星斑川鰈、黃蓋鰈和石鰈線(xiàn)粒體基因Cytb和COⅠ片段序列的比較研究

李 青，王 波，鄭風(fēng)榮，劉洪展，郭湘云，關(guān)洪斌

( 1. 山東大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 威海 264209； 2. 國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061 )

星斑川鰈、黃蓋鰈和石鰈線(xiàn)粒體基因Cytb和COⅠ片段序列的比較研究

李 青1,2，王 波2，鄭風(fēng)榮2，劉洪展1，郭湘云2，關(guān)洪斌1

( 1. 山東大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 威海 264209； 2. 國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061 )

星斑川鰈、鈍吻黃蓋鰈和石鰈是我國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)海水魚(yú)類(lèi)。為探究這3種鰈科魚(yú)類(lèi)間的親緣關(guān)系及遺傳信息，本文采用了PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序的技術(shù)，對(duì)這3種鰈科魚(yú)類(lèi)各24尾個(gè)體的線(xiàn)粒體基因Cytb和COⅠ進(jìn)行初步研究。測(cè)序得到的序列經(jīng)人工處理校正后分析，其中Cytb基因片段可用長(zhǎng)度為358 bp，包含58個(gè)變異位點(diǎn)，20個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，3個(gè)顛換位點(diǎn)；COⅠ基因片段可用長(zhǎng)度為559 bp，包含變異位點(diǎn)56個(gè)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)18個(gè)，顛換位點(diǎn)3個(gè)；Cytb基因片段和COⅠ基因片段均表明黃蓋鰈和石鰈具有較高的單倍型多樣性與較低的核苷酸多樣性，而星斑川鰈具有較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性?；贑ytb和COⅠ序列的兩種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法和不加權(quán)對(duì)群法)均表明3種鰈科魚(yú)類(lèi)中星斑川鰈與石鰈親緣關(guān)系更近，與黃蓋鰈相對(duì)較遠(yuǎn)。鰈科魚(yú)類(lèi)物種遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的分析可以為魚(yú)類(lèi)的保護(hù)和管理提供重要的理論依據(jù)，為保障我國(guó)鰈科魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

星斑川鰈；黃蓋鰈；石鰈；線(xiàn)粒體DNA

鰈形目魚(yú)類(lèi)常被稱(chēng)作比目魚(yú)、偏口魚(yú)。是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。星斑川鰈(Platichthysstellatus)又名星突江鰈，川鰈屬[1]，是一種大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。星斑川鰈主要棲息在N 33°～73°和W 105°～E 127°附近的太平洋和北冰洋海域以及附近的河流[2]，屬于冷水廣鹽性魚(yú)類(lèi)。鈍吻黃蓋鰈(Pseudopleuronectesyokohamae),黃蓋鰈屬，冷溫性魚(yú)類(lèi)，具有地方種群多、適應(yīng)能力強(qiáng)、底棲雜食性等特點(diǎn)[3]。石鰈(Kareiusbicoloratus)，石鰈屬，主要分布于溫帶和寒帶。這三種鰈科魚(yú)類(lèi)肉質(zhì)鮮美,口感獨(dú)特，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前這三種鰈科魚(yú)類(lèi)已經(jīng)成為我國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，然而對(duì)三種魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖生理生化方面的研究報(bào)道較多，比較其遺傳多樣性的研究報(bào)道卻很少，而正確的遺傳結(jié)構(gòu)鑒定對(duì)于重要漁業(yè)資源的管理起到積極帶動(dòng)作用[4]。

魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因是長(zhǎng)約15～20 kb的結(jié)構(gòu)高度緊湊的共價(jià)雙鏈閉環(huán)分子[5]，是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的單位[6]。因進(jìn)化速率快、呈母系遺傳、群體之間遺傳差異極易被檢出，線(xiàn)粒體基因常被作為有效的遺傳標(biāo)記應(yīng)用于群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)以及物種鑒定研究中[7-10]。在線(xiàn)粒體中，細(xì)胞色素b(Cytb)基因和細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因具有比線(xiàn)粒體rDNA和非編碼區(qū)更易排序[11]、進(jìn)化速率適中、容易擴(kuò)增和測(cè)序以及富含系統(tǒng)發(fā)育信息[12]等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源狀況和種群遺傳多樣性以及分子系統(tǒng)發(fā)育的探究中。本研究測(cè)定了日照星斑川鰈、江蘇星斑川鰈、鈍吻黃蓋鰈和石鰈線(xiàn)粒體基因組的Cytb基因和COⅠ基因的部分序列，分析比較了3個(gè)鰈科魚(yú)類(lèi)在堿基組成、變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換位點(diǎn)、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等方面的異同，并計(jì)算了遺傳距離和基于雙參數(shù)法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。同時(shí)比較了源于同一野生群體經(jīng)在不同地理位置養(yǎng)殖后的星斑川鰈后代在線(xiàn)粒體遺傳信息上的異同，以及同屬于野生群體的黃蓋鰈和石鰈在線(xiàn)粒體遺傳信息的不同。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

24尾日照星斑川鰈于2014年8月取自日照海洋水產(chǎn)資源增殖站，屬于人工養(yǎng)殖群體；24尾江蘇的星斑川鰈于2015年3月取自江蘇贛縣屬于人工養(yǎng)殖群體，與日照星斑川鰈均是由生活在我國(guó)黃海北部的野生群體經(jīng)人工養(yǎng)殖十年而繁殖的后代；24尾鈍吻黃蓋鰈于2015年1月取自煙臺(tái)蓬萊近海，屬于野生群體；24尾石鰈于2015年6月取自日照近海，屬于野生群體。取尾鰭樣品于95%酒精固定-80 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

基因組DNA提取，取每個(gè)樣本的尾鰭約30 mg，分別用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取，將溶于130 μL TE(Tris和EDTA)緩沖液中，于-20 ℃保存。提取基因組水浴時(shí)需充分振蕩使其混勻，以保證消化完全；溶解前應(yīng)使漂洗液充分揮發(fā)，避免漂洗液中的乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)的PCR反應(yīng)。

目的片段PCR擴(kuò)增用于擴(kuò)增線(xiàn)粒體基因DNA的Cytb基因片段[13],上游引物Cytb F:5′-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3′;下游引物Cytb R:5′-CTCAGAATGACATTTGTCCTCA-3′；線(xiàn)粒體CO Ⅰ基因片段引物，上游引物CO Ⅰ F:5′-CACAAAGACATTGGCACCCT-3′;下游引物CO Ⅰ R:5′-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3′。PCR反應(yīng)總體積為50 μL：DNA模板，1.5 μL(15 ng/μL)，上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，2×Reaction Mix 25 μL，Taq DNA 聚合酶0.6 μL(2.5 U/μL)(東盛生物)，ddH2O 18.9 μL。Cytb基因PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，第二步到第四步34個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。CO Ⅰ基因PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，第二步到第四步34個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上進(jìn)行。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(U=5 V/cm)。

目的片段的序列測(cè)定將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物中送北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司用ABI3730XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)采用與相對(duì)應(yīng)的正向引物。

序列分析測(cè)序結(jié)果經(jīng)Dnastar軟件包校對(duì)后人工截取有效片段。軟件DNA Sequence Polymorphism 5.0[14]用來(lái)計(jì)算各個(gè)群體單倍型數(shù)、單倍型多樣性[15]、核苷酸多樣性[15]以及平均核苷酸差異數(shù)[16]；利用軟件Mega 6.0[17]堿基組成、堿基替換統(tǒng)計(jì)、種間種內(nèi)遺傳距離計(jì)算、用鄰接法(分別設(shè)自展值為1000或內(nèi)部分支檢驗(yàn)次數(shù)是1000)和不加權(quán)對(duì)群法(內(nèi)部分支檢驗(yàn)次數(shù)1000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從而進(jìn)行系統(tǒng)分化分析。

