中藥提取物對雞大腸桿菌病預(yù)防性干預(yù)及其機理研究

張瀚元，張秀英*，施路一

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱 150081）

中藥提取物對雞大腸桿菌病預(yù)防性干預(yù)及其機理研究

張瀚元1，張秀英1*，施路一2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱 150081）

以四種中藥提取物（連翹酯苷提取物、苦參提取物、蒼術(shù)提取物以及硫酸小檗堿）飽和水溶液混合物對雞大腸桿菌發(fā)病模型預(yù)防性干預(yù)，檢測雞大腸桿菌病模型標(biāo)志性炎癥因子mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，四種中藥提取物飽和水溶液混合物對雞大腸桿菌病發(fā)病過程具有較明顯預(yù)防性干預(yù)作用（P<0.05）；雞大腸桿菌病發(fā)病模型中NF-κb、TNF-α mRNA表達(dá)水平經(jīng)中藥提取物飽和水溶液混合物干預(yù)后均明顯低于陽性對照組（P<0.05），但仍高于空白對照組（P<0.05）；IL-10 mRNA表達(dá)水平在中藥提取物混合水溶液作用下較陽性對照組升高（P<0.05）。四種中藥提取物飽和水溶液可能通過干預(yù)感染雞炎癥進程預(yù)防雞大腸桿菌病。

中藥；大腸桿菌??；抗炎；抑菌作用

張瀚元,張秀英,施路一.中藥提取物對雞大腸桿菌病預(yù)防性干預(yù)及其機理研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(5):54-61.

Zhang Hanyuan,Zhang Xiuying,Shi Luyi.Preventive intervention and mechanism of traditional Chinese medicine in avian Escherichia colibacillosis[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(5):54-61.(in Chinese with English abstract)

雞大腸桿菌病的病理基礎(chǔ)是廣泛性漸進性炎癥。致病性大腸桿菌在局部大量繁殖產(chǎn)生毒素進入血液引起膿毒敗血癥導(dǎo)致宿主動物死亡[1]。凌育燊研究表明，在試驗性雞大腸桿菌病猝死病例中，多見肝、脾、腎和肺等實質(zhì)器官充血淤血及接種部位炎灶[2]。Cheville研究發(fā)現(xiàn)，感染48 h后，大腸桿菌自血液循環(huán)和直接接觸途徑擴散至機體各器官，宿主雞主要呈現(xiàn)急性敗血癥[3]。徐福南研究發(fā)現(xiàn)，各器官可見細(xì)菌團塊，組織充血出血以及水腫[4]，彌漫性纖維素性漿膜炎，表現(xiàn)從局部到整體漸進性多器官炎性病理基礎(chǔ)[2]。大腸桿菌對宿主實質(zhì)器官致炎作用表現(xiàn)為內(nèi)毒素致各臟器血管充血、淤血、出血、透明血栓形成，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集。Schumann研究表明，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)毒素主要靶細(xì)胞，內(nèi)毒素激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，致其損傷[5]。1991年，美國醫(yī)師學(xué)會（ACCP）、危重病醫(yī)學(xué)會（SCCM）聯(lián)席會議委員會提出全身性炎癥反應(yīng)綜合癥（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）概念，是指因感染或非感染因素作用于機體引發(fā)失控，自我持續(xù)放大和破壞性全身性炎癥反應(yīng)，用來替代原有的菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克等概念[6]。SIRS可導(dǎo)致多器官功能衰竭（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），以至個體死亡[7]。

雞大腸桿菌病誘發(fā)因素多，多表現(xiàn)為繼發(fā)或混合感染，具有重要的公共衛(wèi)生意義，防治工作不容忽視。長期應(yīng)用抗生素防治雞大腸桿菌病使感染菌耐藥性問題愈發(fā)嚴(yán)重，大腸桿菌在抗生素選擇壓力下進化，耐藥機理復(fù)雜，多重耐藥、交叉耐藥、耐藥譜廣[8]。鑒于不斷提高的藥殘標(biāo)準(zhǔn)、生物食品安全規(guī)范及抗生素破壞土壤微生態(tài)等問題，抗生素應(yīng)用規(guī)制越來越嚴(yán)格[9]?？股刂委熀螅腥揪尫糯罅績?nèi)毒素，引起相關(guān)疾病[10]。大腸桿菌血清型多，抗原復(fù)雜，區(qū)域差異大，無法統(tǒng)一有效免疫。另外疫苗接種主要依賴動物體反應(yīng)，免疫效果與結(jié)局依賴動物體反應(yīng)性。干預(yù)炎癥發(fā)生與發(fā)展，從發(fā)病角度防治雞大腸桿菌病有重要意義。

