地骨皮蒽醌對(duì)高脂血癥大鼠膽汁酸代謝機(jī)理研究

李惠，王衛(wèi)杰，何棟

（開封醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，河南開封 475000）

地骨皮蒽醌對(duì)高脂血癥大鼠膽汁酸代謝機(jī)理研究

李惠，王衛(wèi)杰，何棟

（開封醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，河南開封 475000）

試驗(yàn)采用SD大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，通過以高脂飼料誘導(dǎo)其高脂血癥地鼠作為動(dòng)物模型，研究單方中藥地骨皮中蒽醌成分對(duì)高脂血癥SD大鼠膽汁酸代謝的調(diào)節(jié)作用，闡明地骨皮對(duì)調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠膽汁酸的有效成分的影響及其機(jī)理。雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只，喂飼普通飼料）和模型組（50只，喂飼高脂飼料）。將造模成功大鼠40只隨機(jī)分為辛伐他汀組、地骨皮蒽醌低、高劑量組，每組10只。大鼠單籠單只養(yǎng)殖，在0、1、2月，各收集4 d糞便標(biāo)本，以乙醇-KOH抽提，以酶法測定膽汁酸及膽固醇濃度。試驗(yàn)前大鼠糞便膽汁酸各組之間無顯著差異（P＞0.05）；藥物干預(yù)后，蒽醌高、低劑量組與模型組差異極顯著（P＜0.01），辛伐他汀組與模型組比無顯著性差異（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，和模型組比較，地骨皮總蒽醌顯著升高高脂大鼠糞便中的膽汁酸水平，并且膽汁酸升高水平與地骨皮總蒽醌的給藥劑量呈正相關(guān)。表明地骨皮總蒽醌的降脂機(jī)理可能與增加膽汁酸的外排有關(guān)。

地骨皮；蒽醌；大鼠；高脂血癥；膽汁酸代謝

高脂血癥（HLP）是代謝性疾病中一種常見而多發(fā)的重要病癥，與心腦血管疾病、糖尿病等關(guān)系密切。臨床常用西藥降血脂藥如辛伐他汀、普伐他汀等降脂作用療效肯定，但有橫紋肌溶解、肝功能損傷等副作用，并且療效的持續(xù)性、長期服用的安全性一直是治療的難題。近年來有大量研究表明，中草藥可從不同環(huán)節(jié)干預(yù)高脂血癥，且效果明顯，因此，中草藥復(fù)方制劑和中草藥單味藥及其提取物的降脂作用將越來越受到重視。

地骨皮（Cortex Lycii）為茄科植物枸杞或?qū)幭蔫坭降母稍锔?。味甘、性寒，具有涼血除蒸、清肺降火之功效。現(xiàn)代藥物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮主要化學(xué)成分為生物堿類、蒽醌類、有機(jī)酸類、肽類、苷類及其他化合物，并具有多種藥理活性[1-3]。地骨皮具有降血壓、降血糖等多種作用，近年來的研究表明，地骨皮還具有降脂的功效，并且在臨床治療中得到了廣泛的證實(shí)[4-7]。蒽醌類成分是中草藥降脂的主要活性成分之一，蒽醌類成分大多具有導(dǎo)瀉功能，能減少腸道對(duì)膽固醇等的吸收及增加其排泄。通過減少外源脂質(zhì)的吸收及增加排泄而達(dá)到降低血脂的目的。

本試驗(yàn)采用SD大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，通過以高脂飼料誘導(dǎo)的高脂血癥地鼠作為動(dòng)物模型，研究地骨皮中蒽醌成分對(duì)高脂血癥SD大鼠膽汁酸代謝的調(diào)節(jié)作用，闡明地骨皮對(duì)調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠膽汁酸的代謝及其機(jī)理。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SD雄性大鼠60只，體重為185.05±4.48 g。動(dòng)物到達(dá)后單只單籠飼養(yǎng)，飼喂基礎(chǔ)飼料（試驗(yàn)動(dòng)物全價(jià)營養(yǎng)飼料，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），自由飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度為22～24℃，空氣相對(duì)濕度控制在50%～65%，室內(nèi)照明，12 h燈照、12 h黑暗。