2 結(jié) 果

2.1 4個(gè)魚(yú)類(lèi)群體的線(xiàn)粒體基因Cytb

2.1.1 Cytb部分基因序列堿基組成分析

將返回的4個(gè)群體的測(cè)序結(jié)果經(jīng)Bioedit Sequence Alignment Editor 校對(duì)后人工截取總長(zhǎng)421 bp中的358 bp片段進(jìn)行分析，應(yīng)用Mega 6.0中Sequence Date Explore分別計(jì)算4個(gè)群體的堿基組成頻率(表1)。由表1 可見(jiàn)，鈍吻黃蓋鰈相比其他3個(gè)鰈類(lèi)群體堿基組成差異相對(duì)較大，GC含量相對(duì)較高(49.6%)，而日照星斑川鰈、江蘇星斑川鰈、石鰈的GC含量分別為46.6%、46.6%、46.5%。差異主要出現(xiàn)在第3位點(diǎn)，在第3位點(diǎn)日照星斑川鰈、江蘇星斑川鰈、石鰈的GC含量分別為49.6%、49.6%、49.3%，鈍吻黃蓋鰈在第3位點(diǎn)的GC含量卻高達(dá)57.7%。鳥(niǎo)嘌呤在第3位點(diǎn)的含量呈現(xiàn)一致的偏低，僅占8.4%，這與肖永雙等[18]的研究結(jié)果一致。

運(yùn)用Mega 6.0軟件分別對(duì)4個(gè)鰈科魚(yú)類(lèi)Cytb部分基因序列間變異位點(diǎn)的分析統(tǒng)計(jì)(表2)。每個(gè)種群內(nèi)部堿基序列差異很小，變異位點(diǎn)最多的是石鰈，僅僅只有5個(gè)。3種魚(yú)共4個(gè)群體作為一個(gè)整體，在358個(gè)堿基中，保守位點(diǎn)(C)高達(dá)300個(gè)堿基，變異位點(diǎn)(V)58個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Pi)57個(gè)，自裔位點(diǎn)(Si)1個(gè)。鈍吻黃蓋鰈的4倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)最多，有64個(gè)，其他3類(lèi)有63個(gè)。星斑川鰈2個(gè)群體各有63個(gè)2倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)，鈍吻黃蓋鰈和石鰈分別有62個(gè)和61個(gè)。軟件DnaSP 5計(jì)算得到的各個(gè)群體單倍型數(shù)目、單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及平均核苷酸差異性表明，石鰈遺傳多樣性最高，單倍型數(shù)目是星斑川鰈的3倍，是鈍吻黃蓋鰈的2倍，可以初步得出養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)群體多樣性低于野生群體。

表1 Cytb基因片段序列的堿基組成頻率 %

表2 Cytb基因片段平均位點(diǎn)分析

2.1.2 Cytb部分基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)

根據(jù)Mega 6.0中的Sequence Date Explore分別對(duì)4個(gè)群體魚(yú)類(lèi)的Cytb序列的堿基替換數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表3)。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，日照星斑川鰈、江蘇星斑川鰈、鈍吻黃蓋鰈、石鰈4個(gè)群體間轉(zhuǎn)換取代的速率為5.97%，顛換取代的速率為0.89%。轉(zhuǎn)換與顛換速率之比是6.67。轉(zhuǎn)換速率明顯高于顛換速率。