研究表明中藥可干預(yù)炎癥進程，對疾病轉(zhuǎn)歸具有積極作用?？鄥A能抑制PLA2活性，表現(xiàn)抗炎作用[11]?？鄥⑸n術(shù)口服液可抵抗炎性物質(zhì)刺激，減輕炎癥反應(yīng)[12]。黃芩苷可降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）活化和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)[13]。炎癥反應(yīng)一旦啟動，則無法逆轉(zhuǎn)，炎癥控制主要集中在預(yù)防性干預(yù)[14]。

綜上，本試驗以大腸桿菌感染造成宿主雞體內(nèi)發(fā)生SIRS，導(dǎo)致MODS作為雞大腸桿菌病發(fā)生發(fā)展的基本假設(shè)。通過連翹、小檗堿、蒼術(shù)以及苦參四種中藥提取物對雞大腸桿菌病模型實施預(yù)防性干預(yù)，檢驗雞大腸桿菌病炎癥假設(shè)，為雞大腸桿菌病防治提出新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物

連翹提取物（生藥比1 ? 10）、硫酸小檗堿（生藥比1 ? 10）、蒼術(shù)提取物（生藥比1 ? 20）、苦參提取物（生藥比1 ? 15），以上藥品均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理教研室提供。

藥液配制：取室溫下無菌蒸餾水中上述中藥提取物最大溶解度配制，濃度分別為連翹提取物50 mg·mL-1、硫酸小檗堿33 mg·mL-1、蒼術(shù)提取物40 mg·mL-1、苦參提取物50 mg·mL-1貯存藥液。4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗菌種

O2型雞源大腸桿菌：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供。為消除上述中藥提取物抑菌作用對試驗結(jié)果影響，試驗前對該株大腸桿菌開展體外抑菌試驗，表明其對上述中藥提取物不敏感，對該株大腸桿菌不存在體外抑菌作用。

菌液制備：將大腸桿菌菌株接種于MH液體培養(yǎng)基，37℃下?lián)u床孵育過夜。通過麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整菌液濃度半數(shù)致死量，并在15 min內(nèi)接種完畢。

1.1.3 試驗動物

1日齡雛雞：為AA商品雞，購自哈爾濱市先鋒種雞場。購入后隔離飼養(yǎng)15日，未見異常后分組試驗。

1.1.4 qRT-PCR引物

根據(jù)NCBI提供序列設(shè)計引物，qRT-PCR方法擴增5個雞基因NF-κB、TNF-α、IL-10、β-Actin。引物序列由深圳華大基因科技有限公司合成。引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物毒性試驗

以中藥提取物水溶液貯存液濃度為毒性試驗高劑量組，分別取高劑量組試驗濃度2/3、1/3倍濃度為中劑量組和低劑量組。取15日齡AA商品雞24只，隨機分為高、中、低劑量組與對照組，四個試驗組試驗藥物及相應(yīng)濃度情況見表2。

以中藥提取物水溶液供各組試驗雞自由飲水。連續(xù)給藥7日，觀察各劑量組試驗雞飲水量、飼料消耗量、生理狀況及精神表現(xiàn)等變化。以各觀察指標(biāo)無變化試驗組給藥濃度為試驗濃度C。

1.2.2 半數(shù)致死量測定

取O2型雞源大腸桿菌試驗菌株接種于MH液體培養(yǎng)基中，37℃150 r·min-1條件下過夜，MH液體培養(yǎng)基稀釋試驗菌株培養(yǎng)物，通過麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)制，獲得濃度為1×106、1×107、1×108和1×109cfu·mL-1半數(shù)致死量測定用菌液。

取15日齡AA商品雞50只，隨機分為五組，分別為A、B、C、D及對照組，取上述半數(shù)致死量測定用菌液與生理鹽水攻毒，測定O2型雞源大腸桿菌半數(shù)致死量，攻毒途徑為皮下注射，攻毒物及濃度見表3。

