珙桐種子快速繁殖技術(shù)的研究

吳俊長，李 萌，曹福祥，吳林世，劉志明，鄧飄云

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004）

珙桐種子快速繁殖技術(shù)的研究

吳俊長，李 萌，曹福祥，吳林世，劉志明，鄧飄云

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004）

珙桐種子在自然條件下一般需要經(jīng)過1～2年的休眠期才能萌發(fā)成苗，較長的休眠期限制了珙桐的繁殖能力。本研究以采集剛結(jié)出的珙桐種子為材料，利用種胚組織培養(yǎng)培育珙桐幼苗。研究從培養(yǎng)基成分、滅菌方式、激素配比、培養(yǎng)條件等方面分析了影響珙桐種子萌發(fā)和幼苗生長的因素。結(jié)果表明，在適合的條件下，當(dāng)年產(chǎn)的珙桐種子可以跳過休眠期直接發(fā)育成苗。本研究為打破珙桐種子休眠，實現(xiàn)高效率、低成本快速育苗提供了理論基礎(chǔ)。

珙桐；組織培養(yǎng)；種子休眠

珙桐Davidia involucrataBaill.是珙桐科珙桐屬，第三紀(jì)古熱帶植物孑遺種，因其巨大的白色苞片形似白鴿，故又名鴿子樹，具有很高的觀賞價值、藥用價值和科研價值。珙桐對生長環(huán)境要求苛刻，生存空間時時刻刻面臨著威脅。同時因為休眠期長、種子敗育等原因，其自然繁殖能力很低，已成為瀕臨滅絕的中國特有的樹種，生長群落分布呈倒金字塔型。近年來由于亂砍濫伐、過度放牧、過度采摘等人為因素，珙桐的生長環(huán)境受到嚴(yán)重破壞，珙桐的群體數(shù)量逐漸減少，分布面積也逐漸縮小，保護(hù)珙桐資源并提高其自身繁殖能力是亟待解決的關(guān)鍵問題。

20世紀(jì)80年代以來，我國學(xué)者對珙桐開展了大量的研究，取得了一些進(jìn)展。為了打破珙桐種子休眠，在育苗方面常采用機(jī)械破損種子法、變溫處理法、化學(xué)試劑處理法、人畜尿液浸泡法、扦插、沙藏、濕砂層積法來處理種子[1-3]。牛文娟等[4]綜合前人珙桐種子育苗的方法，總結(jié)出濕沙沉積法是提高珙桐種子萌發(fā)整齊度的最有效方法，與變溫處理等其他方法結(jié)合效果更好，然而仍未有成型的工廠化育苗技術(shù)。珙桐等木本植物自然繁殖能力很低，種子內(nèi)部含有某種抑制發(fā)芽的物質(zhì)，且需要經(jīng)歷后熟過程，實生苗的培育需要較長的種子萌發(fā)期[5]。

木本植物的組培，存在著褐化的問題。褐化即酚污染，由植物的外植體變褐而死亡的現(xiàn)象。木質(zhì)素、單寧、色素含量豐富的木本植物比草本植物就更容易發(fā)生褐化。不同種類植物的褐化情況不同[6-9]，而同一種植物，不同品種褐化率也不同[10]。珙桐組培的褐化率比較高，珙桐組培繁殖受到褐化而死亡的情況比較嚴(yán)重。

組織培養(yǎng)方面，研究人員選取珙桐的冬芽、根、莖、葉、胚、花藥等為外植體，已進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)[11-13]，種胚離體培養(yǎng)[14-15]，叢生芽的誘導(dǎo)[16-18]等培養(yǎng)方式。李月琴等[15]以成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，培育出幼苗，但分化率低，難以形成完整的植株，生產(chǎn)的幼苗率不太理想，褐化數(shù)量大，成本高。余阿梅等[14]把果實保存在河沙中層積一年，使其發(fā)育后進(jìn)行組培誘導(dǎo)，但仍需一年時間，已成熟的果實經(jīng)歷了木質(zhì)化，種殼堅硬，難以操作。并且，珙桐中經(jīng)過切割處理的損傷部位極易產(chǎn)生致密氧化物而褐化，從而導(dǎo)致成活率下降。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，在珙桐果實的選材、培養(yǎng)基成分的組成、滅菌方式和培養(yǎng)條件等因素上進(jìn)行了優(yōu)化，利用本研究提供的方法，可以從當(dāng)年產(chǎn)的新鮮種子直接獲得幼苗，跳過了休眠期，為珙桐快速繁育提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

