家畜止痢散抑菌和鎮(zhèn)痛活性研究

保丹東，胡冰野

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025）

家畜止痢散抑菌和鎮(zhèn)痛活性研究

保丹東1，胡冰野2

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025）

為了研究止痢散抑菌和鎮(zhèn)痛的藥理學(xué)作用，采用二倍稀釋法、熱板刺激、冰醋酸刺激小鼠扭體等方法研究止痢散的抑菌及鎮(zhèn)痛作用。抑菌結(jié)果顯示，止痢散最小抑菌濃度（MIC）為0.312 5 mg/mL，止痢散對(duì)于金黃色葡萄球菌的MBC為0.625 0 mg/mL，對(duì)于大腸桿菌的MBC為0.937 5 mg/mL。熱板刺激結(jié)果顯示，與給藥前相比：止痢散低、中、高劑量組在給藥后30 min痛閾值極顯著減少（P＜0.01），在給藥后1 h止痢散低、高劑量組痛閾值顯著減少（P＜0.05）。冰醋酸刺激小鼠扭體結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比：陽(yáng)性組小鼠扭體次數(shù)極顯著減少（P＜0.01），止痢散低劑量小鼠扭體次數(shù)極顯著減少（P＜0.01）；與陽(yáng)性組相比：各試驗(yàn)組小鼠扭體次數(shù)極顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論：止痢散具有抑菌、鎮(zhèn)痛作用；抑菌作用明顯，鎮(zhèn)痛作用不明顯。

止痢散；抑菌；鎮(zhèn)痛；痛閾值

多葉勾兒茶，為鼠李科勾兒茶屬下的一個(gè)變種。產(chǎn)陜西、甘肅、四川、貴州、云南、廣西，常生于山地灌叢或林中，海拔300～1 900 m有祛風(fēng)利濕，活血祛痛，止咳化痰等功效，具有一定抗菌、抗炎作用。地榆，薔薇科地榆屬多年生草本植物，紡錘形粗壯跟，短柄小葉，紫紅色花瓣，果實(shí)包藏萼筒內(nèi)。地偷抗菌作用體外試驗(yàn)表明地榆對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等生長(zhǎng)具有抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用較強(qiáng)［1］。此外地榆還具有鎮(zhèn)痛作用，典籍記載如下《本經(jīng)》：“主婦人乳痓痛，七傷，帶下病，止痛，除惡肉，止汗，療金瘡?！薄独ッ髅耖g常用草藥》：“治胃痛，胃腸出血?！睘跛?，雙子葉植物綱，毛茛目山胡椒屬，主要含有揮發(fā)油，異吡喹酮類生物堿，用于溫中散寒，順氣止痛。烏藥對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑制作用。烏藥葉也有鎮(zhèn)痛作用：局部涂用可使血管擴(kuò)張、血液循環(huán)加快、緩解復(fù)合肌肉痙攣性疼痛作用。最近報(bào)道［2］烏藥、醋制烏藥的水提液和醇提液具有鎮(zhèn)痛作用。動(dòng)物新獸藥止痢散主要組成是多葉勾兒茶輔以地榆、烏藥等中草藥組合的新復(fù)方中藥制劑。本實(shí)驗(yàn)以此組方作為實(shí)驗(yàn)抑菌、鎮(zhèn)痛對(duì)象，通過(guò)對(duì)動(dòng)物止痢散進(jìn)行抑菌、鎮(zhèn)痛等藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，為臨床運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小白鼠，體重20±2 g，購(gòu)自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0003），在貴州大學(xué)貴州省生化工程中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2013-0001）飼養(yǎng)，試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)（2006）》的規(guī)定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 止痢散原藥、多葉勾兒茶、地榆、烏藥（均由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供）；冰醋酸（安徽深藍(lán)醫(yī)療科技股份有限公司）；阿司匹林（上海穎心實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，批號(hào)：100113）；生理鹽水（北京科友佳生物技術(shù)有限公司）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（上海博微生物科技有限公司，批號(hào)：140316）；10%胰酪胨大豆肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)：3101010）。