觀察記錄試驗雞發(fā)病癥狀、死亡數(shù)量，死亡雞只及時剖檢，在無菌條件下于死亡雞肝臟切面刮取樣品，無菌保存。鑒定分離菌株，驗證死亡雞確系攻毒O2型雞源大腸桿菌致死，建立雞大腸桿菌發(fā)病模型標(biāo)準(zhǔn)。

表1 實時熒光定量PCR引物所用序列Table 1Primer sequences of target gene for real-time PCR

表2 各試驗分組試驗藥物及相應(yīng)濃度（N=6）Table 2Experimental drugs and corresponding concentrations

表3 O2型雞源大腸桿菌半數(shù)致死量測定Table 3Median lethal dose determination of O2type avian Escherichia coli

鑒定方法：無菌采集發(fā)病雞全血樣品，接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃下過夜培養(yǎng)，挑取粉紅色、光滑、單個菌落接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37℃條件下過夜，若出現(xiàn)具有金屬光澤菌落則鑒定分離菌株為接種O2型雞大腸桿菌。試驗組中發(fā)病雞、死雞確系攻毒O2型雞源大腸桿菌所致。根據(jù)72 h內(nèi)試驗結(jié)果計算半數(shù)致死量。

1.2.3 預(yù)防試驗

將15日齡AA商品雞90只隨機分成3組，每組30只，即陽性對照組、空白對照組，中藥干預(yù)組，試驗分組設(shè)置見表4。

將中藥提取物水溶液代替飲水，通過自由飲水方式，對中藥干預(yù)組試驗雞連續(xù)給藥7日，空白對照組與陽性對照組正常飲水。第8日以O(shè)2型雞源大腸桿菌ID50經(jīng)皮下途徑對中藥干預(yù)組與陽性對照組試驗雞攻毒，空白對照組生理鹽水攻毒。攻毒后正常飼養(yǎng)，觀察并記錄72 h內(nèi)感染情況。

表4 中藥提取物預(yù)防試驗（N=30）Table 4Prevention trial of traditional Chinese medicine extract

于48 h后每試驗組取3只發(fā)病試驗雞，心臟采集全血樣本，并不計算在統(tǒng)計各試驗組結(jié)果內(nèi)。

1.2.4 炎癥相關(guān)因子基因鑒定以及表達(dá)水平檢測

1.2.4.1 樣品總RNA提取及質(zhì)量鑒定

提取全血總RNA，操作按照Trizol試劑操作說明書進行，自然條件下干燥，加DEPC溶解，紫外可見分光光度計測定RNA樣品在260和280 nm處光密度值（OD），鑒定RNA提取質(zhì)量。

1.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將提取的RNA定量為10 μg（20 μL），置于無菌EP管中，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明操作，EP管中加入引物2 μL，加DEPC-H2O至總體積22 μL，加dNTP 4 μL，70℃水浴5 min，取出后立即放在冰塊中，依次加入5×buffer 8 μL、DTT 4 μL、Rnase inhibitor 1 μL、M-MLV 1 μL，使反轉(zhuǎn)錄總體積為40 μL，充分混合后離心，37℃下水浴2 h。

1.2.4.3 PCR擴增目的基因

取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL置于0.5 mL無菌EP管中，依次加入相對應(yīng)上下游引物各0.3 μL、dNTP 1.5 μL、10×buffer 2.5 μL、rTaq酶0.3 μL，加滅菌雙蒸水補足至25 μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，所有基因60℃退火30 s，72℃延伸45 s，經(jīng)35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，鑒定引物特異性及炎癥相關(guān)因子存在情況。

1.2.4.4 qRT PCR檢測炎癥相關(guān)因子表達(dá)水平

取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.2 μL，加入相對應(yīng)上下游引物各0.6 μL，F(xiàn)astStart DNA Master SYBR Green I 10 μL，ddH2O 7.6 μL，組成20 μL反應(yīng)總體系。避光條件下，將反應(yīng)總體系加入實時熒光定量反應(yīng)板中。加樣過程注意避免污染，每加樣孔操作中均要更換移液器槍頭，樣品加入反應(yīng)孔底部，加完樣品封膜平整、密封，避免接觸加樣孔頂部，封膜完成后，離心使所有液體充分接觸混合，使泡沫破碎。

