蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠CGRP、ET-1的影響

李朝霞 歐陽(yáng)俊搖 王雅麗 趙 暉 沈 素 王麗麗 李 任

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京，100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院,北京，100050)

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實(shí)驗(yàn)研究

蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠CGRP、ET-1的影響

李朝霞1歐陽(yáng)俊搖1王雅麗1趙 暉1沈 素2王麗麗2李 任2

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京，100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院,北京，100050)

目的:探討蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響。方法:SD大鼠84只,雌雄各半,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、蛭丹化瘀組方3個(gè)劑量(33、16.5、8.25 g/kg)。大鼠氣管內(nèi)滴注LPS復(fù)制急性肺損傷大鼠模型,稱(chēng)重法檢測(cè)大鼠肺含水量,放免法檢測(cè)各組大鼠血漿ET、CGRP、TNF-α的變化。結(jié)果:模型組大鼠肺含水量較正常組明顯升高(P<0.01),蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg)(P<0.01、P<0.05)以及陽(yáng)性藥地塞米松(P<0.01)可降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠的肺含水量;與正常組比較,模型組大鼠血漿中內(nèi)皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)明顯增高(P<0.01);蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)和陽(yáng)性藥地塞米松可明顯降低大鼠血漿ET含量,差異較模型組明顯(P<0.01);蛭丹化瘀組方33 g/kg可明顯增加血漿CGRP含量;與正常組比較,模型組大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)明顯增高(P<0.01);陽(yáng)性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg)均可明顯降低大鼠血漿TNF-α含量(P<0.01)。結(jié)論:蛭丹化瘀組方方通過(guò)升高內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠CGRP的含量,降低ET-1及TNF-α含量發(fā)揮對(duì)肺損傷大鼠的保護(hù)作用。

蛭丹化瘀組方;肺損傷;降鈣素基因相關(guān)肽;內(nèi)皮素-1

急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后,出現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,造成彌散性肺間質(zhì)及肺泡水腫而導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全癥[1]。ALI時(shí)各種肺內(nèi)外因素可引起多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)的釋放,引發(fā)肺內(nèi)過(guò)度、失控的炎性反應(yīng),形成惡性循環(huán),加重機(jī)體損傷[2]。蛭丹化瘀組方由制水蛭、牡丹皮、當(dāng)歸、赤芍、雞血藤、黃芪、川芎組成,具有益氣活血的功效,臨床上多用于治療治療小兒支原體感染及病毒性肺炎[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI的方法,觀察蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺含水量的影響,并通過(guò)檢測(cè)血漿降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)皮素-1(ET-1)腫瘤壞死因子(TNF-α)的變化,研究蛭丹化瘀組方方對(duì)ALI大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SD大鼠,SPF級(jí),雌雄各半,體質(zhì)重80～100 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品與試劑 蛭丹化瘀組方由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、雞血藤、水蛭、牡丹皮組成,經(jīng)水提醇沉工藝制成組方顆粒劑的流浸膏，生藥含量為4.85 g/mL,由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥劑教研室制備。醋酸地塞米松片:天津力生制藥股份有限公司產(chǎn)品,批號(hào):140511。脂多糖,由Sigma公司提供,貨號(hào)L2880。大鼠ET-1、CGRP、TNF-α放免檢測(cè)試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備、分組及給藥 參考文獻(xiàn)方法制備ALI大鼠模型[5]SD大鼠隨機(jī)分成6組,即對(duì)照組、模型組、蛭丹化瘀組方33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松0.5 mg/kg)。除對(duì)照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水外,其他各組均灌胃給與相應(yīng)藥物,1次/d,連續(xù)給藥4 d。第5次給藥后1 h,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉,仰臥位固定,沿頸部正中線切開(kāi)皮膚,暴露氣管,脂多糖(LPS)按7.5 mg/kg劑量,0.2 mL/100 g給藥容積于氣管內(nèi)緩慢滴入,縫合創(chuàng)口。造模19 h后,大鼠麻醉,取材。

1.3.2 血漿TNF-α、ET、CGRP檢測(cè)腹主動(dòng)脈取血,制備血漿-80 ℃凍存?zhèn)溆?放免法檢測(cè)血漿TNF-α、ET、CGRP,由北京華英生物技術(shù)研究所檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 10.0進(jìn)行單因素方差分析,LSD檢驗(yàn)比較2組間差異。

2 結(jié)果

2.1 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素致肺損傷大鼠肺含水量的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。與正常組比較,模型組大鼠肺含水量明顯升高(P<0.01);陽(yáng)性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33、16.5 g/kg)組可明顯降低大鼠肺含水量。

表1 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺指數(shù)及肺含水量的影響(±s)