1.1.3 藥物保存 止痢散高劑量組按止痢散原藥100 g+ 100 mL雙蒸水稀釋，止痢散中劑量組：按止痢散原藥100 g+200 mL雙蒸水稀釋，止痢散低劑量組按止痢散原藥100 g+900 mL雙蒸水稀釋；止痢散、多葉勾兒茶、地榆、烏藥等藥物均置于4攝氏度冰箱保存，使用時(shí)水浴加熱到25攝氏度。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 熱板測(cè)痛儀、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海生化儀器廠）；SBH-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；電子天平（北京賽多利斯天平儀器廠）；KQ3200電熱恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；LS-B75立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠）；DHG-9230A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-B11-360電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 止痢散的抑菌作用 止痢散的準(zhǔn)備：將止痢散（1.25 g/mL）原藥采用高壓滅菌。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌液準(zhǔn)備，菌液準(zhǔn)備主要包括復(fù)壯與計(jì)數(shù)，操作過(guò)程全部在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

（1）將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌種接種于10% NaCl胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下在恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。

（2）移液槍吸取1 mL菌液用滅菌生理鹽水進(jìn)行十倍梯度稀釋，稀釋8個(gè)梯度，每個(gè)梯度吸取100 μL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用L棒輕輕攤勻，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

（3）通過(guò)計(jì)算，選出每毫升菌液的活細(xì)菌數(shù)量級(jí)為108/mL的菌液保存待用。本實(shí)驗(yàn)所選出每毫升菌液的活細(xì)菌數(shù)為3.08×108/mL（原菌液稀釋五倍）。

最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定：采用試管二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）（此試驗(yàn)需在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，具體操作如下：

① 取無(wú)菌10 mL小試管18支平均分成2組，每管中加入10% NaCl胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基1 mL，在第1支試管中加止痢散1 ml，用微量移液器混勻，吸取混勻液1 mL至第2管混勻，依次到第7管，再?gòu)牡?管吸出1 ml混合液棄之，第8管（加大腸菌菌液不加中藥）做陽(yáng)性對(duì)照，第9管做陰性對(duì)照（加中藥不加菌液），第10到第18支試管除第16支所加菌液為金黃色葡萄球菌外，其他處理同第1到8支。此時(shí)1到7號(hào)管、9到15號(hào)管內(nèi)藥液的濃度分別相當(dāng)于0.625 0 mg/mL、0.312 5 mg/mL、0.156 3 mg/mL、0.078 1 mg/mL、0.039 1 mg/Ml、0.019 5 mg/mL、0.009 8 mg/mL生藥濃度。

② 分別向各組的1至8號(hào)試管中加入0.1 mL大腸桿菌菌液、10至17號(hào)試管中加入0.1 mL大腸桿菌菌液，第9、第18支試管中加入0.1 mL普通肉湯培養(yǎng)基。

③ 將各組1至18號(hào)試管置于37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，觀察并記錄結(jié)果。若有絮狀桿菌沉淀，則有細(xì)菌生長(zhǎng)，若無(wú)絮狀沉淀，則細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。與對(duì)照組比較，以肉眼觀察無(wú)絮狀沉淀的試管藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.3 最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

測(cè)出最低抑菌濃度（MIC）后，觀察藥物MIC以上未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的各試驗(yàn)培養(yǎng)物，分別吸取0.1 mL，移種至不含藥的平皿培養(yǎng)基上置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，按一般規(guī)定，平皿培養(yǎng)基中，細(xì)菌計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者作為該藥物的最小殺菌濃度（MBC）［3］。

1.4 止痢散的鎮(zhèn)痛活性研究

1.4.1 冰醋酸致小鼠扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 將100只小鼠按隨機(jī)次數(shù)分布表，隨機(jī)分為5組，每組20只（雌雄各半），設(shè)生理鹽水空白組、止痢散高、中、低劑量組，阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組。除空白對(duì)照組給予同體積的生理鹽水外，灌胃給藥，在正常飼養(yǎng)基礎(chǔ)上連續(xù)用藥5 d，連續(xù)用藥5 d，給藥體積0.02 mL/g。末次給藥后1 h，各組小鼠再腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.2 mL/只，觀察15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)［4］。