表3 Cytb基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)表

2.1.3 Cytb部分基因序列遺傳距離計(jì)算

4個(gè)群體的Cytb基因通過(guò)雙參數(shù)模型計(jì)算所獲得的遺傳距離見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，4個(gè)鰈類(lèi)群體內(nèi)部遺傳距離分別為：鈍吻黃蓋鰈0.002，標(biāo)準(zhǔn)差0.001；江蘇星斑川鰈內(nèi)部遺傳距離最小，為0.000，標(biāo)準(zhǔn)差0.000；石鰈0.005，標(biāo)準(zhǔn)差0.002；日照星斑川鰈0.001，標(biāo)準(zhǔn)差0.001。群體間遺傳距離最小的是江蘇星斑川鰈和日照星斑川鰈，僅僅為0.001，星斑川鰈江蘇群體與日照群體內(nèi)部遺傳距離相等。星斑川鰈和鈍吻黃蓋鰈間的遺傳距離最大，江蘇、日照2個(gè)星斑川鰈群體與鈍吻黃蓋鰈間的遺傳距離分別為0.147、0.148。鈍吻黃蓋鰈和石鰈平均遺傳距離為0.131，石鰈和日照星斑川鰈、江蘇星斑川鰈群體的平均遺傳距離分別為0.015、0.075。

表4 基于雙參數(shù)模型模型4個(gè)群體的Cytb序列的遺傳距離

注：表格對(duì)角線(xiàn)以下為種群間遺傳距離，對(duì)角線(xiàn)以上為標(biāo)準(zhǔn)差.

2.1.4 Cytb系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)序所得的3種鰈的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性檢索，在GenBank中選取星斑川鰈、石鰈、鈍吻黃蓋鰈Cytb序列各一條，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。另外選取馬舌鰈(ReinhardtiushippoglossoidesKF445157.1)作為外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建(表5)。由于每個(gè)群體內(nèi)部差異很小，建樹(shù)時(shí)僅選取每個(gè)群體的3尾個(gè)體。利用Mega 6.0軟件中的鄰接法(又分為內(nèi)部分支檢驗(yàn)和自展法檢測(cè))和不加權(quán)對(duì)群法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1～3)。結(jié)果顯示，鄰接法和不加權(quán)對(duì)群法具有基本相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：星斑川鰈2個(gè)群體基本沒(méi)有差異，與星斑川鰈KF445179.1聚為一支；石鰈與星斑川鰈的遺傳關(guān)系相對(duì)更近一些，石鰈樣品與石鰈AB987795.1聚為一支后與星斑川鰈聚為一大支；馬舌鰈KF445157.1與鈍吻黃蓋鰈相對(duì)更近，聚為一大支，與星斑川鰈和石鰈的一大支相并列。

表5 GenBank下載的幾種鰈的Cytb序列信息

圖1 基于Cytb基因片段的鄰接法(自展法檢測(cè))構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)節(jié)點(diǎn)上數(shù)值代表自展法檢測(cè)的百分值(重復(fù)計(jì)算1000次).

圖2 基于Cytb基因片段的鄰接法(內(nèi)部分支檢驗(yàn))構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)節(jié)點(diǎn)上數(shù)值代表內(nèi)部分支檢驗(yàn)百分值(重復(fù)計(jì)算1000次).

2.2 4個(gè)魚(yú)類(lèi)群體的線(xiàn)粒體基因COⅠ

2.2.1 COⅠ部分基因序列堿基組成分析

將返回的4個(gè)群體的測(cè)序結(jié)果經(jīng)Bioedit Sequence Alignment Editor 校對(duì)后人工截取總長(zhǎng)604 bp中的559 bp片段進(jìn)行分析，應(yīng)用Mega 6.0中Sequence Date Explore分別計(jì)算4個(gè)群體的堿基組成頻率(表6)。結(jié)果表明，在4個(gè)群體線(xiàn)粒體基因COⅠ片段中，(C+G)含量略低于(A+T),鈍吻黃蓋鰈中(C+G)含量為47.5%，星斑川鰈2個(gè)群體均為47.7%，石鰈相對(duì)最高，為48.1%。(C+G)在第一位點(diǎn)含量超過(guò)(A+T)含量，55.6%～56.1%；第2位點(diǎn)(C+G)最低，均為41.4%；第3位點(diǎn)(G+C)含量分別為：星斑川鰈2個(gè)群體均為46.3%，鈍吻黃蓋鰈45.1%，石鰈47.3%。

