化是一種病因不明、以進展性的肺纖維化炎癥反應為特征的肺間質疾病，其發(fā)病率約為0.1‰，且呈逐年增長趨勢[1]。特發(fā)性肺纖維化可見于各年齡段患者，預后不良，中位生存時間僅有3年[2]。研究顯示，肺泡上皮細胞的過度凋亡參與了肺纖維化的發(fā)生[3]，而轉化生長因子β（TGF-β）通過激活其下游效應分子Smad2或Smad3在肺纖維化中也發(fā)揮重要作用[4]。核因子-κB（NF-κB）可激活TGF-β，促進成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達，介導肺泡炎和肺纖維化；而血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）可下調NF-κB的表達，抑制器官纖維化[5]。曲古抑菌素A（TSA）為鏈霉菌代謝產(chǎn)物，是一種組蛋白脫乙酰基轉移酶抑制劑。TSA已被報道可以抑制低氧或血管內皮生長因子誘導的新生血管形成[6]，但其對組織纖維化影響的研究還未深入?；诖?，本研究以博萊霉素（BLM）致肺纖維化小鼠模型[7]為實驗對象，探討TSA對BLM誘導的肺纖維化小鼠NF-κB表達的影響，以期為臨床防治肺纖維化提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：健康SPF級、雄性C57BL/6小鼠（南京君科生物工程有限公司）96只，6~8周齡，體重18~22g。主要試劑：TSA（美國Sigma公司），BLM（日本化藥株式會社），NF-κB p65試劑盒（武漢博士德生物有限公司），羥脯氨酸（HYP）檢測試劑盒（南京建成生物研究所），Masson染液試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度23～27℃，濕度55%～65%，12h光照/黑暗交替；適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法將小鼠分為4組（模型組、TSA早期干預組、TSA晚期干預組、對照組），每組各24只。

1.2.2 肺纖維化小鼠模型建立和干預 肺纖維化小鼠模型建立：4組小鼠均予頸正中切開，鈍性分離淺筋膜逐層暴露氣管；模型組、TSA早期干預組、TSA晚期干預組小鼠均予一次性快速氣管內滴注BLM（10mg/kg體重）溶液0.15ml，對照組小鼠予一次性快速氣管內滴注0.9%氯化鈉注射液0.15ml；而后將4組小鼠均直立、快速旋轉2min，使藥液盡可能均勻分布于肺組織。建模后，TSA早期干預組小鼠于第1~14天予TSA（40mg/kg體重）溶液腹腔注射，2次/周；TSA晚期干預組小鼠于第15~28天予TSA（40mg/kg體重）溶液腹腔注射，2次/周；模型組和對照組小鼠于同時間點予等體積二甲基亞楓（DMSO）腹腔注射作為溶媒對照。

1.3 觀察指標 4組小鼠均分別于建模后第7、14、28天隨機處死8只。小鼠予氯胺酮腹腔注射麻醉后開胸，分離氣管和肺組織；迅速將右肺上葉組織置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，一部分作HE染色及Masson染色進行病理學觀察，另一部分作免疫組化染色檢測NF-κB表達水平；留取右肺中、下葉組織，剪碎后制成勻漿于-20℃冰箱保存，用于檢測肺組織HYP含量。

1.3.1 肺組織病理學觀察 肉眼觀察小鼠肺組織大體病理學表現(xiàn)，光鏡下HE染色觀察肺泡炎和肺纖維化程度，以Szapiel評分方法判定肺泡炎和肺纖維化程度[8]。肺泡炎分級：0級示正常肺泡形態(tài)，計1分；Ⅰ級示輕度肺泡炎，計2分；Ⅱ級示中度肺泡炎，計3分；Ⅲ級示重度肺泡炎，計4分。肺纖維化分級：0級示正常肺組織，無纖維化；Ⅰ級示輕度纖維化，受累面積＜20%，纖維化累及胸膜、胸膜下肺間質，肺泡結構發(fā)生紊亂；Ⅱ級示中度纖維化，病變范圍約占全肺20%～50%，肺纖維化區(qū)域從胸膜開始延伸，但仍屬局部性；Ⅲ級示重度纖維化，病變范圍＞50%，并有融合，可見大小不等的囊氣腔，并伴有廣泛肺實質結構紊亂。光鏡下Masson染色觀察肺組織膠原沉積情況，通過測定組織積分光密度（IOD）值進行半定量分析。