研究材料選用2014年6月采自張家界桑植縣八大公山珙桐林的新鮮果實（未木質(zhì)化）。清水洗凈存放于4℃冰箱中待用。

培養(yǎng)基成分：WPM木本植物基本培養(yǎng)基，MS草本植物基本培養(yǎng)基和用于胚萌發(fā)的1/2MS+3 mg/LIBA+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L GA3培養(yǎng)基、促進(jìn)珙桐生芽的1/2MS+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基（以上培養(yǎng)基均含蔗糖20 g+瓊脂粉6 g）

1.2 實驗方法

（1）材料的測量記錄：測量珙桐果實的長度、寬度、重量。以及計算出長寬比。

（2）外植體滅菌： 干熱滅菌：在超凈工作臺上，用槍型鑷子夾住珙桐果實在100%酒精燈上灼燒滅菌，灼燒時間不宜過長?；瘜W(xué)滅菌：用75%酒精滅菌、0.1%升汞浸泡6～20 s，無菌水里沖洗3～4次。

（3）種胚的獲得：用刀片在無菌環(huán)境下削除果肉，得到種胚。記錄每個果實中的正常胚與敗育胚。將正常胚分為去胚乳和未去胚乳兩種類型。

（4）將帶胚乳的胚放入以下配好的培養(yǎng)基中①WPM培養(yǎng)基； ②MS培養(yǎng)基； ③1/2MS激素培養(yǎng)基，而將去胚乳的胚放入WPM培養(yǎng)基。

（5）培養(yǎng)條件：12 h光照和12 h黑暗處理，溫度24±3℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，濕度約為65%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 珙桐種子敗育情況分析

對果實的重量、寬度、長度、長寬比、飽滿胚個數(shù)（正常）、死亡胚個數(shù)（敗育）、敗育比做進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，珙桐果實的重量與長度、寬度均成極顯著正相關(guān)，重量與長寬比呈極顯著負(fù)相關(guān)；長度與寬度極顯著正相關(guān)。一般比較飽滿的珙桐果實中的種子營養(yǎng)物質(zhì)比較充分，后期胚的發(fā)育過程中生命力比較頑強(qiáng)，生長狀況比較好。種子大小在采集期（6月下旬）已經(jīng)不再變化，后期果實和種子體積停止生長，而其內(nèi)果皮逐漸木質(zhì)化。剛形成的珙桐果實呈嫩綠色，去掉果肉后，正常發(fā)育的種子呈梭形，胚乳肥厚。珙桐果實內(nèi)為8心皮結(jié)構(gòu)，而自然條件中8個胚珠中往往只有1～2個能正常發(fā)育并最終成苗。相關(guān)性分析表明珙桐的重量與正常胚個數(shù)之間相關(guān)性不顯著（表1）。

表1 珙桐種子的重量、長度、寬度、正常胚與敗育胚的相關(guān)性分析?Table 1 Correlation analysis of Davidia involucrate seed weight, length, width, normal embryo and abortive embryos

2.2 珙桐果實的滅菌

本研究采用了 5種消毒方式共處理 60個外植體，20天后統(tǒng)計污染率，其中用 75%酒精或 0.1%升汞對外果皮滅菌 16～20 s后，再在無菌工作臺上去果肉并接種，這種滅菌方式效果較差，后期污染嚴(yán)重。用 75%酒精或 0.1%升汞對去果肉的珙桐種胚滅菌 6～10 s，會導(dǎo)致種胚后期在培養(yǎng)基上生長的褐化程度及氧化程度增加（見表2）。

表2 不同消毒方式對于外植體的影響Table 2 Influence of different disinfection methods for explants

由于珙桐果實的果肉較厚。將珙桐果實直接在100%酒精燈上（700～1 000℃）快速、充分的灼燒，這樣既快速滅菌，又未對種胚造成損害。且灼燒滅菌未發(fā)現(xiàn)有感染現(xiàn)象，說明這種滅菌方式更適合。

表3 珙桐在不同培養(yǎng)基的生長狀況Table 3 Growth status of Davidia involucrate in different culture mediums

圖1 去胚乳類的珙桐內(nèi)種胚在WPM基本培養(yǎng)基的生長發(fā)育狀況Fig.1 Growth and development status of Davidia involucrate embryo of removed the endosperm in the WPM basic medium

