斜投影和空間夾角判據(jù)結(jié)合紫外光譜分析滴眼液中苯扎氯銨

楊向妮，姚志湘*，粟 暉，劉 柳

(1.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

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斜投影和空間夾角判據(jù)結(jié)合紫外光譜分析滴眼液中苯扎氯銨

楊向妮1,2，姚志湘1,2*，粟 暉1,2，劉 柳1,2

(1.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

采用紫外光譜，將斜投影(OP)與空間夾角判據(jù)(SAC)相結(jié)合，通過十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)含量反映苯扎氯銨(BAC)含量的方式建立了一種快速檢測滴眼液中BAC的新方法。首先采用斜投影提取BAC混合物中1227的純信號，以提取的光譜信號與對應(yīng)濃度值進行最小二乘擬合，建立標準光譜矩陣；再通過高效液相色譜-紫外光譜聯(lián)用獲取滴眼液本底光譜矩陣；最后根據(jù)空間夾角判據(jù)測定滴眼液樣品中1227的含量，并以此反映BAC的含量。結(jié)果顯示：在1～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，斜投影提取的1227純信號與對應(yīng)濃度呈良好線性關(guān)系(r>0.999 6)，方法的檢測結(jié)果與高效液相色譜法接近，相對誤差不大于2.3%，相對標準偏差(RSD，n=6)不大于2.8%，回收率為99.6%～101.8%。該方法采用多波長紫外光譜直接定量BAC，無需復雜的樣品前處理，定量時間短，分析效率高，穩(wěn)健性好，可推廣應(yīng)用于其他領(lǐng)域。

斜投影；空間夾角判據(jù)；高效液相色譜-紫外光譜聯(lián)用；苯扎氯銨；滴眼液

苯扎氯銨(BAC)是滴眼液中一種常用的防腐劑，使用添加過量BAC的滴眼液會對眼內(nèi)細胞造成傷害[1]，即使其濃度低于0.001%，經(jīng)常使用或使用超過30 min以上也會引起角膜上皮細胞功能障礙[2]。

目前BAC的檢測方法主要為高效液相色譜(HPLC)法[3-6]，HPLC能有效測定BAC含量，但其色譜峰易拖尾，柱效難以滿足需求，分析時間長，溶劑消耗量大且需使用有毒溶劑；質(zhì)譜分析法[7]所用儀器昂貴、普及度小，且會破壞分析樣品。此外氣相色譜法[8]、紫外分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、毛細管電泳法[11-12]、伏安法[13]等方法在分析要求較高的情況下均受到一定限制。近年來，化學計量學方法的快速發(fā)展給復雜樣品分析帶來新的生機，空間夾角判據(jù)(Space angle criterion,SAC)作為一種新的化學計量學方法，因具有所用樣品數(shù)量少、預處理簡單、方法簡便、快速等優(yōu)點得到較多應(yīng)用。粟暉等[14]采用該方法成功分析了化妝品中對羥基苯甲酸酯的含量。然而，BAC是由3種正烷基取代基(C12，C14，C16)二甲基芐基氯化銨同系物組成的混合物，該方法不適用于分析物為混合物，無法得到目標組分純物質(zhì)信號的情況，并且直接用BAC定量常會因?qū)φ掌放c滴眼液產(chǎn)品中同系物組成不一致而對分析造成困擾。

因此，為克服此困擾、拓展空間夾角判據(jù)方法的普適性，本文提出用同系物十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)的含量反映BAC含量進行樣品中BAC的含量檢測，以斜投影(Oblique projection,OP)與空間夾角判據(jù)相結(jié)合的方式來改善方法局限性，首先采用斜投影[15]將感興趣組分(1227)純物質(zhì)信號從BAC混合物中提取出，再結(jié)合空間夾角判據(jù)定量滴眼液中1227，并以此反映BAC的含量。據(jù)此建立了一種快速檢測滴眼液中BAC含量的新方法。