表1 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺指數(shù)及肺含水量的影響(±s)

注:與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)肺含水量(%)對(duì)照組-1480.18±0.90**模型組-1480.99±0.78蛭丹化瘀組方組331479.65±0.55**蛭丹化瘀組方組16.51480.31±0.70*蛭丹化瘀組方組8.251480.62±0.59地塞米松組0.00051479.23±1.45**

2.2 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿內(nèi)皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)的影響 與正常組比較,模型組大鼠內(nèi)皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)明顯增高(P<0.01);蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)和陽(yáng)性藥地塞米松可明顯降低大鼠血漿ET含量,差異較模型組明顯(P<0.05);蛭丹化瘀組方33 g/kg可明顯增加血漿CGRP含量。

表2 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿ET、CGRP的影響(±s)

表2 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿ET、CGRP的影響(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05，**P<0.01。

組別只數(shù)劑量(g/kg)ET(pg/mL)CGRP(pg/mL)正常9-60.38±6.95**75.92±16.24**模型9-110.75±20.42103.70±16.35地塞米松組120.000578.14±29.30**97.90±18.73蛭丹化瘀組方組1133110.87±23.86130.62±13.82**蛭丹化瘀組方組1116.579.84±42.05**106.96±18.55蛭丹化瘀組方組128.2564.98±14.19**91.17±24.34

2.3 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響 與正常組比較,模型組大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)明顯增高(P<0.01);陽(yáng)性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg)均可降低大鼠血漿TNF-α含量,與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿TNF-α的影響(±s)

表3 蛭丹化瘀組方對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷大鼠血漿TNF-α的影響(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05，**P<0.01。

組別只數(shù)劑量(g/kg)TNF-α(pg/mL)正常9-60.81±6.60**模型9-89.67±8.13地塞米松組120.000566.41±9.65**蛭丹化瘀組方組113372.74±8.09**蛭丹化瘀組方組1116.565.58±9.13**蛭丹化瘀組方組128.2562.41±7.35**

3 討論

ALl以進(jìn)行性呼吸困難和難以糾正的低氧血癥為主要表現(xiàn)的肺部繼發(fā)性損傷[6],嚴(yán)重的ALI在臨床上也被稱(chēng)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。由于肺微血管通透性增高,肺內(nèi)液體滲出與吸收動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞,大量富含蛋白質(zhì)的液體滲入組織間隙,因此肺水腫是其主要的病理表現(xiàn)[7]。本研究結(jié)果表明,LPS致ALI大鼠肺含水量明顯增高,經(jīng)蛭丹化瘀組方33、16.5 g/kg或地塞米松治療后,大鼠肺含水量明顯降低,提示蛭丹化瘀組方可有效抑制肺損傷時(shí)肺微血管通透性增加,改善肺水腫。

內(nèi)皮素(ET)是目前已知的最強(qiáng)的血管收縮因子,其增高可引起肺血管、支氣管痙攣和毛細(xì)血管通透性增加,并通過(guò)刺激肺部花生四烯酸合成與釋放,誘導(dǎo)氧自由基生成,激活致炎因子的表達(dá),損傷肺組織[8]。研究表明,ETR拮抗劑、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等可下調(diào)ET-1的合成和分泌,通過(guò)抑制其促炎、縮血管、抑制肺泡液體清除能力等環(huán)節(jié),減輕肺組織炎性損傷,改善肺血流動(dòng)力學(xué)、呼吸力學(xué)指標(biāo),減輕肺水腫,改善通氣換氣功能[9]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種血管活性多肽,是迄今為止在人和哺乳動(dòng)物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì),其釋放受內(nèi)毒素、前列腺素、緩激肽等炎性因子和遞質(zhì)的調(diào)節(jié),具有擴(kuò)張血管、降低動(dòng)脈血壓的作用。在病理狀態(tài)下CGRP的分秘和釋放能夠緩解缺氧所致的肺血管收縮。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血漿CGRP、ET-1含量較正常組明顯升高,蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)以及陽(yáng)性藥地塞米松可降低ALI大鼠血漿ET-1,蛭丹化瘀組方33 g/kg還可明顯增高ALI大鼠血漿CGRP,表明蛭丹化瘀組方既可抑制ET-1生成及釋放,又可促進(jìn)血漿中CGRP的合成,從而減輕肺血管、支氣管痙攣,降低毛細(xì)血管通透性,減經(jīng)肺損傷。