2.3 珙桐的生長狀況

組培條件為 12 h光照和 12 h黑暗，溫度為24±3℃，光照強(qiáng)度 2 000 lx，用空氣加濕器控制濕度在 65%左右。將珙桐外植體分別接種于不同的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)一段時間記錄結(jié)果（見表3）

去胚乳的種胚在不加任何激素的WPM上前期生長情況優(yōu)于其他處理（如圖1）。研究表明，如果內(nèi)種胚完整，則會形成快速生長的珙桐幼苗。如果內(nèi)種胚不完整，則會形成愈傷組織（見圖2）。

將帶胚乳的胚接種于WPM培養(yǎng)基上，外表面 2天后形成少許致密氧化物，些許褐化，15天后去掉胚乳，可以進(jìn)入快速生長階段（如圖 3）。

珙桐胚（帶胚乳）接種于激素MS培養(yǎng)基（1/2MS+3 mg/LIBA+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L GA3）上，只有少數(shù)能形成愈傷組織，而大多數(shù)珙桐種子的表面氧化速度過快，里面內(nèi)種胚的生長速度比外面的氧化速度慢，最終導(dǎo)致種胚未萌發(fā)，迅速被致密氧化物包裹而死亡（如圖4，珙桐C）。珙桐胚（帶胚乳）接種于可能誘導(dǎo)珙桐長芽的激素MS培養(yǎng)基內(nèi)（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA），結(jié)果與珙桐C類似（如圖4，珙桐D）。珙桐胚（帶胚乳）接種于原始MS基本培養(yǎng)基內(nèi)，表面氧化速度較慢，里面營養(yǎng)物質(zhì)不斷積累，胚乳不斷脹大，最后爆裂而出，但不能萌發(fā)，無法延續(xù)生長成完整的珙桐苗（如圖4，珙桐E）。

圖2 WPM基本培養(yǎng)基上去胚乳不完全：一半去胚乳，一半保留Fig.2 WPM basic culture medium: half out of endosperm,half remain

圖3 未去除胚乳的珙桐胚在WPM基本培養(yǎng)基的生長發(fā)育狀況Fig. 3 Growth and development status of Davidia involucrate embryo of not removed the endosperm in the WPM basic medium

圖4 在不同的1/2MS培養(yǎng)基上珙桐胚（未去胚乳）的生長狀況； E：珙桐胚（未去胚乳）在普通MS上的生長狀況Fig. 4 Growth condition of Davidia involucrate embryo (not to endosperm) in different 1/2MS culture mediums.E:Growth condition of Davidia involucrate embryo (not to endosperm) in ordinary MS

3 討 論

珙桐的繁殖困難，珙桐種子屬雙重休眠類型，由于珙桐核果的果核壁細(xì)胞高度木質(zhì)化，增厚各組成分在三維空間排列，相互穿插、縱橫交織、彼此嵌合，形成了果核壁的高強(qiáng)度結(jié)構(gòu)，萬朝琨[19]對休眠的珙桐種子進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)：由剛采收的珙桐種子的魚雷形胚，經(jīng)過層積處理后，可發(fā)育成成熟胚，反映出珙桐種子的胚有休眠的特性，這種堅硬而厚實的果核壁所具有的不吸水性和不透氣性對珙桐種子的萌發(fā)起著明顯的抑制作用。雷濘菲等[20]研究珙桐種子休眠期間內(nèi)源激素的變化發(fā)現(xiàn)：隨著珙桐種子的萌發(fā)，內(nèi)源激素ABA、GA隨著培根的伸長而逐漸升高，ABA/GA變化顯著且珙桐的休眠與萌發(fā)可能有這兩種激素拮抗調(diào)節(jié)。Urszula Krasuska[21-22]等用NO和HCN處理深度休眠的蘋果胚發(fā)現(xiàn)：NO作為一種種子萌發(fā)調(diào)節(jié)激素能解除種子休眠機(jī)制，NO和HCN這兩種化學(xué)試劑能在蘋果胚中發(fā)生羰基化反應(yīng)，解除蘋果胚的休眠。

