Prdx1通過P38MAPK通路影響肺癌VM的形成*

魏威朱東望孫保存趙秀蘭張艷輝董學(xué)易劉芳張丹芳趙楠

·基礎(chǔ)研究·

Prdx1通過P38MAPK通路影響肺癌VM的形成*

魏威①朱東望②孫保存①③趙秀蘭①張艷輝③董學(xué)易①劉芳①張丹芳①趙楠①

目的：檢測Prdx1在肺癌中的表達，探討Prdx1對肺癌血管生成擬態(tài)（vasculoenic mimicry，VM）形成的影響，并深入研究其影響機制。方法：利用CD31/PAS雙重染色及免疫組織化學(xué)法檢測并分析VM及Prdx1的表達關(guān)系。將Prdx1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299中，誘導(dǎo)Prdx1外源性升降表達。Western blot檢測轉(zhuǎn)染前、后Prdx1、EMT相關(guān)蛋白（E-cadherin、Vimentin）、VM相關(guān)蛋白（VE-cadherin、VEGF）、P38MAPK通路相關(guān)蛋白（P38、P-P38）表達變化情況；A549-Prdx1細(xì)胞系加入P38MAPK通路的抑制劑SB203580后，檢測（P38，P-P38、VEGF）的表達變化情況；三維，劃痕和侵襲實驗檢測Prdx1對細(xì)胞成管、遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果：Prdx1與患者VM的形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后密切相關(guān)。Prdx1升表達高E-cadherin表達下調(diào)，Vimentin表達上調(diào)，VE-cadherin、VEGF表達上調(diào)，P38MAPK中P38表達不變，P-P38表達上調(diào)。細(xì)胞的遷移侵襲成管能力顯著增強。Prdx1低表達后與上述結(jié)果相反。A549-Prdx1細(xì)胞系中加入P38MAPK通路抑制劑SB203580后，VEGF高P-P38隨劑量的增加而降低，而P38總蛋白不變。結(jié)論：Prdx1在肺癌中高表達，可能通過P38MAPK通路影響患者VM的形成。

肺癌 Prdx1 VM P38MAPK 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種存在于惡性腫瘤中的血液供應(yīng)方式。Maniotis等［1］研究葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤細(xì)胞通過自身變形，形成可輸送血液的管道結(jié)構(gòu)-VM，其存在與疾病的進展和預(yù)后密切相關(guān)［2-3］。

P38MAPK信號通路在生物信息活動中發(fā)揮重要作用。去甲腎上腺素可以通過激活P38MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進胰腺癌細(xì)胞的增殖［4］。抑制P38轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號的活性，能夠抑制乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，而P38轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，使細(xì)胞更具浸潤性，促進乳腺癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［5］。Prdx1是抗氧化蛋白超家族中的一員，廣泛存在于原核生物和真核生物中，在腫瘤中高表達促進腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移［6］，Taniuchi等［7］報道了Prdx1在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達，通過調(diào)控P38MAPK信號通路的活性，與磷酸化的P-P38相互作用影響胰腺癌細(xì)胞的侵襲。研究發(fā)現(xiàn)Prdx1在肺癌中高表達［8］，但在肺癌中Prdx1是否可以通過P38MAPK通路影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移并且影響VM形成的研究尚少。本研究旨在探討肺癌組織中Prdx1影響VM形成的可能分子機制為肺癌的診斷、治療提供新的思路和有效途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本選取天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院1990年10月至2010年11月經(jīng)手術(shù)切除病理診斷為肺癌并且隨訪資料完整的患者標(biāo)本101例。

1.1.2細(xì)胞株人肺癌細(xì)胞A549，H1299為天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實驗室自存。