1.2 飼料添加劑

膽鹽、膽固醇、蛋黃粉購自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，伊利全脂奶粉，市售豬油。

1.3 主要試劑

高密度脂蛋白測定試劑盒、低密度脂蛋白測定試劑盒、總甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；膽汁酸及檢測試劑盒購自威特曼生物科技有限公司。

1.4 飼料制備

全價(jià)飼料營養(yǎng)水平見表1。

表1 全價(jià)飼料營養(yǎng)水平

以試驗(yàn)動(dòng)物全價(jià)飼料為基礎(chǔ)飼料，配成含基礎(chǔ)飼料88.9%、膽固醇1%、膽鹽0.1%、蛋黃粉5%、全脂奶粉5%、豬油10%的高脂飼料。

2 試驗(yàn)方法

2.1 高脂大鼠模型構(gòu)建

雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為對(duì)照組（10只，飼喂普通飼料）和模型組（50只，飼喂高脂飼料）。每兩周斷尾采血1次，分離血清并檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平（按試劑盒說明書檢測）。4周后按照林征等造模標(biāo)準(zhǔn)，取成功高脂模型進(jìn)行試驗(yàn)[8-9]。

2.2 分組及藥品干預(yù)

將造模成功大鼠50只隨機(jī)分為辛伐他汀組、地骨皮蒽醌低、高劑量組，每組10只。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組灌喂相應(yīng)體積蒸餾水；辛伐他汀組（SIM）給藥劑量為4 mg·kg-1·d-1；地骨皮蒽醌低、高劑量組給藥劑量分別為40、20 mg·kg-1·d-1，用生理鹽水2 mL溶解，各組每日灌胃1次。

等效劑量計(jì)算：根據(jù)徐叔云教授《藥理試驗(yàn)方法學(xué)》，人與大鼠等效劑量系數(shù)為6.3。辛伐他汀人體最大用量40 mg·d-1，則大鼠用量為40÷60×6.3= 4 mg·kg-1，地骨皮人體最大用量為30 g，總蒽醌含量約為1%，則大鼠總蒽醌用量為30÷60×1%×6.3= 30 mg·kg-1

2.3 膽汁酸檢測

大鼠單籠單只養(yǎng)殖，在0、1、2月，各收集4d糞便標(biāo)本，干燥、粉碎，以乙醇-KOH抽提予酶法測定膽汁酸及膽固醇濃度，觀察地骨皮蒽醌對(duì)高脂血地鼠糞便膽汁酸排泄的影響。

每天觀察動(dòng)物的活動(dòng)、飲食情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)有無異常生病、受傷或死亡等情況，同時(shí)注意大鼠皮膚、被毛、黏膜、眼睛與呼吸、神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)功能及行為方面的改變。稱量體重每月稱取體重一次，并作記錄。

在0、1、2月，各收集3 d糞便標(biāo)本，保存于-20℃。真空冷凍干燥24 h取出后粉碎，混勻，準(zhǔn)確稱取0.5 g干糞，用10 mL 95%乙醇醇-KOH抽提2次，取上清液5 mL，用威特曼總膽汁酸檢測試劑盒（速率法）進(jìn)行檢測。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0軟件采用One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行Duncan's多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠體重變化

試驗(yàn)各組大鼠體重變化情況見表2。

在整個(gè)試驗(yàn)過程中未見動(dòng)物異常生病、受傷或死亡，各組大鼠活動(dòng)、飲食、飲水情況良好，無明顯變化。低、高劑量組大鼠糞便顆粒有變軟，但無稀溏情況。由表2可知，本試驗(yàn)中，試驗(yàn)前各組大鼠體重之間無顯著差異（P＞0.05）；試驗(yàn)中期，模型組大鼠體重組間無顯著性差異（P＞0.05），與對(duì)照組相比均明顯升高，差異極顯著（P＜0.01）；試驗(yàn)?zāi)ㄋ幬锔深A(yù)后），各劑量組與模型組比差異顯著（P＜0.05），蒽醌高劑量組與模型組差異極顯著（P＜0.01）。