本研究發(fā)現(xiàn)珙桐帶胚乳的種胚或者去胚乳的種胚在WPM基本培養(yǎng)基上，無需添加任何激素，都能穩(wěn)定的萌發(fā)，帶胚乳的珙桐胚在WPM培養(yǎng)基上早期發(fā)育較好，它能夠吸收初期胚乳的營養(yǎng)，一段時間后，內(nèi)種胚開始萌發(fā)時（有綠點(diǎn)冒出），其胚乳開始凋亡，在此階段去除胚乳能促使種子進(jìn)入快速發(fā)育階段，扎根，長苗，打破原有的休眠期，培育出完整的幼苗。這與余阿梅[14]把種子放入河沙中層積一年，讓胚發(fā)育一年的效果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，采用珙桐去胚乳的胚接種入WPM基本培養(yǎng)基上，在前期胚能快速吸收培養(yǎng)基營養(yǎng)，快速萌發(fā)，但基礎(chǔ)薄弱，長到一定階段后，開始進(jìn)入緩慢發(fā)育時期。胚初始階段十分脆弱，易折斷，造成不完全發(fā)育，不便于操作，難以獲得完整的內(nèi)種胚，如果一旦不完整，其生長紊亂并開始誘導(dǎo)而產(chǎn)生愈傷組織。從培養(yǎng)結(jié)果來看，珙桐具有很強(qiáng)的氧化機(jī)制和次生代謝物分泌功能，在受到外界條件刺激或損傷后極易褐化。有研究發(fā)現(xiàn)，褐化與外植體體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)，酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧或色素的合成前體[23-24]。使用1/2MS+3 mg/LIBA+0.5 mg/L 6-BA+1 mg/LGA3激素培養(yǎng)基和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基只有少部分能使種胚膨脹變大，發(fā)育成愈傷組織，大部分表面逐漸氧化，最終被粘稠狀物質(zhì)包裹而最終死亡，可能因為是MS培養(yǎng)基中大量元素含量過多，導(dǎo)致其營養(yǎng)比例在不加激素或激素不合適時朝愈傷組織發(fā)展[25-27]。

4 結(jié) 論

從本研究得出：取飽滿、剛結(jié)出的果實，采取100%酒精灼燒滅菌，取帶胚乳的種胚，接種于不加激素的WPM基本培養(yǎng)基中，生長一定時間后去掉外胚乳，能夠完整、快速的生長。珙桐在組培培養(yǎng)基上褐化程度較高，導(dǎo)致珙桐組培成活率低，用根、莖、葉等培養(yǎng)愈傷組織較難。本研究提供的方法能迅速，高效率的得到珙桐苗，打破珙桐種子的自然休眠期，避免了組織培養(yǎng)中根、莖、葉等再生困難、生根率低成本高等一系列問題。

目前珙桐組培育苗技術(shù)可進(jìn)一步發(fā)展成熟，研究其氧化機(jī)制，降低褐化程度，調(diào)整培養(yǎng)基成分，改善培養(yǎng)條件將是今后珙桐組培育苗的重點(diǎn)研究方向。

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Study on rapid propagation technology of Davidia involucrata seed

WU Jun-chang, LI Meng, CAO Fu-xiang, WU Lin-shi, LIU Zhi-ming, DENG Piao-yun
(Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Davidia involucrataseeds have a dormancy period to germination and seedling survival of 1～2 years in natural conditions, so a long period of dormancy limits the reproductive ability ofDavidia involucrata. This study collectedDavidia involucrata’s seeds -just bear as materials, using embryo tissue culture technology to cultivate theDavidia involucrataseedlings.Research from the culture medium ingredient, sterilization, hormone proportion, culture conditions, etc, analysed the factors in fl uencing theDavidia involucrataseed germination and seedling growth. Results show that under suitable conditions, underyearlingDavidia involucrataseeds can skip dormancy directly develop into Plantlets. In this study, provided a theoretical basis for breaking theDavidia involucrataseed dormancy, realizing rapid seedling of the high ef fi ciency and low cost.

Davidia involucrate; tissue culture; seed dormancy

S792.99

A

1673-923X(2016)02-0066-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.02.012

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-03-30

國家林業(yè)公益行業(yè)項目：湘鄂石漠化地區(qū)常綠闊葉林恢復(fù)研究（201104016）

吳俊長，碩士研究生

曹福祥，教授，博士，博士生導(dǎo)師；E-mail：csfucao@163.com

吳俊長，李 萌，曹福祥，等. 珙桐種子快速繁殖技術(shù)的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2016, 36(2): 66-70, 95.

[本文編校：吳 彬]