1 方法原理及分析步驟

復雜化學體系(多變量體系)可由多個互不平行向量組成的空間(Mb)確定描述，每個向量代表體系中一個獨立的化學組分。斜投影系將Mb看成由“感興趣組分”向量(S)與除S外的其他組分構(gòu)成的相鄰子空間(H)所組成。根據(jù)空間中的線性變換關(guān)系，空間中存在投影變換，S與H互為核關(guān)系，其核關(guān)系建立的模型通過系列正交投影來實現(xiàn)，可描述S、H的非正交關(guān)系。其投影變換表達式為式(1)，其中ES|H稱為斜投影算子，PH為沿著子空間H到子空間S的投影算子，I為與PH維數(shù)相同的單位矩陣。通過計算ES|H建立模型，可將“感興趣組分”向量S從復雜體系y中以數(shù)學的方式分離提取出，即S=ES|H*y。

ES|H=S(STPH┴S)-1STPH┴,PH┴=I-PH=I-H(HTH)-1HT

(1)

空間夾角判據(jù)也將每一種化學純組分看作一個向量，復雜化學體系即是由多個向量構(gòu)成的空間。向量與空間存在夾角，當“感興趣組分”向量V在數(shù)據(jù)空間Ms中時，夾角為0，當“感興趣組分”向量V不在數(shù)據(jù)空間Ms中時，V與Ms存在固定夾角。由此作為判據(jù)，通過逐步扣減分析樣中V向量分析復雜體系中“感興趣組分”的含量值。詳見文獻[16]。

具體實施步驟如圖1所示。

圖1 方法流程圖Fig.1 Operating steps of the method

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20AT，島津公司)，紫外-可見分光光譜儀(Maya2000Pro，Ocean Optics)，電子分析天平(AR124CN，奧豪斯儀器有限公司)。乙腈(HPLC級)，冰乙酸、乙酸銨、三乙胺、甲醇(分析純)，苯扎氯銨(按C22H40ClN計,每1 mL含苯扎氯銨12.02 mg，含n-C12H25取代基同系物65.49%，n-C14H29取代基同系物34.09%)(HPLC級)，滴眼液7種(市售)。

2.2 實驗條件

高效液相色譜條件：色譜柱：ODS-SP92689 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；等度洗脫,流動相為0.02 mol/L醋酸銨(每升中含三乙胺10 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.5)-乙腈(10∶90)；流速：1 mL/min；檢測波長：262 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。

紫外光譜儀條件：波長范圍196.93～400.36 nm，光譜間隔0.46 nm，石英比色皿光程為1.0 cm，以二次蒸餾水為參比樣品，積分時間設(shè)為8 ms。

2.3 BAC標準品、滴眼液樣品的制備及數(shù)據(jù)獲取

精確移取0.5 mL 12.02 mg/mL的BAC(C12取代基65.49%，C14取代基34.09%。按C12計，為7 871.898 μg/mL)標準品于100 mL容量瓶中，以二次蒸餾水定容，得濃度為39.359 μg/mL的標準母液，并以二次蒸餾水配制濃度為1～20 μg/mL的標準溶液，取其紫外光譜數(shù)據(jù)，記為y。

根據(jù)市售7種滴眼液樣品特點用二次水對樣品進行不同倍數(shù)的稀釋，分別記為1﹟～7﹟樣品，另取與其中1種滴眼液同品牌不同批號的樣品同法稀釋，記為8#樣品，采集各樣品的紫外光譜，記為a。

將液相色譜儀與紫外光譜儀聯(lián)接，設(shè)置好儀器參數(shù)后獲取不同濃度BAC標準溶液、各滴眼液樣品的時間、波長、光強度三維數(shù)據(jù)Mb、Ms。

以高效液相色譜法為對比方法，取不同濃度BAC標準溶液進行液相色譜分析，以1227的峰面積(A)為定量標準繪制標準曲線；8份滴眼液樣品不經(jīng)稀釋過濾后直接進樣，取其與1227出峰時間一致時的峰面積，按外標法計算含量。