運(yùn)用Mega 6.0軟件對(duì)4個(gè)鰈科魚(yú)類(lèi)COⅠ部分基因序列間變異位點(diǎn)分析統(tǒng)計(jì)(表7)。鈍吻黃蓋鰈和石鰈相對(duì)星斑川鰈的變異位點(diǎn)要多，分別為5個(gè)、4個(gè)，分別占0.89%和0.71%。4個(gè)群體作為整體，共有56個(gè)變異位點(diǎn)，占10.02%，包括53個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和3個(gè)自裔位點(diǎn)。0倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)、2倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)、4倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)4個(gè)群體間相差不大。2個(gè)星斑川鰈群體共享1個(gè)單倍型，這與肖永雙等[19]的研究一致。就變異位點(diǎn)和單倍型來(lái)說(shuō)，鈍吻黃蓋鰈的多樣性略高于石鰈，鈍吻黃蓋鰈24個(gè)個(gè)體共享6個(gè)單倍型，石鰈24個(gè)個(gè)體共享5個(gè)單倍型。

圖3 基于Cytb基因片段的不加權(quán)對(duì)群法(內(nèi)部分支檢驗(yàn))法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)節(jié)點(diǎn)上數(shù)值代表內(nèi)部分支檢驗(yàn)的百分值(重復(fù)計(jì)算1000次).

試驗(yàn)樣品總堿基頻率第一位點(diǎn)第二位點(diǎn)第三位點(diǎn)TCAGTCAGTCAGTCAG日照星斑川鰈27.529.524.818.21626.228.929.44428.514.512.92333.930.612.4江蘇星斑川鰈27.629.524.718.21626.228.929.44428.514.512.92333.930.612.4黃蓋鰈26.830.225.617.31526.728.929.44428.514.512.92235.533.49.6石鰈27.629.324.318.81626.228.929.44428.514.512.92333.329.514.0

表7 COⅠ基因片段平均位點(diǎn)分析

2.2.2 COⅠ部分基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)

根據(jù)Mega 6.0中的Sequence Date Explore分別對(duì)4個(gè)群體魚(yú)類(lèi)的Cytb序列的堿基替換數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表8)。由表8可見(jiàn)，轉(zhuǎn)換顛換主要發(fā)生在第3位點(diǎn)，發(fā)生在第1位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換僅有1個(gè)，而在第3位點(diǎn)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有17個(gè)，顛換位點(diǎn)有3個(gè)。轉(zhuǎn)換取代速率為3.35%，顛換取代速率為0.56%，轉(zhuǎn)換與顛換位點(diǎn)的比值為R=6。

表8 COⅠ基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)表

2.2.3 COⅠ部分基因序列遺傳距離計(jì)算

用雙參數(shù)模型計(jì)算所獲得的4個(gè)群體的遺傳距離見(jiàn)表9。由表9可知，鈍吻黃蓋鰈與其他3個(gè)群體遺傳距離最遠(yuǎn)，均為0.074；星斑川鰈兩個(gè)群體幾乎無(wú)差異，遺傳距離為0；星斑川鰈與石蝶相對(duì)較近，為0.045。

表9基于雙參數(shù)模型模型4個(gè)群體的COⅠ序列的遺傳距離

群體黃蓋鰈江蘇星斑川鰈石鰈日照星斑川鰈黃蓋鰈0.0110.0110.011江蘇星斑川鰈0.0740.0080.000石鰈0.0740.0450.008日照星斑川鰈0.0740.0000.045

注：表格對(duì)角線(xiàn)以下是種群間遺傳距離，對(duì)角線(xiàn)以上是標(biāo)準(zhǔn)差.