1.1.3實驗試劑RPMI 1640購自美國Neuronbc公司，胎牛血清購自中國Thermo公司。Prdx1表達質(zhì)粒購自美國GeneCopoeia公司（catalog no.HSH065845-LVRU6GP）。慢病毒包裝試劑盒購自美國GeneCo?poeia公司（catalog no.HPK-LvTR-20）。Transwell小室購自美國FALCON公司。兔抗人多克隆抗體Prdx1、兔抗人單克隆抗體E-cadherin兔抗人多克隆抗體Vimentin兔抗人多克隆抗體VE-cadherin均購自美國Abcam公司。兔抗人多克隆抗體P38、P-P38均購自美國Cell Signaling Tecenology公司，P38MAPK抑制劑SB203580購自美國Selleck公司。兔抗人多克隆抗體β-actin、VEGF、PV6000通用二步法免疫組化試劑盒、山羊抗兔IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色肺癌組織石蠟包塊4 μm連續(xù)切片常規(guī)脫蠟水化；3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶；微波熱修復(fù)；正常血清室溫封閉，一抗4℃過夜，次日孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，封片。PBS代替一抗作為陰性對照。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：用染色強度和陽性細(xì)胞百分比積分來評價。染色強度：0為陰性；1為淺黃色；2為深黃色；3為棕黃色。陽性細(xì)胞百分率：每例標(biāo)本選擇10個含有陽性細(xì)胞的高倍視野（×400）分別計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，取其平均值，計算陽性細(xì)胞百分率：0為無陽性細(xì)胞；1為陽性細(xì)胞≤25%；2為陽性細(xì)胞≤50%；3為陽性細(xì)胞＞50%。染色指數(shù)為陽性細(xì)胞百分率和染色強度之和，最小值為0，最大值為6。染色指數(shù)＞4定為免疫組織化學(xué)染色陽性；染色指數(shù)≤4定為陰性。

1.2.2CD31/PAS雙染免疫組織化學(xué)染色后將切片置于0.5%過碘酸溶液中常溫孵育10 min，蒸餾水浸洗5遍，滴加Schiff試劑，37℃孵育15～30 min。流水沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，封片。CD31陽性為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜著色，呈棕黃色。PAS為膠原著色，呈櫻桃紅色。VM由經(jīng)過塑形的腫瘤細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞圍成，無CD31著色，但內(nèi)襯PAS陽性環(huán)，管腔內(nèi)可見血紅細(xì)胞存在。

1.2.3細(xì)胞系和培養(yǎng)條件A549、H1299肺癌細(xì)胞系在含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，放入37℃、5%CO2恒濕孵化箱中孵育，待細(xì)胞融合約90%時，傳代以保持細(xì)胞的活力。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%匯合時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為無血清、無抗生素的新鮮培養(yǎng)液。以1:2比例混勻病毒液和不完全培養(yǎng)基，24 h后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后進行轉(zhuǎn)染效果評價并加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達Prdx1的細(xì)胞株。

1.2.5細(xì)胞劃痕實驗將細(xì)胞接種于6孔板，于37℃孵箱中培養(yǎng)；待培養(yǎng)細(xì)胞生長至80%時，用100 μL移液槍頭在細(xì)胞表面劃痕，并在倒置顯微鏡下觀察，拍照記錄劃痕間初始距離（0 h）；在24、48，72 h后，拍照記錄劃痕間的距離，計算細(xì)胞的相對遷移率；實驗重復(fù)3次。

1.2.6細(xì)胞侵襲實驗將Transwell小室包被Matirgel膠并在培養(yǎng)箱中過夜，次日消化細(xì)胞并用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞懸液接種于上室，下室用完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取Transwell小室，PBS洗3遍，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，分析穿透能力。

1.2.7三維成管實驗將96孔板包被Matirgel膠并在培養(yǎng)箱中過夜，次日消化細(xì)胞并以合適的密度接種于96孔板重懸，于37℃孵箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察成管能力，并拍照記錄。