1.4.2 熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組、給藥同扭體實(shí)驗(yàn)，各組小鼠熱板實(shí)驗(yàn)測(cè)定受試化合物的鎮(zhèn)痛作用：（20 ± 1）℃室溫條件下，置小鼠于（55±0.5）℃熱板，以接觸熱板至舔后足所經(jīng)歷的時(shí)間為痛閾值；剔除痛閾值≤3 s和≥30 s小鼠［5］；各小鼠給藥前間隔5 min測(cè)量痛閾值2次，取平均值作為給藥前（基礎(chǔ)）痛閾值。灌胃給藥，連續(xù)用藥5 d。末次給藥后1 h，分別測(cè)定每只30、60 min小鼠的痛閾值。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 止痢散抑菌實(shí)驗(yàn)

2.1.1 最小抑菌濃度（MIC）結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：由于中草藥對(duì)細(xì)菌的MIC國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)參照同類實(shí)驗(yàn)［6］的標(biāo)準(zhǔn)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。即當(dāng)MIC＜0.009 8 mg/mL生藥濃度時(shí)絮狀桿菌沉淀明顯清晰可見(jiàn)；當(dāng)MIC在0.019 5 mg/mL～0.156 3 mg/mL生藥濃度時(shí)絮狀桿菌沉淀清晰可見(jiàn)；當(dāng)MIC為0.156 3 mg/mL～0.312 5 mg/mL生藥濃度時(shí)絮狀桿菌沉淀模糊不清；當(dāng)MIC為0.312 5 mg/mL ～ 0.625 0 mg/mL生藥濃度時(shí)為無(wú)絮狀桿菌沉淀。

在本試驗(yàn)中，止痢散對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現(xiàn)為較敏感，其MIC為0.312 5 mg/mL。

2.1.2 最低殺菌濃度（MBC）結(jié)果如表1.2所示，止痢散對(duì)于金黃色葡萄球菌的MBC為0.625 0 mg/mL，對(duì)于大腸桿菌的MBC為0.937 5 mg/mL。

表2.1 不同菌種止痢散最低殺菌濃度（MBC）對(duì)照表

2.2 止痢散鎮(zhèn)痛作用

2.2.1 止痢散對(duì)小鼠扭體試驗(yàn)的影響 結(jié)果如表2.2所示，與空白對(duì)照組相比：陽(yáng)性組小鼠扭體次數(shù)極顯著減少（P＜0.01）；止痢散低劑量小鼠扭體次數(shù)極顯著減少（P＜0.01）。與陽(yáng)性組相比：各試驗(yàn)組小鼠扭體次數(shù)極顯著增加（P＜0.01）。

2.2.2 止痢散對(duì)小鼠熱板致痛作用的影響 結(jié)果如表2.3所示，陽(yáng)性組小鼠與給藥前相比，在給藥后30 min和1 h痛閾值都極顯著減少（P＜0.01）；陽(yáng)性組與空白組相比：給藥后30 min痛閾值極顯著減少（P＜0.01），藥后1 h痛閾值顯著減少（P＜0.05）。與給藥前相比：給藥后30 min和1 h止痢散低、中劑量痛閾值都極顯著減少（P＜0.01）。與給藥前相比：給藥后30 min和1 h止痢散高劑量痛閾值分別極顯著減少（P＜0.01）、顯著減少（P＜0.05）。同一時(shí)間段與空白組相比：陽(yáng)性組在給藥后30 min痛閾值極顯著減少（P＜0.01），給藥1 h后痛閾值顯著減少（P＜0.05）。同一時(shí)間段與陽(yáng)性組比：止痢散低、中、高劑量組在給藥后30 min痛閾值都極顯著減少（P＜0.01），在給藥后1 h止痢散低、高劑量組痛閾值顯著減少（P＜0.05）。

S853.7

A

1006-799X（2016）10-0078-02

保丹東（1989-），男，貴州普安人，本科在讀，主要研究方向動(dòng)物醫(yī)學(xué)。

貴州省重大專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字［2013］6014）。