2.2.4 COⅠ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

選取GenBank中的3條序列以及馬舌鰈作為外群(表10)，利用軟件Mega 6.0分別使用鄰接法和不加權(quán)對(duì)群法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4～6)。比較3種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，兩個(gè)星斑川鰈群體均交叉混合為一支，與星斑川鰈EU266365.1為同一物種；石鰈與石鰈JQ738484.1為一物種；石鰈與星斑川鰈聚為一大支后再與鈍吻黃蓋鰈聚為一支，馬舌鰈KC015868.1單獨(dú)為一支。

表10 GenBank下載的幾種鰈的COⅠ序列信息

3 討 論

遺傳多樣性是物種適應(yīng)生存、進(jìn)化發(fā)展的必要條件，遺傳多樣性越高，遺傳變異越豐富，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力就越強(qiáng)，可適宜生存的環(huán)境就越廣泛。由此，研究生物遺傳多樣性可以為采取積極有效的措施保護(hù)生物多樣性提供科學(xué)指導(dǎo)。相對(duì)于同工酶、RAPD等分子標(biāo)記，DNA序列分析在用于遺傳多樣性分析試驗(yàn)時(shí)更準(zhǔn)確、更直接[20]。線(xiàn)粒體基因Cytb和COⅠ是兩個(gè)非常保守的基因序列，常被用來(lái)檢測(cè)群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性[21-22]。本試驗(yàn)采用Cytb和COⅠ兩對(duì)引物探究日照星斑川鰈、江蘇星斑川鰈、鈍吻黃蓋鰈、石鰈4個(gè)鰈類(lèi)群體在堿基組成、變異及保守位點(diǎn)、堿基替換等方面的異同，以及根據(jù)雙參數(shù)模型建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

4個(gè)鰈類(lèi)群體在COⅠ和Cytb 兩個(gè)基因片段上的堿基組成方面，GC含量與AT含量相差不大，這與無(wú)脊椎動(dòng)物如三疣梭子蟹(Portunustritubercalatus)[23]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[24]有區(qū)別?？傮w看4個(gè)群體的在這兩個(gè)基因片段中的變異位點(diǎn)很少，反映了線(xiàn)粒體基因Cytb和COⅠ是兩種很保守的基因序列。根據(jù)Grant[25]的4種分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[a，較低的單倍型多樣性(<0.5)，較低的核苷酸多樣性(<0.005)；b，較高的單倍型多樣性，較低的核苷酸多樣性；c，較低的單倍型多樣性，較高的核苷酸多樣性；d，較高的單倍型多樣性，較高的核苷酸多樣性]，從整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，石鰈和鈍吻黃蓋鰈具有較高的單倍型多樣性與較低的核苷酸多樣性，這與海水中大多數(shù)魚(yú)類(lèi)相同，如銀鯧(Pampusargenteus)[26]，小黃魚(yú)(Pseudosciaenapolyactis)[27]，西北太平洋的花鱸(Lateolabraxjaponicus)與斑點(diǎn)鱸魚(yú)(L.maculatus)[28]等，這可能是種群受瓶頸效應(yīng)影響后又經(jīng)歷建立者效應(yīng)的結(jié)果[29]。而星斑川鰈屬于較低單倍型與較低核苷酸多樣性結(jié)合類(lèi)，這可能與我國(guó)引進(jìn)星斑川鰈時(shí)間較晚，分化程度較低有關(guān)。

圖4 基于COⅠ基因片段的鄰接法(自展法檢測(cè))構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)節(jié)點(diǎn)上數(shù)值代表自展法檢測(cè)的百分值(重復(fù)計(jì)算1000次).

圖5 基于COⅠ基因片段的鄰接法(內(nèi)部分支檢驗(yàn))構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)節(jié)點(diǎn)上數(shù)值代表內(nèi)部分支檢驗(yàn)的百分值(重復(fù)計(jì)算1000次).

圖6 基于COⅠ基因片段的不加權(quán)對(duì)群法 (內(nèi)部分支檢驗(yàn))構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)節(jié)點(diǎn)上數(shù)值代表內(nèi)部分支檢驗(yàn)的百分值(重復(fù)計(jì)算1000次).