1.2.8Western blot法檢測用細(xì)胞裂解液RI?PA-SDS裂解細(xì)胞，提取其總蛋白，在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。PVDF膜轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉室溫1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，次日恢復(fù)室溫孵育相應(yīng)二抗2 h，TBST漂洗，加入發(fā)光液顯影、定影、照像。1.2.9加入P38MAPK通路抑制劑SB203580懸浮細(xì)胞貼壁后，饑餓12 h，加入SB203580抑制劑，濃度分別為0、5、10、15、20 μM，48 h候提取蛋白，Western blot檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。采用Kaplan-Mei?er方法進行生存分析，生存率比較采用Log rank檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Prdx1的表達及與VM、肺癌患者臨床病理資料的關(guān)系

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Prdx1陽性表達產(chǎn)物呈棕黃色，主要定位于肺癌細(xì)胞漿（圖1）。CD31/PAS雙染結(jié)果顯示，內(nèi)皮依賴性血管是由CD31陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞圍成，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，VM是由腫瘤細(xì)胞圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，管腔周圍無出血壞死及炎細(xì)胞浸潤且內(nèi)襯PAS陽性環(huán)（圖2）。在101例肺癌標(biāo)本中，Prdx1陽性表達64.36%（65/101）。分析Prdx1的表達與肺癌患者臨床病理資料的關(guān)系顯示，Prdx1在VM陽性患者中表達高于VM陰性患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.250，P=0.007）。Prdx1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.870，P＜0.001）。而Prdx1在不同性別、腫瘤大小、臨床分期中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1），生存分析結(jié)果顯示，Prdx1陽性組較Prdx1陰性組的生存時間短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.037）。

圖1 Prdx1在肺癌組織中定位于細(xì)胞漿的陽性表達及Prdx1在肺癌組織中的陰性表達（IHC×400）Figure 1Representative Prdx1-positive lung cancer samples illustrating that staining mainly localized in the cytoplasm and Prdx1-negative lung cancer samples exhibiting almost no appreciable staining(IHC×400)

圖2 人肺癌組織中存在VM及內(nèi)皮血管Figure 2VM and endothelial-dependent vessel in lung cancer tissues

表1 Prdx1與肺癌臨床病理資料的關(guān)系Table 1Correlation between Prdx1 with VM and clinicopathologic data of lung cancer patients

2.2A549、H1299細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Prdx1后細(xì)胞遷移、侵襲、細(xì)胞成管能力的變化

實驗結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞遷移、侵襲、細(xì)胞成管能力顯著改變，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Prdx1可以影響細(xì)胞的遷移、侵襲、細(xì)胞成管能力。

2.3A549、H1299細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Prdx1表達質(zhì)粒后Prdx1、E-cadherin、Vimentin、VE-cadherin、VEGF、P38、P-P38的表達變化

利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前、后A549、H1299細(xì)胞中Prdx1、E-cadherin、Vimentin、VE-cadherin、VEGF、P38、P-P38的表達變化情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Prdx1后，A549-Prdx1細(xì)胞Prdx1表達明顯升高，H1299-shPrdx1細(xì)胞Prdx1表達明顯降低，提示轉(zhuǎn)染成功。高表達Prdx1后可以使A549細(xì)胞系E-cadherin表達下調(diào)，Vimentin上調(diào)，VE-cadherin、VEGF、P-P38的表達上調(diào)，P38表達不變。低表達Prdx1后，在H1299細(xì)胞系中上述指標(biāo)與之相反（圖3A）。結(jié)果說明Prdx1可能通過調(diào)控低E-cadherin的表達參與EMT促進肺癌的轉(zhuǎn)移，可能通過調(diào)控VE-cadherin、VEGF的表達影響VM的形成，P-P38表達水平的改變說明P38MAPK可能參與了肺癌VM的形成。

2.4A549-Prdx1細(xì)胞系加入P38MAPK抑制劑SB203580檢測P38、P-P38、VEGF的表達變化

利用Western blot檢測P38、P-P38、VEGF的表達情況，結(jié)果顯示加入SB203580抑制劑后，P38總蛋白保持不變，P-P38、VEGF隨劑量的增高而降低（圖3B）。結(jié)果說明P38MAPK通路可以調(diào)控VEGF的變化。