將實時熒光定量板放到LightCycler?96中，調(diào)整反應(yīng)條件，使熔解曲線呈單峰曲線。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸20 s，經(jīng)40個循環(huán)，72℃再延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.4.5 qRT-PCR結(jié)果數(shù)據(jù)分析

利用LightCycler?96 SW 1.1軟件，內(nèi)參基因β-Actin的Threshold Cycle（CT）值歸一目標(biāo)基因CT值，用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸-試驗樣本的ΔCT值，分別計算各組表達(dá)水平比率即表達(dá)水平比值：2-ΔΔCT值。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥提取物毒性試驗

通過飲水途徑給予各試驗組相應(yīng)試驗濃度四種中藥提取物混合物后，觀察各組試驗雞生理表現(xiàn)。結(jié)果顯示各組試驗雞飲水量、飼料消耗量、生理狀況及精神表現(xiàn)與對照組比較差異不顯著（P> 0.05），說明高、中、低三個試驗濃度的四種中藥提取物混合物對試驗雞均未造成影響，中藥提取物混合水溶液對15日齡AA商品雞未表現(xiàn)急性毒性。

為保證中藥提取物抗炎作用充分有效，結(jié)合毒性試驗結(jié)果，本試驗確定中藥提取物水溶液混合物試驗濃度為連翹提取物50 mg·mL-1、硫酸小檗堿提取物33 mg·mL-1、蒼術(shù)提取物40 mg·mL-1、苦參提取物50 mg·mL-1。給藥劑量為15日齡健康A(chǔ)A商品雞日常飲水量。

2.2試驗菌株半數(shù)致死量

用濃度依次為1×106、1×107、1×108和1×109cfu·mL-1四種菌液分別攻毒試驗，各攻毒試驗組雞只在攻毒2 h后出現(xiàn)精神萎靡、飲食廢絕、拖翅耷尾、縮頸扎堆等臨床癥狀，隨時間推進，癥狀愈發(fā)明顯，發(fā)病數(shù)量逐漸增加。剖檢發(fā)病雞只可見廣泛纖維素滲出性，脾臟、肝臟淤血、腫大，初步診斷為大腸桿菌感染所致。

表5 雞大腸桿菌O2型ID50測定（N=10）Table 5ID50determination of O2type avian Escherichia coli

攻毒8 h后，攻毒試驗組雞只出現(xiàn)死亡，且在隨后24 h內(nèi)A組（濃度為1×106cfu·mL-1）3只發(fā)病，1只死亡，B組（濃度為1×107cfu·mL-1）5只發(fā)病，4只死亡，C組（濃度為1×108cfu·mL-1）與D組（濃度為1×109cfu·mL-1）全部死亡。

通過麥康凱與伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基篩選，分離菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形，稍隆起的粉紅色菌落光滑濕潤，邊緣整齊。伊紅美藍(lán)平板上呈現(xiàn)帶有金屬光澤紫黑色菌落。說明該分離菌株為雞大腸桿菌，結(jié)合接種物與無菌采樣，確定致病原為O2型雞大腸桿菌。

試驗中O2型雞源大腸桿菌對試驗雞的半數(shù)致死量為每只0.5×106cfu·mL-1，以此作為試驗濃度。

2.3 發(fā)病模型建立結(jié)果

應(yīng)用0.5 mL濃度為1×106cfu·mL-1菌液作為雞大腸桿菌病人工建模接種物，試驗雞表現(xiàn)精神沉郁、飲食廢絕、耷尾拖翅、縮頸扎堆等雞大腸桿菌病的典型癥狀。剖檢死亡雞只，分離鑒定致病菌。肝臟細(xì)菌分離物經(jīng)鑒定與接種物相同。人工接種O2型雞源大腸桿菌建立發(fā)病模型成功。死亡雞表現(xiàn)出明顯心包炎、肝周炎等雞大腸桿菌病典型病理特征。

2.4 中藥提取物對雞大腸桿菌病預(yù)防作用

應(yīng)用四種中藥提取物水溶液混合物干預(yù)人工感染建立的雞大腸桿菌病模型試驗，統(tǒng)計分析各試驗組試驗雞發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)。