2.4 回收率與精密度實驗

選取1#，2#，3#樣品進行方法準確度驗證，取3份1#樣品加入濃度為6，8，10 μg/mL的BAC標準溶液，取2#和3#樣品各3份分別加入濃度為8，10，15 μg/mL的BAC標準溶液，采集其紫外光譜數(shù)據(jù)；選取1#和3#樣品分別重復采集其紫外光譜6次，計算方法的精密度。

圖2 1﹟樣品的三維譜圖Fig.2 Three-dimensional spectra of sample 1﹟

圖3 BAC標準溶液的液相色譜圖Fig.3 Chromatogram of BAC standard solution

3 結(jié)果與討論

3.1 BAC及滴眼液的本底矩陣建立

將獲得的BAC標準溶液、各滴眼液樣品的三維數(shù)據(jù)Mb、Ms導入Matlab計算平臺，并將光強度信號轉(zhuǎn)化為吸光度(如圖2)。于波長262 nm處繪制BAC的色譜圖，找出1227的色譜出峰時間段，查閱相關(guān)文獻并經(jīng)過實驗驗證1227的出峰時間段在8.31～9.02 min(如圖3)。扣除此段數(shù)據(jù)后，將其余部分加和作為BAC的本底數(shù)據(jù)矩陣H。同法獲取滴眼液樣品的本底數(shù)據(jù)矩陣H1，其中8﹟樣品不參與建立本底。根據(jù)二階差分值序列的折點[17]判斷H、H1的主成分數(shù)N、N1，分別應(yīng)用奇異值分解[USV]=svd[H]對光譜數(shù)據(jù)H、H1進行重構(gòu)，選取U中前N、N1列加和作為降維后的本底光譜數(shù)據(jù)H′、H1′。

3.2 采用斜投影方法提取純1227光譜建立標準光譜矩陣

選取 BAC標準溶液中1227液相色譜出峰響應(yīng)值最高時間點8.38 min(如圖3)的全波長光譜信號作為純1227數(shù)據(jù)矩陣S。將不同濃度BAC的紫外光譜y、BAC的本底數(shù)據(jù)矩陣H′及S代入編寫的斜投影程序，計算得到純1227在不同濃度的全波長光譜數(shù)據(jù)；將其與對應(yīng)的系列濃度進行最小二乘擬合得到標準光譜矩陣v，矩陣v由擬合系數(shù)列與殘差列組成。其擬合結(jié)果顯示：在1～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，斜投影提取的1227純信號與對應(yīng)濃度呈良好的線性關(guān)系(r>0.999 6)，表明通過斜投影方法可以準確提取混合物中單一物質(zhì)的光譜信號。

3.3 采用空間夾角判據(jù)計算滴眼液中1227含量

將任一線性范圍內(nèi)的濃度值x1代入公式y(tǒng)i=aix+bi，得到此濃度下純1227的光譜向量V；將滴眼液樣品光譜a、滴眼液樣品本底數(shù)據(jù)矩陣H′1及V代入編寫的向量扣減程序，計算滴眼液樣品中1227濃度(1227濃度值反映BAC濃度值)，并以高效液相色譜法為對比方法計算滴眼液中1227的濃度,兩種方法的計算見表1。

表1 不同樣本中1227的濃度及相對誤差分析

Table 1 Concentration and relative error of benzalkonium chloride in different samples

SampleResultofobliqueprojectionwithspaceanglecriterionmethod(μg/mL)ResultofHPLC(μg/mL)Relativeerror(%)1﹟8548520232﹟00-?3﹟102910260294﹟00-5﹟00-6﹟339347237﹟2422430418﹟796795013