圖3 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達變化Figure 3Changes in related protein expression detected by Western blot

3 討論

全球肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升態(tài)勢，尤其在中國等經(jīng)濟發(fā)展中國家，肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一［9-10］，大多數(shù)患者在就診時已經(jīng)處于中晚期或者轉(zhuǎn)移狀態(tài)，患者生存質(zhì)量較低［11］，因此深入研究肺癌患者的侵襲、轉(zhuǎn)移機制至關(guān)重要。VM是高侵襲性腫瘤為了滿足自身的血液供應(yīng)，癌細(xì)胞通過自身變形和細(xì)胞外基質(zhì)重塑而圍成的一種類血管樣的管道，是一種不依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種腫瘤微循環(huán)模式，并與宿主血管相連，獲取血供，從而使腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。

Prdx1屬于抗氧化蛋白超家族中的一員［12］，在氧化應(yīng)激條件下在一些惡性腫瘤細(xì)胞中高表達，除了抗氧化功能之外，其與腫瘤的增殖分化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13］，在實體腫瘤中高表達，如乳腺癌［14］、膽管癌［15］、舌鱗癌［16］等。有關(guān)Prdx1在肺癌中影響腫瘤VM形成的研究較為少見。P38MAPK通路是細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)中一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞各個病理生理過程中均發(fā)揮作用［17］，P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過影響VEGF的表達而在腫瘤血管新生、侵襲和轉(zhuǎn)移方面起重要的調(diào)控作用［18］。目前已有研究證明Prdx1可以調(diào)控P38MAPK通路影響腫瘤的生物活動。Turner-Ivey等［19］發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤中，Prdx1能夠促進MKP-5活化、抑制p38MAPKα，從而減少腫瘤細(xì)胞的凋亡。Du等［20］證明了Prdx1能夠與ASK1相互作用，抑制ASK1的活性，進而抑制ASK1介導(dǎo)的JNK、P38MAPK信號通路，減少腫瘤細(xì)胞凋亡。有文獻報道了Prdx1在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達，且與磷酸化的P-P38相互作用，并發(fā)現(xiàn)Prdx1可以導(dǎo)致膜波動和突起的改變，從而影響胰腺癌細(xì)胞的侵襲［7］，本研究推測Prdx1可能通過P38MAPK通路影響VM的形成。

本實驗用CD31/PAS雙染和免疫組織化學(xué)方法檢測并分析肺癌組織中VM與Prdx1的關(guān)系，分析Prdx1與臨床病理資料的關(guān)系。結(jié)果顯示Prdx1在肺癌中高表達，并與VM、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后密切相關(guān)，提示Prdx1可能與肺癌的高侵襲能力有關(guān)。功能實驗驗證了上調(diào)組細(xì)胞系與對照組相比其遷移、侵襲、VM管狀結(jié)構(gòu)形成能力明顯增強。在此基礎(chǔ)上，將Prdx1外源性轉(zhuǎn)入肺癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比A549-Prdx1細(xì)胞系中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達明顯降低，間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin升高，說明Prdx1可以導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附連接和緊密連接破壞，促使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲。VE-cadherin和VEGF是VM的重要標(biāo)志物，VE-cadherin是一種表達于內(nèi)皮細(xì)胞之間的跨膜性黏附蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間互相黏附；VEGF與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)，是與腫瘤血管生成密切相關(guān)的因子，過表達Prdx1可以使VE-cadherin和VEGF表達增高；而P38MAPK通路中PP38表達升高，P38總蛋白的表達不變，提示Prdx1可能通過影響下游磷酸化水平調(diào)控P38MAPK信號通路。而在下調(diào)組中，上述結(jié)果與之相反。在加入P38MAPK通路的抑制劑SB203580后，P-P38表達隨劑量增高而降低，與VEGF表達呈現(xiàn)正相關(guān)，而P38表達不變，驗證了P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過影響VEGF的表達而在VM形成中的作用。以上實驗說明Prdx1可以促進腫瘤細(xì)胞在體外的遷移、侵襲、VM管狀結(jié)構(gòu)形成能力，進而影響細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，通過P38MAPK通路可能影響VM的形成。