1.3.2 肺組織HYP含量檢測 取凍存的肺組織（濕質量30～40mg/只）剪碎后制成勻漿，采用堿水解法檢測組織HYP含量（mg/g肺組織），具體操作嚴格按HYP檢測試劑盒說明書進行。

1.3.3 肺組織NF-κB表達水平檢測 采用免疫組化SP法染色，肺組織切片皆采用圖像分析軟件先進行顏色分離，然后自動計算其IOD值進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件；計量資料以 表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 4組小鼠各時點肺組織大體病理學表現(xiàn)比較 對照組小鼠各時點肺組織均濕潤、有彈性、表面光滑，呈粉紅色。模型組小鼠第7天時肺組織呈暗紅色，可見較多點狀病灶；第14天時肺組織出現(xiàn)較多片狀白色病灶，肺體積縮小，肺彈性下降；第28天時肺組織呈蒼白色，肺體積明顯縮小，彈性明顯降低，硬度增加，可見散在的細小出血點，表面不光滑，凹凸不平。TSA早期干預組小鼠第28天時肺部濕潤、有彈性、表面光滑，體積縮小不明顯，彈性尚好，表面輕微結節(jié)樣改變。TSA晚期干預組小鼠第28天時病變與模型組小鼠相似。

2.2 4組小鼠各時點肺組織病理學表現(xiàn)比較

2.2.1 HE染色病理學表現(xiàn) 對照組小鼠各時點均肺泡壁完整，肺泡腔內無明顯滲出。模型組小鼠出現(xiàn)肺泡、肺間質及支氣管壁不同程度的纖維增厚，肺部結構明顯破壞的病理改變；第7天肺泡中可見到巨噬細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤；第14天時仍可見少數(shù)炎性細胞浸潤，部分肺泡萎縮、閉合，成纖維細胞增加；第28天肺泡炎減輕，呈現(xiàn)彌漫性纖維化改變，少見炎性細胞浸潤。與模型組比較，TSA早期干預組小鼠第7、14、28天時肺泡炎和肺纖維化均不明顯；TSA晚期干預組小鼠與模型組比較，表現(xiàn)相似，第7、14天時仍出現(xiàn)明顯巨噬細胞和淋巴細胞等炎性細胞浸潤和纖維化改變，第28天時肺組織結構破壞明顯、炎性細胞浸潤減少，而肺間質大量膠原沉積。4組小鼠各時點肺泡炎Szapiel評分比較見表1。

由表1可見，4組小鼠各時點肺泡炎Szapiel評分比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。與對照組比較，TSA早期干預組、TSA晚期干預組、模型組小鼠各時點肺泡炎Szapiel評分均升高（均P＜0.05）。與模型組比較，TSA早期干預組小鼠各時點肺泡炎Szapiel評分均降低（均P＜0.05），TSA晚期干預組小鼠各時點肺泡炎Szapiel評分差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與TSA晚期干預組比較，TSA早期干預組小鼠各時點肺泡炎Szapiel評分亦均降低（均P＜0.05）。

2.2.2 Masson染色病理學表現(xiàn) 對照組小鼠肺組織各時點均未見藍色膠原沉積。模型組小鼠肺組織各時點均可見藍色膠原沉積，并隨著小鼠生存時間延長，藍色膠原沉積加重。TSA早期干預組小鼠肺組織各時點也可見藍色膠原沉積，其表現(xiàn)介于對照組與模型組之間。TSA晚期干預組小鼠肺組織各時點藍色膠原沉積表現(xiàn)與模型組相仿。4組小鼠肺組織各時點Masson染色光鏡下所見見圖1-4，Masson染色的IOD值見表2。