表6 中藥提取物對雞大腸桿菌病預(yù)防作用（N=30）Table 6Prevention of traditional Chinese medicine extract on the avian colibacillosis

SPSS軟件對各試驗組試驗雞發(fā)病率和死亡率χ2檢驗，結(jié)果表明中藥干預(yù)組發(fā)病數(shù)低于陽性對照組發(fā)病數(shù)，二組發(fā)病率之間存在統(tǒng)計學(xué)差異，差異顯著（P<0.05），說明試驗中四種中藥提取物水溶液混合物能夠降低雞群感染雞大腸桿菌后發(fā)病率，預(yù)防雞大腸桿菌病。但是中藥干預(yù)組與陽性對照組兩組病死率之間不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P> 0.05），說明雞大腸桿菌病一旦發(fā)生，四種中藥提取物水溶液混合物無法扭轉(zhuǎn)其轉(zhuǎn)歸。

2.5 炎癥相關(guān)因子基因鑒定

鑒定結(jié)果表明引物設(shè)計成功，為qRT-PCR做好試驗準(zhǔn)備。

圖1 炎癥因子基因鑒定Fig.1Aim gene of inflammatory factor

2.6 炎因子水平檢測結(jié)果

2.6.1 外周血中TNF-α mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果

外周血中TNF-α mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果見圖2。

圖2 TNF-α mRNA表達(dá)水平Fig.2Expression of TNF-α mRNA

結(jié)果顯示在感染O2型雞大腸桿菌后，陽性對照組TNF-α相對于空白對照組表達(dá)水平顯著升高，二者差異極顯著（P<0.01）。在中藥提取物混合水溶液干預(yù)下，中藥干預(yù)組TNF-α表達(dá)水平低于陽性對照組，二者差異顯著（P<0.05），中藥干預(yù)組TNF-α表達(dá)水平高于空白對照組，二者差異極顯著（P<0.01）。

2.6.2 外周血中NF-κb mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果

外周血中NF-κb mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果見圖3。

圖3 NF-κb mRNA表達(dá)水平Fig.3Expression of NF-κb mRNA

結(jié)果顯示在感染O2型雞大腸桿菌后，陽性對照組NF-κb相對于空白對照組表達(dá)水平顯著升高，二者差異極顯著（P<0.01）。在中藥提取物混合水溶液干預(yù)下，中藥干預(yù)組NF-κb表達(dá)水平低于陽性對照組，二者差異顯著（P<0.05），中藥干預(yù)組NF-κb表達(dá)水平高于空白對照組，二者差異極顯著（P<0.01）。

2.6.3 外周血中IL-10 mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果

外周血中IL-10mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果見圖4。

圖4 IL-10 mRNA表達(dá)水平Fig.4Expression of IL-10 mRNA

結(jié)果顯示在感染O2型雞大腸桿菌后，陽性對照組IL-10相對于空白對照組表達(dá)水平顯著升高，二者差異極顯著（P<0.01）。在中藥提取物混合水溶液干預(yù)下，中藥干預(yù)組IL-10表達(dá)水平低于陽性對照組，二者差異顯著（P<0.05），中藥干預(yù)組IL-10表達(dá)水平高于空白對照組，二者差異極顯著（P< 0.01）。

3 討論與結(jié)論

3.1 影響雞大腸桿菌病模型建立因素

雞大腸桿菌病模型建立受多種因素影響。宿主雞生理狀態(tài)直接影響雞大腸桿菌病發(fā)生，處于混合感染狀態(tài)下宿主雞發(fā)病更早、更重、恢復(fù)更慢[15]。菌毛是大腸桿菌重要毒力因子，與大腸桿菌定植有關(guān)，影響大腸桿菌致病力和雞大腸桿菌病模型建立[16]。蔡玉梅、李國喜、王麗平等研究表明108cfu·mL-1是常見攻毒劑量級[17-19]。在感染途徑方面，胸肌注射致病性最強，其次是皮下注射。肌肉注射更利于大腸桿菌進入血液循環(huán)系統(tǒng)增殖引發(fā)疾病[20]。在宿主雞的感染年齡方面，國內(nèi)研究者常用1～28日齡雞，較少用35周齡以上；國外研究以1日齡居多，2～3周齡次之[21]。