*no detected

經(jīng)比較，兩種方法的測定結(jié)果接近，其相對誤差不大于2.3%。其中2#,4#,5#樣品中不含苯扎氯銨，兩種方法的1227計算結(jié)果均為0，說明方法能準確預測待測組分濃度。由8#樣品的比較結(jié)果可以看出，對于不參與建立本底的滴眼液樣品，方法計算結(jié)果同樣準確。此外，本方法采用多波長紫外光譜直接定量苯扎氯銨，操作簡單，無需復雜的樣品前處理過程，經(jīng)建庫后無需花費大量時間進行液相色譜分析，分析時間大大縮短，分析效率得到較大提高;通過軟件方法實現(xiàn)光譜信號提取以及定量分析，降低了分析成本、儀器及試劑損耗；對于背景干擾嚴重的復雜體系，方法仍能準確預測，抗干擾能力強，可辨識程度高，穩(wěn)健性好。

3.4 回收率與精密度

按照“3.3”所述步驟計算BAC在1#,2#,3#樣品中的添加量，并與實際添加量進行比較，進一步驗證方法準確度，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明：斜投影結(jié)合空間夾角判據(jù)的測定結(jié)果與實際添加量接近，方法可以準確計算BAC的添加量，回收率為99.6%～101.8%。1#和3#樣品重復測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)分別為2.8%和0.54%，表明方法具有較好的精密度。

表2 回收率實驗結(jié)果

Table 2 Experimental results of recovery

SampleConcentrationof1227(μg/mL)Added(μg/mL)Resultofobliqueprojectionwithspaceanglecriterionmethod(μg/mL)Recovery(%)1#8526，8，101463，1661，18481018，1011，9962#08，10，15799，1001，1504999，1001，10033#10268，10，151825，2025，2525999，999，999

4 結(jié) 論

方法以十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)代替苯扎氯銨進行含量測定，不僅簡化了計算，并可避免由于對照品與滴眼液產(chǎn)品中同系物組成不一致而使得分析結(jié)果不準確甚至無法分析的窘境。采用斜投影與空間夾角判據(jù)相結(jié)合打破了空間夾角判據(jù)的局限，拓展了方法的普適性，即使得不到待測組分的純物質(zhì)也可對其進行準確定量分析。斜投影純信號分析方法可有效提取混合物中1227純光譜數(shù)據(jù)，提取的1227光譜與對應(yīng)濃度間呈良好的線性關(guān)系(r>0.999 6)。采用斜投影結(jié)合子空間-向量扣減的方法可以準確測定滴眼液中1227的含量，與液相色譜測定結(jié)果比較，相對誤差不大于2.3%。本方法分析速度快，準確可靠，操作簡單，節(jié)約分析成本和分析時間，使用樣本數(shù)量少且樣品無需復雜的前處理，為滴眼液中防腐劑的含量測定提供了一種有效檢測手段，可推廣應(yīng)用于其他領(lǐng)域。

[1] Pauly A,Meloni M,Brignole B F,Warnet J M,Baudouin C.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,2009,50(4):1644-1652.[2] Cha S H,Lee J S,Oum B S,Kim C D.Clin.Exp.Ophthalmol.,2004,32:180-184.

[3] Shen Y,Xu S J,Wang S C,Tu J S.J.ZhejiangUniv.Sci.B,2009,10(12):877-882.

[4] Chen Q F,Wang X L.Chin.J.Pharm.(陳秋芬,王小琳.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志),2005,36(9):564-566.

[5] Ding X J,Che Y P,Zhao H Y,Liu P Y.J.Instrum.Anal.(丁曉靜,車宜平,趙海燕,劉芃巖.分析測試學報),2006,25(6):63-66.

[6] Liu W W,Zhang J,Qiao J Q,Lian H Z.RockMiner.Anal.(劉雯雯,張瑾,喬俊琴,練鴻振.巖礦測試) ，2011,30(6):677-682.

[7] Yang C D,Song L H,Zhang Y.J.Instrum.Anal.(楊成對,宋莉暉,張焱.分析測試學報)，2008,27(10):1118-1120.