表1 4組小鼠各時點肺泡炎S z a p i e l評分比較（分）

表2 4組小鼠各時點肺組織Masson染色的I OD值比較

圖1 對照組小鼠肺組織各時點光鏡下所見（a：第7天；b：第14天；c：第28天；Masson染色，×400）

圖2 模型組小鼠肺組織各時點光鏡下所見（a：第7天；b：第14天；c：第28天；Masson染色，×400）

圖3 T SA早期干預組小鼠肺組織各時點光鏡下所見（a：第7天；b：第14天；c：第28天；Masson染色，×400）

圖4 T SA晚期干預組小鼠肺組織各時點光鏡下所見（a：第7天；b：第14天；c：第28天；Masson染色，×400）

由表2可見，4組小鼠肺組織各時點Masson染色的IOD值比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。與對照組比較，TSA早期干預組、TSA晚期干預組、模型組小鼠肺組織各時點Masson染色IOD值均升高（均P＜0.05）。與模型組比較，TSA早期干預組小鼠肺組織各時點Masson染色IOD值均降低（均P＜0.05），TSA晚期干預組小鼠肺組織各時點Masson染色IOD值差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與TSA晚期干預組比較，TSA早期干預組小鼠肺組織各時點Masson染色IOD值亦均降低（均P＜0.05）。

2.3 4組小鼠各時點肺組織HYP含量比較 見表3。

表3 4組小鼠各時點肺組織H Y P含量比較（m g/g肺組織）

由表3可見，4組小鼠肺組織各時點HYP含量比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。與對照組比較，TSA早期干預組、TSA晚期干預組、模型組小鼠肺組織各時點HYP含量均升高（均P＜0.05）。與模型組比較，TSA早期干預組小鼠肺組織各時點HYP含量均降低（均P＜0.05），TSA晚期干預組小鼠肺組織各時點HYP含量差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與TSA晚期干預組比較，TSA早期干預組小鼠肺組織各時點HYP含量亦均降低（均P＜0.05）。

2.4 4組小鼠各時點肺組織NF-κB表達水平比較 見表4。

表4 4組小鼠各時點肺組織N F-κB表達水平（I OD值）比較

由表4可見，4組小鼠肺組織各時點NF-κB表達水平比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。與對照組比較，TSA早期干預組、TSA晚期干預組、模型組小鼠肺組織各時點NF-κB表達水平均升高（均P＜0.05）。與模型組比較，TSA早期干預組小鼠肺組織各時點NF-κB表達水平均降低（均P＜0.05），TSA晚期干預組小鼠肺組織各時點NF-κB表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與TSA晚期干預組比較，TSA早期干預組小鼠肺組織各時點NF-κB表達水平亦均降低（均P＜0.05）。

3 討論

肺纖維化是多種肺部慢性疾病后期的共同結局，其病理特點是早期肺泡炎和后期成纖維細胞大量增生及膠原纖維進行性沉積并取代正常的肺組織結構[9]。肺纖維化的發(fā)生與TGF-β、NF-κB等許多細胞因子有關。TGF-β通過激活下游效應分子Smads家族而介導致纖維化信號通路的傳導[10]。而NF-κB通過活化轉谷酰氨酶的啟動子，調控多種細胞因子基因表達增加，激活TGF-β，促進成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，介導肺泡炎和肺纖維化。NF-κB是影響肺纖維化形成與發(fā)展的重要細胞因子。