目前認(rèn)為,炎性反應(yīng)是ALI/ARDS發(fā)生的主要機(jī)制[7],研究發(fā)現(xiàn)[11]注射LPS 6 h后,動(dòng)物血清TNF-α含量就明顯升高。TNF-α作為啟動(dòng)炎性反應(yīng)瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)的促炎遞質(zhì),能誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活化及中性粒細(xì)胞脫顆粒釋放氧自由基等遞質(zhì),引起白細(xì)胞遷移,損害肺泡表面活性物質(zhì)系統(tǒng)[10]。本次研究結(jié)果顯示,蛭丹化瘀組方在減輕肺含水量的同時(shí),可明顯降低ALI大鼠血漿TNF-α含量。

綜上,本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛭丹化瘀組方對(duì)LPS致ALI具有一定的改善作用,其初步的作用機(jī)制可能與其促進(jìn)CGRP的合成與釋放,抑制ET-1的生成,減輕肺水腫,并通過(guò)抑制TNF-α的分泌,減輕致炎因子介導(dǎo)的炎性損傷。從而起到防治模型大鼠ALI的作用。

[1]郭爭(zhēng)鳴,陳懿,劉惠君,等.金納多對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷保護(hù)作用機(jī)制的初步研究[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2009,29(4):277-283.

[2]高冬娜,張彧.急性肺損傷研究進(jìn)展[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2008,28(1):72-76.

[3]杭敏,侯安存,王新佳.蛭丹化瘀口服液治療小兒病毒性肺炎50例[J].中醫(yī)雜志,2006,47(8):615.

[4]李黎,馬少杰,劉曉紅,等.蛭丹化瘀口服液治療耐藥肺炎支原體肺炎的療效[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2010,25(16):1264-1265,1267.

[5]Mikawa K,Nishina K,Takao Y,et al.ONO-1714,a nitric oxide synthase inhibitor，attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits[J].Anesth Analg，2003,97(6):1751-5.

[6]段立彬,何先弟.細(xì)胞因子與急性肺損傷的關(guān)系[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,35(2):208-210.

[7]劉新華.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè),2014(1):92-93.

[9]蔡闖,徐軍,鐘南山.內(nèi)皮素-1與急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2010,35(5):595-597.

[10]姜遠(yuǎn)旭,徐世元,張雪萍,等.右美托咪定聯(lián)合烏司他丁減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷[J].中國(guó)病理生理雜志,2014,30(1):96-101.

[11]黃亮,季憲飛.降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)內(nèi)毒素急性肺損傷的保護(hù)作用[J].臨床急診雜志,2004,5(4):4-6.

(2016-02-29收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Zhi Dan Hua Yu prescription on CGRP and ET-1 of lung injury rats induced by LPS

Li Zhaoxia1，Ouyang Junyao1，Wang Yali1，Zhao Hui1，Shen Su2，Wang Lili2，Li Ren2

(1SchooloftraditionalChinesemedicine，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China; 2BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050,China)

Objective:To observe the effect of Zhi Dan Hua Yu prescriptionon CGRP、ET-1 and TNF-αof lung injury rats induced byendotoxin.Methods:A total of 84 SD rats withhalf males and half females were divided into control group,model group,Zhi Dan Hua Yu prescription group(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)and dexamethasone group by random,detecting the changes ofwatercontent inlung injury rats’ lung；utilizing radioimmunoassay to detecting changes of ET and CGRP in rat plasma.Results:Compared to control group，lung water content in model group rats were significantly increased(P<0.01),Zhi Dan Hua Yu prescription(33 g/kg,16.5 g/kg)and dexamethasone obviously reduced water content in lunginjury rats.The endothelin(ET)and calcitonin gene peptide(CGRP)in rat plasmaof model group were significantly increased(P<0.01)compared to that of control group;dexamethasone reduced ET content(P<0.01)and Zhi Dan Hua Yu prescription(16.5 g/kg,8.25 g/kg)reduced ET contant apparently(P<0.01); CGRP contant in rat plasma of Zhi Dan Hua Yuprescription(33 g/kg)were increased significantly(P<0.01); The content of tumor necrosis factor-α(TNF-α)was increased apparently(P<0.01)in comparison with that of control group; dexamethasone and Zhi Dan Hua Yu prescription(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)reduced TNF-αin rat plasma obviously(P<0.01).Conclusion:Zhi Dan Hua Yu prescriptionprotect endotoxin-induced lung injury rats by increase CGRP content and reduce ET-1 and TNF-αcontent in rat plasma.

Zhi Dan Hua Yu prescription;Lung injury;CGRP;ET-1

北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)“十病十藥”研發(fā)項(xiàng)目(編號(hào):Z141100002214019)——“蛭丹化瘀組方用于治療小兒病毒性肺炎的成藥性研究”

沈素(1961.11—),女,本科,主任藥師,主任,研究方向:醫(yī)院藥學(xué),E-mail:shensu11022000@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.031