本研究在體內(nèi)和體外兩個水平上驗證了Prdx1對肺癌VM形成的影響，也間接表明了P38MAPK信號通路在肺癌VM形成中的作用。研究肺癌中VM形成的可能分子機制，找到并抑制能促進VM形成的信號分子，為肺癌的診斷、治療提供了新的思路和有效途徑。但是Prdx1在肺癌中促進腫瘤轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機制很復(fù)雜，P38MAPK通路可能只是其中的某一個環(huán)節(jié)，因此Prdx1在肺癌VM形成過程中的其他作用機制，還需要進一步探討。

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（2016-08-12收稿）

（2016-10-18修回）

Prdx1 promotes vasculogenic mimicry formation of lung cancer via P38MAPK signaling

Wei WEI1,Dongwang ZHU2,Baocun SUN1,3,Xiulan ZHAO1,Yanhui ZHANG3,Xueyi DONG1,Fang LIU1,Danfang ZHANG1,Nan ZHAO1Correspondence to:Baocun SUN;E-mail:baocunsun@aliyun.com

1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2Department of Oral and Maxillofacial Surgery of the Stomatological Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;3Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China

This study was supported by the Key Project of the National Natural Science Foundation of China(Nos.81230050 and 81572872)

Objective:To analyze the effect of Prdx1 on lung cancer by investigating its expression and role in vasculogenic mimicry (VM)formation.Methods:The relationship between VM existence and Prdx1 expression was detected and analyzed by CD31/PAS dual staining and immunohistochemical staining.A549 and H1299 cells were transfected with Prdx1-expressing plasmids to induce exogenous Prdx1 protein expression.Changes in the expression levels of Prdx1,EMT-related proteins(E-cadherin and Vimentin),VM-related proteins(VE-cadherin and VEGF),and P38MAPK signaling-related proteins(P38 and P-P38)were detected by Western blot after transfection.Furthermore,changes in the expression levels of P38MAPK signaling-related proteins(P38 and P-P38)and VM-related protein (VEGF)in A549-Prdx1 cells were detected by Western blot after using SB203580.The effects of Prdx1 gene transfection on migration capacity were determined by an in vitro wound-healing assay,whereas the role of Prdx1 transfection in invasive potential was determined by an invasion assay.The role of Prdx1 transfection on tube structure formation potential was determined by three-dimensional culture.Results:Immunohistochemistry staining showed that Prdx1 expression was positively associated with VM,metastasis,and poor prognosis.Western blot showed that after Prdx1 was increased,E-cadherin expression was downregulated,whereas Vimentin, VE-cadherin,VEGF,and P-P38 expression levels were upregulated in A549 cells.Moreover,P38 expression was unchanged.Wound healing,invasion,and three-dimensional culture assays showed that the migration,invasion,and tube structure formation potentials of A549 cells significantly increased,whereas suppressing Prdx1 in H1299 cells yielded the opposite results.After adding the P38MAPK pathway inhibitor,VEGF and P-P38 expression levels decreased as inhibitor dosage increased,whereas P38 expression remained the same.Conclusion:Prdx1,which is highly expressed in lung cancer specimens,was closely associated with VM.This association may promote VM formation via P38MAPK signaling.

lung cancer,Prdx1,VM,P38MAPK,EMT

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.22.947

①天津醫(yī)科大學(xué)病理教研室（天津市300070）；②天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科；③天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科

*本文課題受國家自然科學(xué)基金重點項目（編號：81230050）和國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81572872）資助

孫保存baocunsun@aliyun.com

魏威專業(yè)方向為腫瘤病理學(xué)。

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