[8] Hou R X,Wu Q.Chin.J.HealthLab.Technol.(侯瑞霞,吳青.中國衛(wèi)生檢驗雜志),2011,21(4):865-868.

[9] Zhou M,Duan G L,Liu Z.Chin.J.Environ.Occup.Med.(周密,段更利,劉振.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學)，2002,19(5):308-310.

[10] Mohammad A,Siddiq A,Mobin R,Desoky G E E.J.Ind.Eng.Chem.,2014,20:1697-1702.

[11] Villar E M A,Etter S F,Thiel M A,Hauser P C.Anal.Chim.Acta,2006,561:133-137.

[12] Blancoa M C P,Martinez Y M,Falcó P C.J.Chromatogr.A,2013,1297:226-230.

[13] Wang L H,Tsai S J.Anal.Chim.Acta,2001,441:107-116.

[14] Su H,Fang F,Yao Z X,Chen C,Liu L,Ge J.Comput.Appl.Chem.(粟暉,方鳳,姚志湘,陳成,劉柳,葛軍.計算機與應(yīng)用化學)，2014,31(5):611-614.

[15] Ge J,Yao Z X,Su H,Liu L.ChinaPatent(葛軍,姚志湘,粟暉,劉柳.中國專利)，201210523883.[2013-04-03].[16] Fang F,Su H,Yao Z X,Chen C,Liang X M,Huang L M.J.Instrum.Anal.(方鳳,粟暉,姚志湘,陳成,梁曉梅,黃麗梅.分析測試學報),2013,32(6):732-736.

[17] Yao Z X,Jian H L,Liu H B.J.SouthChinaUniv.Technol.：Nat.Sci.Ed.(姚志湘,蹇華麗,劉煥彬.華南理工大學學報:自然科學版) ，2007,35(1):123-127.

Rapid Determination of Benzalkonium Chloride in Eye Drops with Ultraviolet Spectrum Based on Oblique Projection and Space Angle Criterion

YANG Xiang-ni1,2,YAO Zhi-xiang1,2*,SU Hui1,2,LIU Liu1,2

(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006, China;2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources,Liuzhou 545006,China)

A rapid new method for the determination of benzalkonium chloride (BAC) in eye drops complex system was developed with ultraviolet spectrum based on oblique projection (OP) and space angle criterion (SAC),in which the content of BAC is based on content of dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride (1227) .By treatment with oblique projection,the pure spectrum of dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride was obtained.The standard spectral matrix was set up by the least squares fitting the spectrum with the corresponding concentration.And then the background spectral matrix was obtained by using high performance liquid chromatography-ultraviolet spectrum(HPLC-UV).After that the contents of 1227 in different kinds of eye drops were calculated by using space angle criterion,and the content of BAC was obtained.The results indicated that the method exhibited a good linearity (r>0.999 6) for BAC in the range of 1-20 μg/mL.The determination results of this method is close to that of HPLC method,and the relative error is not more than 2.3%.The recoveries were obtained between 99.6% and 101.8%,with RSDs not more than 2.8%.The content of BAC could be directly obtained with multiple wavelength ultraviolet spectrum without complicated sample preparation,and the method has the advantages of short quantitative time,high analysis efficiency,good robustness,and could provide a feasible scheme for the detection of analyte of interest in other complex system.Key words：oblique projection;space angle criterion;high performance liquid chromatography-ultraviolet spectrum(HPLC-UV);benzalkonium chloride;eye drops

2015-08-21；

2015-09-17

廣西科技計劃項目(桂科攻1355010-15)；柳州市科技計劃項目(2015J030201)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.014

O657.3;S482.294

A

1004-4957(2016)03-0337-05

*通訊作者：姚志湘，博士，教授，研究方向：過程分析技術(shù)，Tel：0772-2686670，E-mail：zxyao@gxut.edu.cn