本試驗中O2型雞源大腸桿菌菌株為強毒株，接種量為0.5×106cfu·只-1，試驗雞群為15日齡健康A(chǔ)A商品雞，皮下注射接種途徑成功建模。

3.2 雞大腸桿菌病模型干預(yù)

中藥提取物混合水溶液在試驗前期體外抑菌試驗中對O2雞大腸桿菌株無明顯抑制作用，但可降低雞大腸桿菌感染雞發(fā)病率，表明該中藥提取物混合水溶液對雞大腸桿菌病保護存在抑菌外機制。

本研究認(rèn)為雞大腸桿菌病病理本質(zhì)是大腸桿菌感染導(dǎo)致全身廣泛性炎癥，炎癥發(fā)生發(fā)展過程與感染雞發(fā)病表現(xiàn)密切相關(guān)。

在發(fā)病率方面，感染O2型雞大腸桿菌2 h后，試驗雞群出現(xiàn)臨床癥狀。陽性對照組發(fā)病率與空白對照組差異極顯著（P<0.01）。中藥干預(yù)組中，試驗雞也出現(xiàn)大腸桿菌病臨床癥狀，發(fā)病率大于空白對照組，差異極顯著（P<0.01），但與陽性對照組相比，中藥干預(yù)組發(fā)病率不足前者50%，差異顯著（P<0.05）。O2型雞源大腸桿菌能引起試驗雞群爆發(fā)雞大腸桿菌病，但是中藥干預(yù)組試驗雞群在中藥提取物混合水溶液作用下，發(fā)病率明顯降低，中藥提取物混合水溶液具有一定抑制炎癥爆發(fā)作用。

在病死率方面，試驗雞群首例死亡出現(xiàn)在陽性對照組感染O2型雞大腸桿菌8 h后，72 h后統(tǒng)計各試驗組病死率結(jié)果表明：陽性對照組病死率對比空白對照組差異極顯著（P<0.01）。而陽性對照組與中藥干預(yù)組病死率無顯著差異。說明中藥提取物混合水溶液對于已暴發(fā)炎癥無扭轉(zhuǎn)及抑制作用，與威廉·B·科爾曼提出“一旦炎癥爆發(fā)，便無法扭轉(zhuǎn)”論述[14]基本一致。

于攻毒24 h后采集各組發(fā)病雞外周血，通過qRT-PCR方法檢測三種炎癥相關(guān)因子表達(dá)水平。結(jié)果表明陽性對照組外周血樣本中炎癥因子NF-κb、TNF-α與IL-10表達(dá)水平明顯升高，與空白對照組比較差異極顯著（P<0.01），說明在雞大腸桿菌作用下，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κb表達(dá)水平增加，細(xì)胞開始轉(zhuǎn)錄各種炎癥因子與活性分子，炎癥反應(yīng)啟動。作為NF-κb下游的炎癥因子TNF-α表達(dá)水平增加，產(chǎn)生各種促炎效應(yīng)，協(xié)同其他炎癥因子促使發(fā)病雞表現(xiàn)典型雞大腸桿菌病癥狀。同時抑炎效應(yīng)的炎癥因子IL-10在炎癥啟動后表達(dá)水平升高，差異極顯著（P<0.01），說明在促炎反應(yīng)啟動同時，抑炎反應(yīng)啟動，對抗促炎過程，防止過度炎癥對機體造成損傷。中藥提取物混合水溶液干預(yù)下，中藥干預(yù)組中炎癥因子NF-κb、TNF-α mRNA表達(dá)水平升高，明顯高于空白對照組，差異顯著（P<0.05），但低于陽性對照組，差異顯著（P< 0.05），說明中藥提取物混合水溶液能夠降低促炎因子mRNA表達(dá)水平。相反，中藥干預(yù)組IL-10 mRNA表達(dá)水平大幅上升，比較陽性對照組，差異顯著（P<0.05），說明中藥提取物混合物一方面通過降低炎癥因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，抑制炎癥發(fā)生，另一方面啟動抗炎因子高量表達(dá)，提高抗炎效應(yīng)，降低機體炎癥損傷作用。