TSA為作為鏈霉菌代謝產(chǎn)物，可影響NF-κB的核轉錄，抑制NF-κB依賴的啟動子活性[11]。研究表明，血管內皮生長因子受體抑制劑通過抑制脂多糖誘發(fā)的NF-κB激活，減少TNF-α、TGF-β等細胞因子的合成，減輕炎癥因子的釋放，能緩解急性肺損傷中內皮細胞炎性損害[12]。TSA通過分子靶向作用減少組蛋白的乙?；潭龋淖兘M蛋白乙?；氖Ш鉅顟B(tài)所引起的基因調控失衡[13]，起到調控基因表達，抑制多種腫瘤細胞的生長，誘導細胞凋亡的作用[14]。研究顯示，上皮細胞的過度凋亡導致肺組織結構破壞，產(chǎn)生肺纖維化[15]。肺纖維化時膠原纖維明顯增多，HYP為膠原纖維所特有，檢測肺組織HYP的含量對于判斷肺纖維嚴重程度意義重大[16]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肺纖維化發(fā)生過程中，肺組織HYP含量進行性增加，早期給予TSA處理后HYP含量會降低，晚期給予TSA處理則效果不明顯[17]。本研究結果也同樣顯示早期給予TSA處理后HYP含量會降低，同時還發(fā)現(xiàn)TSA早期干預組小鼠肺組織NF-κB表達水平較模型組、TSA晚期干預組減少，較對照組升高。這說明肺組織NF-κB的表達水平越高，肺纖維化程度相對越嚴重。早期TSA干預后小鼠肺組織Masson染色顯示藍色膠原沉積明顯減少，這間接說明TSA能抑制小鼠肺組織NF-κB的表達，通過早期抗炎達到抑制肺纖維化作用。

綜上所述，本研究通過分析TSA對BLM誘導肺纖維化小鼠的NF-κB表達的影響，探討防治肺纖維化的新途徑。結果發(fā)現(xiàn)早期應用TSA或能通過抑制NF-κB的表達達到延緩肺纖維化的目的，這為目前臨床肺纖維化的治療提供重要思路。

[1]Behr J.The d iagnosis and treatment of id iopathic pulmonary fib rosis[J].Dtsch Arzteb l Int,2013,110(51-52)：875-881.

[2]Ahluwalia N,Shea B S,Tager AM,etal.New therapeutic targets in id iopathic pulmonary fib rosis.Aim ing to rein in runaway woundhealing responses[J].Am JResp ir CritCare Med,2014,190(8)：867-878.

[3]Kalayarasan S,Sriram N,Soumyakrishnan S,et al.Diallylsulfide attenuates excessive collagen p roduction and apop tosis in a rat model of b leomycin induced pulmonary Fib rosis through the involvement of p rotease activated recep tor-2[J].Toxicol App l Pharmacol,2013,271(2)：184-195．

[4]Usuki J,Matsuda K,Azum a A,et al.Sequential analysis of m yofib rob last d ifferentiation and transform ing g row th factor-β1/ Smad pathway activation in murine pu lm onary fib rosis[J].Nippon Med Sch,2012,79(1)：46-59．

[5]水華,陳德基.苯那普利對單側輸尿管梗阻大鼠腎臟的保護作用[J].中國醫(yī)師雜志,2002,4(7)：684-686,689.

[6]Deroanne C F,Bonjean K,Servotte S,etal.Histone deacetylases inhibitors as anti-ang iogenic agents altering vascular endothelial g row th factor signaling[J].Oncogene,2002,21(3)：427-436.

[7]Maheshwari U,Gup ta D,Aggarwal A N,et al.Spectrum and d iagnosis of id iopathic pulmonary fib rosis[J].Ind ian J Chest Dis Allied Sci,2004,46(1)：23-26.

[8]Szap ielSV,Elson N A,Fulmer JD,etal.Bleom yeinduce interstitial pulmonaty d isease in the nude,athym icm ouse[J].Am Rev Resp ir Dis,1979,120(4)：893-899.