從遺傳距離可以看出，星斑川鰈2個(gè)群體的群體內(nèi)遺傳距離與群體間遺傳距離相等，可視為同一個(gè)群體?？梢酝茰y(cè)星斑川鰈進(jìn)化速率較慢或二者分布地區(qū)環(huán)境的區(qū)別不夠大到影響種群的生存。石鰈和星斑川鰈相對(duì)更近，與黃蓋鰈較遠(yuǎn)，這與6個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)反應(yīng)的結(jié)果一致。幾個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的區(qū)別是，在基于Cytb基因片段序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，鈍吻黃蓋鰈與馬舌鰈成為一支，與星斑川鰈和石鰈相聚的一支并列；而在基于COⅠ基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，星斑川鰈與石鰈聚為一支后，與鈍吻黃蓋鰈聚為一大支，然后與馬舌鰈相聚。這可能與Cytb基因序列較短，區(qū)別太小有關(guān)。

[1] 王波，孫萍，方華華，等.星斑川鰈形態(tài)特征及相關(guān)參數(shù)的觀(guān)測(cè)[J].海洋學(xué)報(bào)，2010,32(2)：139-147.

[2] Miao G， Shao C, Ma H，et al. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from a dinucleotide-enriched genomic library of starry flounder (Platichthysstellatus) and cross-species amplification[J]. Conservation Genetics，2009，10(3)：631-633.

[3] 周勤，王迎春.溫度對(duì)黃蓋鰈仔魚(yú)生長(zhǎng)、發(fā)育、攝食及PNR的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，1998，5(1)：30-37.

[4] Utter F M. Biochemical genetics and fishery management: an historical perspective[J]. Journal of Fish Biology，1991，39(Suppl.A)：1-20.

[5] 龔理，時(shí)偉，司李真，等.魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體DNA重排研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，2013，34(6)：666-673.

[6] 郭新紅，劉少軍，劉巧，等，魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體DNA研究新進(jìn)展[J]. 遺傳學(xué)報(bào)， 2004，31(9)：983-1000.

[7] Brown W. Evolution of animal mitochondrial DNA[J]. Evolution of Genes and Proteins， 1983(1)：62-88.

[8] Harrison R G. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evolutionary biology[J]. Trends in Ecology & Evolution， 1989，4(1)：6-11.

[9] Miya M，Takeshima H，Endo H, et al. Major patterns of higher teleostean phylogenies: a new perspective based on 100 complete mitochondrial DNA sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，26(1)：121-138.

[10] Pepe T，Trotta M， Di Marco I，et al. Mitochondrial cytochrome b DNA sequence variations: an approach to fish species identification in processed fish products[J]. Journal of Food Protection，2005，68(2)：421-425.

[11] 俞建中. 黃海鰈形目魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)發(fā)生與分子進(jìn)化的初步研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2004.

[12] 張迪，雷光春，龔成，等.基于COⅠ基因序列的太湖新銀魚(yú)遺傳多樣性[J]. 湖泊科學(xué)，2012，24(2)：299-306.

[13] 張巖，肖永雙，高天翔，等.兩種黃蓋鰈線(xiàn)粒體DNA部分片段比較分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2009，33(2)：201-207.

[14] Librado P，Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics，2009，25(11)：1451-1452.

[15] Nei M. Molecular evolutionary genetics[M]. New York: Columbia University Press，1987:1009-1021.

[16] Tajima F. Evolutionary relationship of DNA sequences in finite populations[J]. Genetics，1983，105(2)：437-460.

[17] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013,30(12):2725-2729.

[18] 肖永雙，張巖，高天翔. 基于線(xiàn)粒體DNA部分片段探討石鰈與星突江鰈的親緣關(guān)系[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010,40(6)：69-76.

[19] 肖永雙，肖志忠，劉清華，等.星斑川鰈、大菱鲆及其雜交后代的線(xiàn)粒體DNA序列比較分析[J].海洋科學(xué)，2014，38(6)：5-9.

[20] Buonaccorsi V, McDowell J，Graves J. Reconciling patterns of inter-ocean molecular variance from four classes of molecular markers in blue marlin (Makairanigricans)[J]. Molecular Ecology, 2001，10(5)：1179-1196.

[21] 趙峰，莊平，章龍珍，等.基于線(xiàn)粒體Cyt b基因的黃海南部和東海銀鯧群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2011，35(5)：745-752.