比較臨床發(fā)病率、病死率與炎癥因子基因表達(dá)水平后可知，中藥提取物混合水溶液能夠通過干預(yù)炎癥因子基因表達(dá)，降低促炎因子基因表達(dá)水平，提高抗炎因子基因表達(dá)水平，降低雞大腸桿菌病發(fā)病率。但是炎癥一旦發(fā)生后，中藥提取物混合水溶液無法阻止促炎作用、逆轉(zhuǎn)炎癥損傷，最終各組發(fā)病雞病死率差異不顯著。

試驗結(jié)果表明，雞大腸桿菌病發(fā)病機制在于全身廣泛性炎癥，其發(fā)生發(fā)展決定于全身性炎癥蔓延程度，降低機體炎癥水平能夠預(yù)防雞大腸桿菌病發(fā)生與惡化。同時試驗中中藥提取物混合水溶液雖無抑菌效果，卻可通過干預(yù)炎癥程度，抑制雞大腸桿菌病發(fā)生，但是無法逆轉(zhuǎn)已經(jīng)爆發(fā)的炎癥反應(yīng)，最終對病死率無明顯影響。

3.3 炎癥因子與炎癥

本試驗從SIRS與MODS發(fā)病機理探究雞大腸桿菌病發(fā)病本質(zhì)。在各種致病因素作用下，機體免疫系統(tǒng)發(fā)生以活化免疫細(xì)胞、表達(dá)炎癥相關(guān)受體、釋放大量致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的免疫防御活動，上述表現(xiàn)相互作用形成網(wǎng)絡(luò)式級聯(lián)放大效應(yīng)，破壞促炎/抗炎平衡，過度炎性介質(zhì)損害血管內(nèi)皮及微環(huán)境，造成機體相應(yīng)器官或全身損害，臨床上呈現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），由于眾多炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子多向協(xié)同或拮抗效應(yīng)，造成對其認(rèn)識過程和手段的復(fù)雜化，至今尚無阻斷這種炎癥級聯(lián)反應(yīng)的有效措施[22]。干預(yù)炎癥信號的細(xì)胞內(nèi)傳遞是人為控制炎癥級聯(lián)反應(yīng)重要途徑。

大腸桿菌啟動機體炎癥級聯(lián)反應(yīng)后，存在于機體各種細(xì)胞內(nèi)NF-κB作為多種促炎細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，黏附分子和急性期反應(yīng)蛋白高表達(dá)所必需轉(zhuǎn)錄因子，在急性炎癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。下調(diào)TNF-α水平，上調(diào)IL-10水平可以減輕組織器官炎癥反應(yīng)病理損害，避免全身炎癥反應(yīng)綜合征進一步向MODS發(fā)展[23]。

不同疾病炎癥因子體系間級聯(lián)反應(yīng)復(fù)雜，炎癥因子種類及其相應(yīng)水平各異，尤其在動物疾病領(lǐng)域幾乎沒有炎癥指標(biāo)體系，無法確定雞大腸桿菌病SIRS病理過程中關(guān)鍵炎性因子樞紐，藥物干預(yù)寬泛，無法靶向干預(yù)。本試驗從動物機體自身的穩(wěn)定調(diào)解入手研究動物疾病問題，對中藥預(yù)混，提高機體應(yīng)激時的穩(wěn)態(tài)保持能力具有現(xiàn)實意義。

[1]崔恒敏,朱貴水,程安春,等.家養(yǎng)林麝大腸桿菌病的病理學(xué)觀察[J].中國獸醫(yī)科技,1996(9):34-35.

[2]凌育燊,郭予強,楊連楷,等.雞大腸桿菌病的病理學(xué)觀察[J].養(yǎng)禽與禽病防治,1986(2):24-25.

[3]Cheville N F.Coll Pathology and Ed[M].California:The Iowa staten University Press,2006.

[4]徐福南,方明生,候世忠,等.雞大腸桿菌病的病理學(xué)研究[J].中國獸醫(yī)科技,1994(4):7-9.

[5]Schumann R R,Hermannf.The macrophages,a tissue specific defense cell:Origin,tissue distribution and secretory response[J]. Focus Growth Factors,1994,3:1.

[6]Cai B,Deitch E A,et al.Novel insights for systemic inflammation in sepsis and hemorrhage[J].Mediators Inflamm,2010:642462.

[7]Abraham E,Matthay M A.Consensus conference definitions for sepsis,septic shock,acute lung injury,and acute respiratory distress syndrome:time for a reevaluation[J].Crit Care Med,2000, 28:232-235.