3.2 大鼠糞便膽汁酸的變化

試驗(yàn)各組大鼠糞便膽汁酸變化情況見表3。

表2 試驗(yàn)各組大鼠體重變化情況g

表3 試驗(yàn)各組大鼠糞便膽汁酸變化情況μmol·L-1

由表3可知，試驗(yàn)前大鼠糞便膽汁酸各組之間無顯著差異（P＞0.05）；試驗(yàn)中期（建模成功），模型組大鼠組間無顯著性差異（P＞0.05），與對(duì)照組相比均有升高，且差異極顯著（P＜0.01）；試驗(yàn)?zāi)ㄋ幬锔深A(yù)后），蒽醌高、低劑量組與模型組差異極顯著（P＜0.01），辛伐他汀組與模型組比無顯著性差異（P＞0.05）。

4 討論

高脂飲食可增加糞便中膽汁酸含量，本試驗(yàn)中，對(duì)照組大鼠糞便中膽汁酸的排量一直無明顯變化。模型組大鼠在高脂飼養(yǎng)以后，糞便中膽汁酸呈上升趨勢。與0月時(shí)比較，地骨皮蒽醌高低劑量組2月時(shí)糞便膽汁酸含量分別增加250%和238%，顯著高于高脂模型，和模型組比較，地骨皮總蒽醌顯著升高高脂大鼠糞便中的膽汁酸水平，并且膽汁酸升高水平與地骨皮總蒽醌的給藥劑量呈正相關(guān)。表明地骨皮總蒽醌的降脂機(jī)理可能與增加膽汁酸的外排有關(guān)。

正常人膽汁中的膽汁酸按結(jié)構(gòu)可分為兩大類，一類為游離型膽汁酸，包括膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和少量的石膽酸；另一類是上述游離膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合的產(chǎn)物稱結(jié)合型膽汁酸，主要包括甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸，牛磺膽酸及?；蛆Z脫氧膽酸等。一般結(jié)合型膽汁酸水溶性比游離型大，PK降低，這種結(jié)合使膽汁酸鹽更穩(wěn)定，在酸或Ca2+存在時(shí)不易沉淀出來。隨膽汁流入腸腔，初級(jí)膽汁酸在協(xié)助脂類物質(zhì)消化吸收的同時(shí)，在小腸下段及大腸受腸道細(xì)菌作用，一部分被水解、脫去7α羥基，轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭?jí)膽汁酸。

腸道中的各種膽汁酸平均有95%被腸壁重吸收，其余的隨糞便排出。膽汁酸的重吸收主要有兩種方式：結(jié)合型膽汁酸在回腸部位主動(dòng)重吸收；游離型膽汁酸在小腸各部及大腸被動(dòng)重吸收。膽汁酸的重吸收主要依靠主動(dòng)重吸收方式。石膽酸主要以游離型存在，故大部分不被吸收而排出。正常人每日從糞便排出的膽汁酸約0.4～0.6 g。

膽汁酸腸肝循環(huán)的生理意義在于使有限的膽汁酸重復(fù)利用，促進(jìn)脂類的消化與吸收。正常人體肝臟內(nèi)膽汁酸≤3～5 g，而維持脂類物質(zhì)消化吸收，需要肝臟每天合成16～32 g，依靠膽汁酸的腸肝循環(huán)可彌補(bǔ)膽汁酸的合成不足。每次飯后可以進(jìn)行2～4次腸肝循環(huán)，使有限的膽汁酸能夠發(fā)揮最大限度的乳化作用，以維持脂類食物消化吸收的正常進(jìn)行。而地骨皮總蒽醌通過增加膽汁酸的外排，影響膽汁酸的肝腸循環(huán)，影響脂類物質(zhì)的消化和吸收，從而達(dá)到降脂的作用。唐大軒等研究表明，大黃蒽醌可以增加小鼠胃內(nèi)容物以及小腸和結(jié)腸內(nèi)容物；并可通過刺激胃腸道黏膜而增加蛋白質(zhì)的分泌[6]。魏鳳鈴等研究表明，大黃總蒽醌有促進(jìn)腸蠕動(dòng)和致瀉作用。地骨皮總蒽醌增加膽汁酸外排的機(jī)理可能與以上兩點(diǎn)有關(guān)[10-11]。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)通過以高脂飼料誘導(dǎo)的高脂血癥地鼠作為動(dòng)物模型，研究單方中藥地骨皮中蒽醌成分對(duì)高脂血癥SD大鼠膽汁酸代謝的調(diào)節(jié)作用，闡明地骨皮總蒽醌顯著升高高脂大鼠糞便中的膽汁酸水平，并且膽汁酸升高水平與地骨皮總蒽醌的給藥劑量呈正相關(guān)。表明地骨皮總蒽醌的降脂機(jī)理可能與增加膽汁酸的外排有關(guān)。