[22] 趙亮，謝本貴，劉志瑾，等.太湖新銀魚(yú)線(xiàn)粒體D-loop和Cyt b片段序列結(jié)構(gòu)與進(jìn)化速率比較[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2010,45(2)：27-38.

[23] 郭天慧，孔曉瑜，陳四清，等.三疣梭子蟹線(xiàn)粒體DNA16S rRNA和COⅠ基因片段序列的比較研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，34(1)：22-28.

[24] 劉亞軍，喻子牛，姜艷艷，等.櫛孔扇貝16S rRNA基因片段序列的多態(tài)性研究[J]. 海洋與湖沼，2002，33(5)：477-483.

[25] Grant W, Bowen B. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]. Journal of Heredity，1998，89(5)：415-426.

[26] 彭士明，施兆鴻，侯俊利. 基于線(xiàn)粒體D-loop區(qū)與COⅠ基因序列比較分析養(yǎng)殖與野生銀鯧群體遺傳多樣性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010,34(1)：19-25.

[27] 彭博，章群，趙爽，等.中國(guó)近海小黃魚(yú)遺傳變異的細(xì)胞色素b序列分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(2)：131-135.

[28] Liu J X，Gao T X，Yokogawa K，et al. Differential population structuring and demographic history of two closely related fish species, Japanese sea bass (Lateolabraxjaponicus) and spotted sea bass (Lateolabraxmaculatus) in Northwestern Pacific[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2006，39(3)：799-811.

ComparativeAnalysisofMitochondrialCytbandCOⅠSequencesofFloundersPlatichthysstellatus,PseudopleuronectesyokohamaeandKareiusbicoloratus

LI Qing1,2，WANG Bo2， ZHENG Fengrong2，LIU Hongzhan1， GUO Xiangyun2，GUAN Hongbin1

( 1. Marine College, Shandong University，Weihai 264209，China；2. First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China )

FloundersPlatichthysstellatus,PseudopleuronectesyokohamaeandKareiusbicoloratuswere economically important marine fish in north China. To evaluate the relationship among the three members in Pleuronectidae and genetic information, mitochondrial DNA cytochrome b gene (Cytb) and mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ gene (COⅠ) fragments of the three species(24 individuals in each species) were preliminarily studied by PCR amplification and direct sequencing. By analyzing the sequence obtained by manual processing, we found that the Cytb gene fragment was 358 bp, which contained 58 variable sites, 20 transitionsal pairs, and 3 transversional pairs, while the available length of the COⅠ gene fragment was 559 bp, including 56 variable sites, 18 transitionsal pairs and 3 transversional pairs. Analysis of Cytb and COⅠ gene fragments revealed that bothP.yokohamaeandK.bicoloratushad a high haplotype diversity and low nucleotide diversity whileP.stellatushad low haplotype diversity and low nucleotide diversity. Two kinds of phylogeny trees (Neighbor-Joining Tree and UPGMA tree) based on cytb and COⅠ sequences showed thatP.stellatusandK.bicoloratusis were closer thanP.yokohamaein genetic relationship. Analysis of genetic diversity and genetic structure can provide an important theoretical basis for the conservation and management of fish, and provide theoretical guidance and scientific basis for the healthy and sustainable development of pleuronectid aquaculture.

Platichthysstellatus；Pseudopleuronectesyokohamae；Kareiusbicoloratus；mtDNA

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.004

S917.4

A

1003-1111(2016)06-0625-08

2015-12-14；

2016-03-07.

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(“863”)項(xiàng)目(2012AA10A408，2012AA10A413)；國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201405010).

李青(1990—)，女，碩士研究生；研究方向?yàn)椋呼~(yú)類(lèi)遺傳.E-mail: liqingshdwh@163.com.通訊作者：關(guān)洪斌(1961—)，男，副教授，博士；研究方向：基因表達(dá)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng). E-mail: guanhongbin@sdu.edu.cn.