[8]蔣月,盛鵬飛.遼寧錦州地區(qū)三種家禽大腸桿菌耐藥性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(2):59-63.

[9]劉云,盧婷,張力國,等.牛源性E.coli O157 ? H7分離鑒定、耐藥性及耐藥基因分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(11):83-88.

[10]揭盛華.內(nèi)毒素休克的特異性阻斷治療進展[J].國外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊,1994,11(3):183-185.

[11]邱耕,涂植光,李曉文.苦參堿對內(nèi)毒素致炎大鼠PLA-2活性影響及其抗炎機制研究[J].中草藥,2002(7):57-59.

[12]高艷艷,張志偉,康慧.苦參蒼術(shù)口服液的抗炎與止瀉作用研究[J].中國獸藥雜志,2013,47(4):26-28.

[13]李明,陳偉強,李巖,等.黃芩苷對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和炎癥因子表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2009,9(22):4219.

[14]威廉·B·科爾曼.分子病理學(xué):疾病的分子基礎(chǔ)[M].北京:科學(xué)出版社,2012:49.

[15]石火英.試驗性雞大腸桿菌病試驗雞細(xì)菌的動態(tài)分布[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2001,23(5):364-366.

[16]Ramirez R M,Almanza Y,Garcia S,et al.Adherence and invasion of avian pathogenic Escherichia coli to avain tracheal epithelial cells[J].World Journal of Microbiology and Botechnology,2009,25(6):1019-1023.

[17]蔡玉梅,尹遜河,柴同杰,等.人工感染雞大腸桿菌病的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2006,28(3):356-358.

[18]李國喜,趙銀麗.中藥金銀花對人工感染雞大腸桿菌病的療效試驗[J].安微農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(20):5259-5261.

[19]王麗平,江善祥,史曉麗.舒安林對雞大腸桿菌病藥效試驗[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2002(4):13-15.

[20]周秀紅,祁克宗,張麗霞,等.不同接種途徑對人工誘發(fā)雞大腸桿菌病的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,32(4):463-466.

[21]賀常亮.治療雞大腸桿菌的中藥方劑篩選及其作用機理研究[D].長春:吉林大學(xué),2011.

[22]盧家凱.MAPK與內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)系[J].國外醫(yī)學(xué).麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊,2000(2):65-67.

[23]孫來芳,潘利偉.烏司他丁影響嚴(yán)重膿毒癥大鼠IL-10、TNF-α、IL-1β水平的研究[J].臨床外科雜志,2005(12):770-772.

Preventive intervention and mechanism of traditional Chinese medicine in avianEscherichia colibacillosis

ZHANG Hanyuan1,ZHANG Xiuying1,SHI Luyi2

(1.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Wildlife Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150081,China)

This experiment intervented the establishment of the model of the aviancolibacillosis preventively by the mixture of saturated aqueous solution of the four kinds of traditional Chinese medicine extracts above as well as detecting the level of expression of inflammatory factor mRNA.There were obvious preventive intervention on the process of the aviancolibacillosisin the mixture of saturated aqueous solution of the four kinds of traditional Chinese medicine extracts(P<0.05);The expression level of the NF-κb and TNF-αmRNA of the intervention group was significantly lower than that of the positive control group in the model of the avian colibacillosis(P<0.05),but it was higher than the blank control group(P<0.05);Compared with the positive control group,the expression levels of the IL-10 mRNA in intervention group increased(P<0.05).There was preventive effect on the aviancolibacillosisin the mixture of saturated aqueous solution of the four kinds of traditional Chinese medicine extracts.The mechanism of prevention may be the intervention of the inflammatory process.

traditional Chinese medicine(TCM);E.colibacillosis;anti-inflammatory;bacteriostatic action

S859.7；S854.5+2

A

1005-9369（2016）05-0054-08

2016-03-23

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金（2013RFXXJ035）

張瀚元（1983-），男，博士研究生，研究方向為獸醫(yī)藥理毒理學(xué)。E-mail:164296076@qq.com

*通訊作者：張秀英，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為獸醫(yī)藥理毒理學(xué)。E-mail:zhangxiuying@neau.edu.cn

時間2016-5-27 14:15:04[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160527.1415.016.html