[1]寧娜,韓建軍.地骨皮的化學(xué)成分與藥理作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2010,25（3）:172-176.

[2]魏秀麗,梁敬鈺.地骨皮化學(xué)成分的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,33（7）:580-581.

[3]張秀云,周鳳琴.地骨皮藥理及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣州化工,2012,40（7）:48-49,59.

[4]孟令杰,劉百聯(lián),張英,等.地骨皮化學(xué)成分研究[J].中草藥, 2014,45（15）:2 139-2 142.

[5]李行諾,楚楚,毛慧瓊,等.地骨皮化學(xué)成分研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2012（9）:805-808.

[6]周潔,朱偉.地骨皮的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī), 2008,24（2）:47-48.

[7]鄭海群.地骨皮降血糖藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國處方藥, 2016,14（3）:13-14.

[8]陳美娟,邱服斌,張海杰,等.建立雄性SD大鼠高脂血癥模型研究[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,11（11）:1 113-1 115.

[9]林征,吳小南,汪家梨.雄性SD大鼠高脂血癥模型飼料配方的實(shí)驗(yàn)研究[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2007,13（6）:56-57.

[10]唐大軒,譚正懷,梁媛媛,等.大黃蒽醌致瀉作用及其機(jī)理的初步研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2007,18（6）:1 312-1 314.

[11]魏鳳玲,常明.大黃中結(jié)合蒽醌的致瀉作用及藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,1999,5（6）:53-55.

Study on the Bile Acid Metabolism Mechanism of Anthraquinone Cortex Lycii in Hyperlipidemia Rats

LI Hui,WANG Weijie,HE Dong

（Institute of Medical Sciences in Kaifeng,Kaifeng 475000,Henan China）

This experiment used SD rats as experimental animal to clarify the mechanism of regulation of effective components in Cortex Lycii on bile acid mechanism with hyperlipidemia rat.The hyperlipidemia hamster induced by high fat diet as an animal model to study the effect of anthraquinone component of Cortex Lycii on hyperlipidemia SD rats in terms of bile acid metabolism.Adaptive feeding of male SD rats after 1 weeks,the rats were randomly divided into normal control group(10 rats,fed normal diet)and model group(50 rats fed with high fat diet).40 rats were randomly divided into simvastatin group,Cortex Lycii anthraquinone in low and high dose groups,10 rats in each group. Rats with single cage were fed only,in the 4 days of 0,January,February to collect fecal samples,determining the bile acids and cholesterol concentration in ethanol-KOH extract by enzyme method.Before the experiment the rats were no significant difference of fecal bile acids(P＞0.05);after drug intervention,anthraquinone high,low dose groups and model group were significant differences(P＜0.01),simvastatin group compared with the model group had no signifi-cant difference(P＞0.05).Compared with the model group,the total anthraquinone of Cortex Lycii significantly increased bile acid levels in the feces of hyperlipidemic rats and the bile acid level and total anthraquinone of Cortex Lycii dosage was positively correlated.It was described the possible lipid-lowering mechanismof totalanthraquinone of Cortex Lyciiandincreasedthe effluxof bileacid.

Cortex Lycii;anthraquinone;rat;hyperlipidemia;bile acid metabolism

R282；S865.1+2

A

1001-0084（2016）11-0040-04

2016-10-25

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（122102310008）

李惠（1985-），女，河南開封人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)科研研究。