[9]孔勤,陳民利.特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機制的研究進展[J].中國比較醫(yī)學雜志,2012,22(8)：74-74.

[10]Ham id T,Guo SZ,Kingery JR,eta l.Card iom yocyte NF-KB p65 p romotes adverse remodeling,apop tosis,and endop lasm ic reticulum stress in heart failure[J].Card iovasc Res,2011,89(1)：129-138.

[11]Rahman M M,Kukita A,Kukita T,etal.Two histone deacetylase inhibitors,trichostatin A and sodium butyrate,supp ress d ifferentiation into osteoc lasts but not into mac rophages[J]. Blood,2003,101(9)：3451-3459.

[12]Parekh D,DancerRC,ThickettDR.Acute lung injury[J].Clin Med (Lond),2011,11(6)：615-618.

[13]Kouzarides T.Histone acetylases and deacetylases in cell p roliferation[J].CurrOp in GenetDev,1999,9(1)：40-48.

[14]Yang H,Nie Y,LiY,etal.Histonemod ification-med iated CYP2E1 gene exp ression and apop tosis ofHepG2 cells[J].Exp BiolMed (Maywood),2010,235(1)：32-39.

[15]DanialN N.BCL-2 fam ily p roteins：checkpoints o fapop totic cell death[J].Clin Res,2007,13(24)：7254-7263.

[16]Aytem ur Z A,Hacievliyag ilSS,Iraz M,etal.Effects of ilop roston b leomycin-induced pulmonary fib rosis in rats com pared withm ethyl-p rednisolone[J].Rev PortPneumo l,2012,18(6)：272-277.

[17]黃旭晴,施長春,李旭,等.曲古抑菌素A對博萊霉素致肺纖維化小鼠新生血管的影響[J].浙江醫(yī)學,2014,36(5)：370-373.

Trichostatin A affects expression of NF-κB in mice w ith bleomycin-induced pulmonary fibrosis

HUANG Xuqing,XU Changqing,LI Xu.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310015,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of trichostatin A on exp ression of NF-κB in m ice w ith b leomycin-induced pulmonary fibrosis. Methods Ninty-six male C57BL/6 m ice were random ly allocated into four g roups w ith 24 in each g roup：saline controlg roup(control g roup),b leomycin-induced pulmonary fib rosis g roup(model g roup),early TSA treatment group(early g roup),and late TSA treatmentg roup(late g roup).Eightm ice in each g roup were sacrificed at d7,d14 and d28．The lung tissue samp les were taken and hematoxylin eosin and Masson staining were adop ted to evaluate the severity of pulmonary inflammation and fib rosis.The contents of hyd roxyp ro1ine(HYP)in the lung tissues were detected by alkaline hyd rolysis technique. Results The lung tissue in model group p resented significant b leed ing and effusion at d7 and pulmonary fib rosis at d28．Bleed ing,effusion and pulmonary fib rosis were attenuated in early treatment g roup com pared to model group at the same time points．Hyd roxyp roline content and the exp ression of NF-κB in lung tissue were significantly higher in model g roup than those in control g roup(both P＜0.05).Compared w ith model g roup,early g roup showed m ilder alveolitis and lower Szapielscore of pulmonary fib rosis,decreased hyd roxyp rollne content and NF-κB exp ression at the same time points(both P＜0.05).However,there were no significant differences in above ind icators between late g roup and model group. Conclusion Early treatmentof TSA can alleviate b leom ycin-induced pulmonary fibrosis via inhibiting early inflammation and inhibiting exp ressions of NF-κB.

Trichostatin A Pulmonary fib rosis NF-κB

2016-05-23）

（本文編輯：李媚）

杭州市社會發(fā)展自主申報項目（20160533B18）；浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2015C33258）；杭州市衛(wèi)生科技計劃項目（2011A017）

310015 杭州師范大學附屬醫(yī)院呼吸科

黃旭晴，E-mail：h x q3871@126.com